Name: ChIP-エキソ方法：近く塩基対の精度でタンパク質 - DNA相互作用を同定します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学ぼう、ChIP-exo法を用いて近塩基対精度でタンパク質-DNA相互作用を同定する方法。エクソヌクレアーゼ処理と高通量シーケンスにより、遺伝子発現制御とエピジェネティクス研究における正確なゲノム位置のマッピングを実現します。

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有益な議論をしてくださったベンターズ研究室と分子生理学・生物物理学部門のメンバーに感謝します。私が彼の研究室でポスドク研究員だった間、彼の指導、メンタリング、そしてChIP-exoのニュアンスに関する多くの洞察に満ちた議論をしてくれたFrank Pugh氏に感謝します。

<ol><li>Venters, B. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+eukaryotic+genes+are+transcribed%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How eukaryotic genes are transcribed.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+dynamics+of+enhanceosome+assembly+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells.</a> Cell. 156, 1274-1285 (2014).</li>
<li>Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+MEF2+target+gene+analysis+in+cardiac+and+skeletal+muscle+reveals+novel+regulation+of+DUSP6+by+p38MAPK-MEF2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling.</a> Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).</li>
<li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+ArgR-DNA+complexes+at+the+genome-scale+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).</li>
<li>Katainen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF%2Fcohesin-binding+sites+are+frequently+mutated+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer.</a> Nat Genet. 47, 818-821 (2015).</li>
<li>Murphy, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+protein-DNA+interaction+underlying+metazoan+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination.</a> Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).</li>
<li>Zere, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Targets+and+Features+of+BarA-UvrY+%28-SirA%29+Signal+Transduction+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems.</a> PLoS One. 10, e0145035(2015).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li>
<li>Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnucleosomal+structures+and+nucleosome+asymmetry+across+a+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome.</a> Cell. , 1377-1388 (2014).</li>
<li>Pugh, B. F., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Organization+of+Human+Transcription+Initiation+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes.</a> PLoS One. 11, e0149339(2016).</li>
<li>Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneTrack--a+genomic+data+processing+and+visualization+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework.</a> Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS computational biology. 8, e1002638(2012).</li>
<li>Bardet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+transcription+factor+binding+sites+from+ChIP-seq+data+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution.</a> Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MACE%3A+model+based+analysis+of+ChIP-exo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MACE: model based analysis of ChIP-exo.</a> Nucleic Acids Res. 42, e156(2014).</li>
<li>Bentley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+method+for+identifying+genomic+location+of+DNA-binding+proteins+with+near-single-nucleotide+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24(2012).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Illumina-based+ChIP-exonuclease+method+provides+insight+into+FoxA1-DNA+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties.</a> Genome Biol. 14, R147(2013).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

<html>我々は、クロマチンが近い塩基対の解像度で公平な、ゲノムワイドな方法で相互作用タンパク質の正確な結合位置を決定するために、機能ゲノムプロトコルを提示します。免疫沈降物は、磁性樹脂のままに近い塩基対のマッピング分解能を達成するための最も重要なステップは、チップに富むDNAのエキソヌクレアーゼ処理です。表向きは、タンパク質複合体は、潜在的に任意のサブユニット（ 例えば、クロマチンリモデリング複合体またはヌクレオソームコア粒子）のin vivoフットプリントをブロックすることができます。ホルムアルデヒドは、非効率的な架橋剤であるので、以前に10、報告されているように、それは、複雑な複数のサブユニットは、同じ遺伝子座で同じ細胞中のDNAと相互に架橋するであろうことがますますにくくなります。したがって、そのようなヌクレオソームの個々のヒストンサブユニットなどのタンパク質複合体の個々のサブユニットのインビボフットプリンティング、チップエキソで可能です。 tは &quot;&gt;のChIP-エキソの最も顕著な利点は、その近くに塩基対の解像...

クロマチン免疫沈降（チップ）が選択的に生きている細胞内の指定されたタンパク質と相互作用するDNA断片を濃縮することにより、遺伝子調節のメカニズムを研究するための強力な方法です。技術は、ハイスループットシークエンシング（チップ配列番号1）をオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（チップオンチップ）のハイブリダイゼーションを単一遺伝子座（標準のChIP-定量PCR）の検出から、改善、チップ富化DNAフラグメントの検出方法が発展してきました。 ChIP-seqが幅広い応用、クロマチン異質と非特異的なDNA相互作用を見たが、偽陽性と不正確なマッピングにつながるデータ品質を妨げてきました。これらの制限を回避するために、博士はフランク・ピューは、チップエキソ方法2を開発しました。 ChIPのエキソの顕著な特徴は、それが効果的に位置転写因子結合をフットプリンティング、エキソヌクレアーゼ5 &#39;から3&#39;を組み込むことです。その結果、チップエキソ方法は、より高い解像度、detectioの大きなダイナミックレンジを達成しますnおよびより低いバックグラウンドノイズ。 ChIP-エキソは、より技術的に困難なのChIP-seqのよりマスターにではあるが研究は、多様な生物学的システム3-8を使用して、ユニークな超高解像度の洞察を得ることを目指しとして、それが広く採用されています。実際に、チップエキソ正常細菌、酵母、マウス、ラット、およびヒトの細胞系に適用されています。原理の証明としてチップエキソは当初、酵母転写因子2の一握りのための正確な結合モチーフを同定しました。技術はまた、転写開始前複合体の組織化を研究するために、種々のヒストン9,10のsubnucleosomal構造を解読するために、酵母中で使用しました。最近では、我々は人間のプロモーターで隣接TFIIBとポルII結合事象を解決するためのChIP-エキソを活用し、かつ広範な発散転写は11と錯体を形成する別個の開始から生じることを示しました。 ここで紹介するワークフローを最適化およびsされます哺乳類のChIP-エキソ（ 図1）のためにtreamlined。まず、生きている一次または組織培養細胞は、共有架橋を介してインビボでタンパク質-DNA相互作用を維持するためにホルムアルデヒドで処理されます。細胞を溶解し、クロマチンは〜100に剪断された - 500塩基対のサイズの断片。チップはその後、選択的に目的のタンパク質に架橋DNA断片のために豊かにします。この時点でのChIP-seqのライブラリーは、典型的には、本質的に、数百塩基対の平均断片サイズに検出分解能を制限する、調製されます。しかし、のChIP-エキソはラムダエキソヌクレアーゼでタンパク質-DNA架橋部位の左右の5 &#39;DNA境界をトリミングすることによって、この制限を克服します。以下に詳述するようにシークエンシングライブラリーは、その後、エキソヌクレアーゼ消化DNAから構成されています。得られたネストされた5 &#39;境界は、タンパク質-DNA相互作用（ 図1、ステップ14）とのインビボでのフットプリントを表し、ハイスループットシークエンシングによって検出されます。 AltキーChIP-エキソ方法論は、チップ-seqのよりも複雑であるハフ、ほとんどの工程間の遷移はサンプルのロスや実験的なばらつきを最小限に抑えるシンプルなビーズの洗浄が必要です。重要なことに、チップエキソは、チップのseq、またのChIP-エキソと成功するはずのChIP-seqのと成功している任意のサンプルの洗練されたバージョンがあるため。 ChIP-seqのとは根本的に別個のデータ構造でのChIP-エキソ結果とタンパク質-DNA相互作用のin vivoフットプリント。共通のChIP-seqの発信者が最も正確なピークのコールを取得するために、ChIPのエキソデータに適用することができるが、我々は、具体的に念頭に置いてのChIP-エキソデータのユニークな構造で設計されたバイオインフォマティクスツールをお勧めします。これらはGenetrack、GEM、MACE、Peakzilla、およびExoProfiler 12-15が含まれます。

<table><tbody><tr><td>37% ホルムアルデヒド、メタノールフリー、10 x 10 ml アンプル</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>セクション 3</td></tr><tr><td>コンプリート プロテアーゼ阻害剤カクテル (CPI)</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>セクション 4、8</td></tr><tr><td>Bioruptor sonicator</td><td>Diagenode</td><td>UCD200</td><td>セクション 5</td></tr><tr><td>15 ml ポリスチレンチューブ</td><td>BD Falcon</td><td>352095</td><td>セクション 5</td></tr><tr><td>マグセファロース プロテイン G Xtra ビーズ</td><td>GE ヘルスケア</td><td>28-9670-66</td><td>セクション</td></tr><tr><td>6 DynaMag-1.5 ml サイド マグネティック ラック</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>セクション 6-17, 22</td></tr><tr><td>ミニチューブ ローテーター</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>05-450-127</td><td>セクション 7, 22</td></tr><tr><td>T4 DNA ポリメラーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0203</td><td>セクション 9</td></tr><tr><td>DNA ポリメラーゼ I, Klenow</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0210</td><td>セクション 9</td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2 (10x 反応バッファー 2)</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>B7002</td><td>セクション 9-11、13、15、20</td></tr><tr><td>サーモミキサー C</td><td>エッペンドルフ</td><td>5382</td><td>セクション 9-16</td></tr><tr><td>ATP</td><td>ロシュ ライフサイエンス</td><td>010419979001</td><td>セクション 9、11、13</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>N0447</td><td>セクション 9、12、19、23</td></tr><tr><td>T4 ポリヌクレオチドキナーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0201</td><td>セクション9、13</td></tr><tr><td>dATP</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>N0440</td><td>セクション10、20</td></tr>クレ<tr><td>ノウ3'-5'エクソマイナス</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0212</td><td>セクション10、20</td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0202</td>セクション<td>11、21</td></tr><tr><td>&Phi;-29 DNAポリメラーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0269</td><td>セクション12、19</td></tr><tr><td>10x&ファイ-29バッファー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>B0269</td>セクション<td>12、19</td></tr>ラム<tr><td>ダエキソヌクレアーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボM0262</td><td></td>セクション<td>14</td></tr><tr><td>10xラムダバッファ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>B0262</td><td>セクション14</td></tr><tr><td>RecJf エキソヌクレアーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0264</td><td>セクション 15</td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>ロシュ ライフサイエンス</td><td>03115828001</td><td>セクション 16</td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>ロシュ ライフサイエンス</td><td>010901393001</td><td>セクション 18</td></tr><tr><td>10x T4 リガーゼ バッファー</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>B0202</td><td>セクション 21</td></tr><tr><td>AMPure XP (クリーンアップ) ビーズ&nbsp;</td><td>ベックマン・コール</td><td>ターA63881</td><td>セクション22Q5</td></tr><tr><td>ホットスタートDNAポリメラーゼ&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0493</td><td>Section 23</td></tr><tr><td>5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer)</td><td>New England BioLabs</td><td>B9027</td><td>Section 23</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Section 25</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td>Section 26</td></tr><tr><td>Optical Clear Qubit tubes&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td>Section 26</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Section 26</td></tr></tbody></table>

chip-エキソ方法：近く塩基対の精度でタンパク質 -  dna相互作用を同定します

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

クロマチン免疫沈降（チップ）エピジェネティクスと特定のタンパク質-DNA相互作用を分離する遺伝子調節の分野で不可欠なツールです。ハイスループットシークエンシング（チップ配列）に結合されたチップは、一般に、クロマチンと相互作用するタンパク質のゲノム位置を決定するために使用されます。しかしチップ-配列は数百塩基対の比較的低いマッピング分解能および高いバックグラウンドシグナルによって妨げられます。 ChIP-エキソ方法は、実質的に解像度とノイズの両方を改善するのChIP-seqのの洗練されたバージョンです。 ChIP-エキソ方法論の重要な違いは、効果的にタンパク質-DNA架橋部位の左右の5 &#39;DNAボーダーフットプリントするためのライブラリ作成ワークフローのラムダエキソヌクレアーゼ消化の組み込みです。 ChIPのエキソライブラリーは、高スループット配列決定に供されます。得られたデータは、機能的な組織O中にユニークな超高解像度の洞察を提供するために活用することができゲノムF。ここで、我々は、哺乳動物系と次世代シーケンシング・バイ・合成プラットフォーム向けに最適化し、合理化しているのChIP-エキソ方法について説明します。

次の図は、ここで紹介するのChIP-エキソプロトコルから代表的な結果を示しています。いくつかの酵素工程と、伝統的なのChIP-seqの方法論とは対照的に、ChIPのエキソは11順次依存酵素反応（ 図1）が必要です。このように、注意が各反応成分が各反応マスターミックスに添加されることを確実にするために各ステップで注意しなければなりません。私たちは、自動的に反応マスターミックスの計算を実行するために、反応テーブルに基づいて、定型のスプレッドシートを生成する結果の表を印刷し、それがマスターミックスに追加された後、次に各項目をオフにチェックをお勧めします。 私たちは高品質の配列決定の結果（ 図2）を確保するためのプロトコル全体の品質管理対策の数を採用しています。各チップの反応は、3つの基本的な構成要素が含まれています：1）intereの細胞からクロマチンの抽出物を超音波処理しましたST目的のタ...

ここでは、タンパク質-DNA相互作用の近塩基対分解能を達成するためのプロトコルを提示します。これは、クロマチン免疫沈降(ChIP-exo)によって選択的に濃縮されたDNA断片のエキソヌクレアーゼ処理と、それに続くハイスループットシーケンシングによって得られます。

ChIP-エキソ方法：近く塩基対の精度でタンパク質 -  DNA相互作用を同定します

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

この機能ゲノム技術の全体的な目標は、特定のタンパク質が生細胞内で占める正確なゲノム位置を特定することです。この方法は、クロマチンの文脈で転写機構がどのように組み立てられ、作動するかなど、遺伝子調節とエピジェネティクスの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、タンパク質DNA相互作用の正確なゲノム位置を、非常に低いバックグラウンドで塩基近傍の事前分解能で明らかにすることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、プロトコルが複雑で、全体を通して細部に注意を払う必要があるため、苦労します。核溶解物を超音波処理するには、核抽出物を含む15ミリリットルのポリスチレンチューブに樹脂アダプターを配置することから始めます。氷冷水浴で中出力で30秒間オンと30秒間オフで、合計2回の15分間のセッションでライセートを超音波処理します。超音波処理の結果を確認するには、各チューブから2つの10マイクロリットルサンプルを1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、最初の10マイクロリットルのサンプルを10マイクロリットルのTE-RNase Aおよび0.2マイクロリットルのプロテイナーゼKと組み合わせて逆架橋します。次に、4マイクロリットルの6XキシレンDNA色素を加えます。2番目の10マイクロリットルのサンプルに、2マイクロリットルの6XキシレンDNA色素を添加して架橋を保存します。両方のサンプルを1.5%アガロースゲルで140ボルトで約30〜45分間分析し、後者のブロモフェノール色素がゲルの4分の3下に到達するまで分析します。超音波処理が成功した場合は、超音波処理したライセートを150マイクロリットルの10%Triton X-100を含む2ミリリットルのチューブに移し、ボルテックスで混合します。超音波処理されたライセートを摂氏4度で20,000倍gで10分間回転させることにより、不溶性クロマチンおよび破片をペレット化する。次に、上清を新しい2ミリリットルのチューブに移します。サンプルは摂氏マイナス80度で無期限に保管してください。各クロマチン免疫沈降またはChIP反応ごとに、1.5ミリリットルの超音波処理抽出物と抗体ビーズコンジュゲートを1.5ミリリットルのチューブに組み合わせます。ミニチューブローテーターでチューブを4°Cで9の速度で一晩インキュベートします。数分後にチェックして、サンプルが漏れていないこと、および適切に混合されていることを確認してください。翌日、チューブを非常に短時間回転させてキャップに液体を集め、チューブを磁気ラックに1分間置きます。次に、抽出物を吸引します。各チューブに0.75ミリリットルのRIPAバッファーを追加します。次に、チューブを磁気ラックから取り外し、数回反転させて混合します。少し回転させた後、チューブを磁石に戻し、上清を吸引します。最後の洗浄後、各チューブに0.75ミリリットルの10ミリモルトリスHCLを追加します。.マグネティックラックからチューブを取り外し、サンプルを数回反転させて混合します。少し回転させた後、チューブをラックに戻し、上清を吸引します。テキストプロトコルに従って研磨および詳細化反応を行った後、ライゲーションマスターミックスの計算を記入します。次に、氷とピペットで1.5ミリリットルのチューブにライゲーションミックスを行い、溶液を混合します。マグネティックラックにサンプルチューブを取り付けた状態で、48マイクロリットルのP7ライゲーションマスターミックスと、異なるアダプターインデックスの2マイクロリットルを各サンプルレジンに加えます。ThermoMixerでサンプルを25°Cでgの3倍で2時間インキュベートします。サンプルを洗浄し、テキストプロトコルに従ってPhy 29ニック修復およびキナーゼ反応を行った後、ラムダエキソヌクレアーゼマスターミックスの計算を記入し、氷上の1.5ミリリットルチューブでラムダエキソヌクレアーゼミックスを行います。マグネティックラックに50マイクロリットルのラムダエキソヌクレアーゼミックスを各サンプル樹脂に加えます。次に、ThermoMixerでサンプルを37°Cのgで30分間インキュベートします。テキストプロトコールに記載されているように最後の洗浄を吸引した後、RecJfマスターミックスの計算を記入し、氷上でRecJfミックスを作ることにより、RecJfヌクレアーゼ反応を行います。50マイクロリットルのRecJfミックスをマグネティックラック上の各サンプルレジンに加えます。次に、ThermoMixerでサンプルを37°Cのgで30分間インキュベートします。最後の洗浄を吸引した後、ChIP溶出バッファーとプロテイナーゼKマスターミックスを調製し、各サンプルレジンに200マイクロリットルの溶液を加えます。ThermoMixerでサンプルを65°Cの3倍gで一晩インキュベートし、結露を防ぐために加熱した蓋をします。翌日、サンプルを短時間回転させ、チューブを磁気ラックに1分間置きます。次に、200マイクロリットルの上清を、200マイクロリットルのTEバッファーを含む新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。DNA抽出、P7一次伸長、ATL反応の後、P5アダプターライゲーションテーブルのマスターミックス計算に記入し、氷上でライゲーションマスターミックスを作製します。各サンプルとピペットに20マイクロリットルのライゲーションミックスを加えて混合します。次に、サンプルを25°Cのサーマルサイクラーで2時間インキュベートします。テキストプロトコルに従ってDNAの精製と定量を行います。ここに示すように、100〜500塩基対のDNA断片を生成する高品質のクロマチン抽出物を得るために、超音波処理条件を最適化するために時間を費やす価値があります。また、電気泳動移動度シフトアッセイを使用して、超音波処理された抽出物が無傷のタンパク質DNA架橋を含んでおり、DNA断片のスーパーシフトとして明らかです。バックグラウンドシグナルを評価するために、反応中に抗体を使用せずに模擬ChIPを日常的に実施します。高品質のChIPエクソライブラリは、ChIP-seqライブラリ調製と比較して、模擬サンプルでの背景情報がほとんど得られません。ここに示されているのは、ChIP-exoライブラリのバイオアナライザー評価です。解析により、ライブラリサイズの分布が正確に確認され、125塩基対で動作する汚染アダプターダイマーが検出されます。このパネルは、増殖するK562細胞におけるヒトRPS12遺伝子におけるポリメラーゼII、TFIIB、TBPの鎖分離ChIP-exoタグ5プライムNのスムーズな分布を示しています。この図に示されているのは、タンパク質コード遺伝子の転写開始部位に対するChIP-exoの平均パターンです。複合プロットにおけるTBP、TFIIB、ポリメラーゼIIの主要なピーク位置は、ヒト転写開始複合体のゲノム構成を反映しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば4日で完了します。その開発後、この技術は、遺伝子制御の分野の研究者が酵母の非対称性における核内構造の分子詳細を探求する道を開きました。この手順に続いて、RNase seek expression プロファイリングなどの他の方法を実行して、特定の因子が近くの遺伝子の発現に影響を与えるかどうかなどの問題に対処できます。この手順を試行する際には、すべての酵素ステップのマスターミックステーブルを慎重に記入することを覚えておくことが重要です。発がん性物質やその他の腐食性物質の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、常に個人用保護具の着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。このビデオを見た後、高品質のChIP-exoライブラリを準備する方法をよく理解しているはずです。

the-chip-exo-method-identifying-protein-dna-interactions-with-near

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用分析のための方法です。...

クロマチンの相互作用のマッピングと転写調節を理解するためのペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用の解析

このビデオでは、タンパク質結合クロマチンフラグメントの選択的免疫沈降を介して、オリゴデンドロサイト前駆細胞のゲノムDNAの特定の領域上のタンパク質結合部位を特定するクロマチン免疫沈降技術を示しています。この方法は、遺伝子調節に関与する転写因子を含む、いくつかの調節タンパク質の相互作用を研究するのに役立ちます。...

ゲノムDNA上の標的タンパク質結合部位を同定するためのクロマチン免疫沈降法

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。...

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

このビデオの記事は、遺伝子標的と2成分系の応答調節因子の結合部位を決定するためのin vitroのマイクロアレイベースの方法を説明します。...

細菌のための2つの成分​​規制システムを遺伝子標的を決定するために、DNA親和性精製チップ（DAP-チップ）方法

クロマチン結合タンパク質のシーケンシャル塩抽出は大きい蛋白質の複合体の結合特性を決定するための便利なツールです。このメソッドは、個々...

クロマチン複合体を変更するのプロパティをバインド一括クロマチンの分析の逐次塩抽出

ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）融合タンパク質でゲノムワイドのタンパク質結合部位をマッピングするためのクロマチン免疫沈降（ChIP） - 直交方法であるハイスループット配列決定（ChEC-seq）と結合したクロマチン内在性切断について記載する。...

ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

ゲノム全体のタンパク質結合位置の正確な決定は、遺伝子調節を理解するために重要です。ここでは、クロマチン免疫沈降DNAをエキソヌクレアーゼ消化(ChIP-exo)に続けてハイスループットシーケンシングで処理するゲノムマッピング方法について説明します。この方法は、哺乳類ニューロンにおける近接塩基対マッピング分解能および高いシグナル対雑音比を用いてタンパク質とDNAの相互作用を検出する。...

クロマチン免疫沈降-エキソヌクレアーゼ(ChIP-Exo)を用いたマウス幹細胞由来ニューロンにおけるタンパク質-DNA相互作用の高分解能マッピング

この記事では免疫染色とクロマチン免疫沈降の重要なステップを紹介します。これらのプロトコルは、DNA損傷関連の細胞プロセスを研究し、DNA修復に関与するタンパク質の採用を視覚化し、定量化するために一般的に使用されます。...

エンドヌクレアーゼベースの部位特異的DNA損傷の可視化と定量化

ATP依存クロマチンリモデラーとDNAリガンドとの相互作用は、CD分光法を用いて説明されている。生成されたピークによって分析された遺伝子プロモーター上の誘導された立体構造変化を使用して、転写調節のメカニズムを理解することができる。...

DNA-タンパク質相互作用を研究するためのCD分光法

CUT&amp;RUNおよびその変異体は、クロマチン上のタンパク質占有率を決定するために使用することができる。このプロトコルは、単一細胞uliCUT&amp;RUNを使用してクロマチン上のタンパク質局在を決定する方法を説明しています。...

標的下での超低入力切断とヌクレアーゼを用いた放出を用いたクロマチン上の単一細胞因子局在化

LNNa-タンパク質の直接的な相互作用を特定するためのUVベースのChIRP法。...

LncRNAと直接相互作用するタンパク質の検証可能な同定のためのUVベースのChIRP法:培養細胞からマウス精巣まで

学ぼう、ChIP-exo法を用いて近塩基対精度でタンパク質-DNA相互作用を同定する方法。エクソヌクレアーゼ処理と高通量シーケンスにより、遺伝子発現制御とエピジェネティクス研究における正確なゲノム位置のマッピングを実現します。

ChIP-エキソ方法：近く塩基対の精度でタンパク質 - DNA相互作用を同定します

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