ChIP-エキソ方法：近く塩基対の精度でタンパク質 - DNA相互作用を同定します

この機能ゲノム技術の全体的な目標は、特定のタンパク質が生細胞内で占める正確なゲノム位置を特定することです。この方法は、クロマチンの文脈で転写機構がどのように組み立てられ、作動するかなど、遺伝子調節とエピジェネティクスの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、タンパク質DNA相互作用の正確なゲノム位置を、非常に低いバックグラウンドで塩基近傍の事前分解能で明らかにすることです。

一般に、この方法に不慣れな個人は、プロトコルが複雑で、全体を通して細部に注意を払う必要があるため、苦労します。核溶解物を超音波処理するには、核抽出物を含む15ミリリットルのポリスチレンチューブに樹脂アダプターを配置することから始めます。氷冷水浴で中出力で30秒間オンと30秒間オフで、合計2回の15分間のセッションでライセートを超音波処理します。

超音波処理の結果を確認するには、各チューブから2つの10マイクロリットルサンプルを1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、最初の10マイクロリットルのサンプルを10マイクロリットルのTE-RNase Aおよび0.2マイクロリットルのプロテイナーゼKと組み合わせて逆架橋します。次に、4マイクロリットルの6XキシレンDNA色素を加えます。

2番目の10マイクロリットルのサンプルに、2マイクロリットルの6XキシレンDNA色素を添加して架橋を保存します。両方のサンプルを1.5%アガロースゲルで140ボルトで約30〜45分間分析し、後者のブロモフェノール色素がゲルの4分の3下に到達するまで分析します。超音波処理が成功した場合は、超音波処理したライセートを150マイクロリットルの10%Triton X-100を含む2ミリリットルのチューブに移し、ボルテックスで混合します。

超音波処理されたライセートを摂氏4度で20,000倍gで10分間回転させることにより、不溶性クロマチンおよび破片をペレット化する。次に、上清を新しい2ミリリットルのチューブに移します。サンプルは摂氏マイナス80度で無期限に保管してください。

各クロマチン免疫沈降またはChIP反応ごとに、1.5ミリリットルの超音波処理抽出物と抗体ビーズコンジュゲートを1.5ミリリットルのチューブに組み合わせます。ミニチューブローテーターでチューブを4°Cで9の速度で一晩インキュベートします。数分後にチェックして、サンプルが漏れていないこと、および適切に混合されていることを確認してください。

翌日、チューブを非常に短時間回転させてキャップに液体を集め、チューブを磁気ラックに1分間置きます。次に、抽出物を吸引します。各チューブに0.75ミリリットルのRIPAバッファーを追加します。

次に、チューブを磁気ラックから取り外し、数回反転させて混合します。少し回転させた後、チューブを磁石に戻し、上清を吸引します。最後の洗浄後、各チューブに0.75ミリリットルの10ミリモルトリスHCLを追加します。.

マグネティックラックからチューブを取り外し、サンプルを数回反転させて混合します。少し回転させた後、チューブをラックに戻し、上清を吸引します。テキストプロトコルに従って研磨および詳細化反応を行った後、ライゲーションマスターミックスの計算を記入します。

次に、氷とピペットで1.5ミリリットルのチューブにライゲーションミックスを行い、溶液を混合します。マグネティックラックにサンプルチューブを取り付けた状態で、48マイクロリットルのP7ライゲーションマスターミックスと、異なるアダプターインデックスの2マイクロリットルを各サンプルレジンに加えます。ThermoMixerでサンプルを25°Cでgの3倍で2時間インキュベートします。

サンプルを洗浄し、テキストプロトコルに従ってPhy 29ニック修復およびキナーゼ反応を行った後、ラムダエキソヌクレアーゼマスターミックスの計算を記入し、氷上の1.5ミリリットルチューブでラムダエキソヌクレアーゼミックスを行います。マグネティックラックに50マイクロリットルのラムダエキソヌクレアーゼミックスを各サンプル樹脂に加えます。次に、ThermoMixerでサンプルを37°Cのgで30分間インキュベートします。

テキストプロトコールに記載されているように最後の洗浄を吸引した後、RecJfマスターミックスの計算を記入し、氷上でRecJfミックスを作ることにより、RecJfヌクレアーゼ反応を行います。50マイクロリットルのRecJfミックスをマグネティックラック上の各サンプルレジンに加えます。次に、ThermoMixerでサンプルを37°Cのgで30分間インキュベートします。

最後の洗浄を吸引した後、ChIP溶出バッファーとプロテイナーゼKマスターミックスを調製し、各サンプルレジンに200マイクロリットルの溶液を加えます。ThermoMixerでサンプルを65°Cの3倍gで一晩インキュベートし、結露を防ぐために加熱した蓋をします。翌日、サンプルを短時間回転させ、チューブを磁気ラックに1分間置きます。

次に、200マイクロリットルの上清を、200マイクロリットルのTEバッファーを含む新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。DNA抽出、P7一次伸長、ATL反応の後、P5アダプターライゲーションテーブルのマスターミックス計算に記入し、氷上でライゲーションマスターミックスを作製します。各サンプルとピペットに20マイクロリットルのライゲーションミックスを加えて混合します。

次に、サンプルを25°Cのサーマルサイクラーで2時間インキュベートします。テキストプロトコルに従ってDNAの精製と定量を行います。ここに示すように、100〜500塩基対のDNA断片を生成する高品質のクロマチン抽出物を得るために、超音波処理条件を最適化するために時間を費やす価値があります。

また、電気泳動移動度シフトアッセイを使用して、超音波処理された抽出物が無傷のタンパク質DNA架橋を含んでおり、DNA断片のスーパーシフトとして明らかです。バックグラウンドシグナルを評価するために、反応中に抗体を使用せずに模擬ChIPを日常的に実施します。高品質のChIPエクソライブラリは、ChIP-seqライブラリ調製と比較して、模擬サンプルでの背景情報がほとんど得られません。

ここに示されているのは、ChIP-exoライブラリのバイオアナライザー評価です。解析により、ライブラリサイズの分布が正確に確認され、125塩基対で動作する汚染アダプターダイマーが検出されます。このパネルは、増殖するK562細胞におけるヒトRPS12遺伝子におけるポリメラーゼII、TFIIB、TBPの鎖分離ChIP-exoタグ5プライムNのスムーズな分布を示しています。

この図に示されているのは、タンパク質コード遺伝子の転写開始部位に対するChIP-exoの平均パターンです。複合プロットにおけるTBP、TFIIB、ポリメラーゼIIの主要なピーク位置は、ヒト転写開始複合体のゲノム構成を反映しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば4日で完了します。

その開発後、この技術は、遺伝子制御の分野の研究者が酵母の非対称性における核内構造の分子詳細を探求する道を開きました。この手順に続いて、RNase seek expression プロファイリングなどの他の方法を実行して、特定の因子が近くの遺伝子の発現に影響を与えるかどうかなどの問題に対処できます。この手順を試行する際には、すべての酵素ステップのマスターミックステーブルを慎重に記入することを覚えておくことが重要です。

発がん性物質やその他の腐食性物質の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、常に個人用保護具の着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。このビデオを見た後、高品質のChIP-exoライブラリを準備する方法をよく理解しているはずです。