Name: SorLAとCLC：ウェスタンブロッティング、リソソーム酵素の阻害、および免疫細胞化学によって実証されるようにCNTFRαのCLF-1依存ダウンレギュレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T10:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学ぶ、SorLAとCLC:CLF-1によるCNTFRαのダウンレギュレーションとリソソーム分解をウェスタンブロッティングと免疫細胞化学で解析する方法。ヒト細胞トランスフェクタントを用いた膜タンパク質動態の研究に適した非放射性技術です。

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CNTFRα溶解物の1ウエスタンブロッティング<ol><li>完全長sorLAとMyc標識CNTFRαを発現するヒト胚腎臓をpcDNA3.1 / ZEOを使用して293（HEK293）細胞内で構築し、それぞれ、（ - - ）とのpcDNA3.1 / HYG（）。構築物はmanufacturer&#39;sプロトコルに従って商業トランスフェクション試薬を用いてHEK293細胞をトランスフェクト。 150 / mlのゼオシンおよび/または500 / mlのハイグロマイシンBゴールド13を含む培地中で安定なクローンを選択します。 </li><li> HEK293の種子同数はダルベッコ中の細胞を、10％の胎児を補充Eagle&#39;s培地（DMEM）を改変図 1培養に示すように、2 4ウェルプレート中CNTFRα-MYCまたは共発現CNTFRα-MYC / sorLAいずれかを発現するトランスフェクタント37℃、5％炭酸ガスインキュベーター中でウシ血清（FBS）、100 U / mLペニシリン、および100μg/ mLのストレプトマイシン（完全培地）。 </li><li> 80％コンフルエント - 細胞が50になるまで待ちます。 </li><li>からメディアを削除します図1に示すようにCLF-1：ウェルは、10 nMのCLC（コントロール）ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で1回洗浄し、または含まない新鮮な完全培地を追加します。 37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li>インキュベーションの0と5時間後、培地を回収し、1.5 mLチューブ中、4℃で保管してください。次いで、各ウェルにプロテイナーゼ阻害剤カクテル（1分、4℃）を補充した1％トリトンX-100溶解緩衝液（20mMのTris-HCl、10mMのEDTA、pH8.0）に加えます。その後、1.5 mLチューブ（4℃）に細胞溶解物を移します。 </li><li>培地および細胞溶解液（3,000×gで、3分、4℃）を含有するチューブをスピンし、1.5 mLチューブ（4℃）に上清を移します。ペレットを捨てます。新しい1.5 mLチューブに各細胞溶解液上清の転送5μL - 後でタンパク質含有量を測定するためにそれらを使用する（1.7ステップ）。すぐに、すべての上清に非還元LDSサンプルバッファーを追加し、サンプルをボルテックス。 </li><li> PROTを測定するために、5μLのアリコートを使用します製造業者のプロトコルに従って市販のタンパク質アッセイを用いて細胞溶解物の上清中のEINコンテンツ。 </li><li> 5分間95℃でサンプルを加熱します。 </li><li> 13ブロッティング SDS-PAGE 13と西洋の削減に各試料から等量のタンパク質を被写体とウサギ抗sorLA 16を使用して、培地中の細胞溶解物中のsorLA、βアクチン、およびCNTFRα-Mycの内容を視覚化（5 / mlの）、マウス抗βアクチン（0.4μgの/ mL）を、マウス抗Myc（1μgの/ mL）の抗体および適切なHRP結合二次抗体（1：2,000）。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、デンシトメトリーによってバンドを定量化します。 </li></ol>リソソーム阻害剤との併用で2免疫細胞化学<ol><li> 図2に示すように、シードHEK293細胞を安定4ウェルプレート中のカバースライド上CNTFRα-MYC / sorLAでトランスフェクトしました。文化としての上記の完全培地中の細胞。 </li><li>40％ - 細胞コンフルエンスは20になるまで待ちます。 </li><li> 図2に示すように、細胞に（リソソーム加水分解酵素を阻害する）をウェルから培地を除去し、（レイ/ PEP）ロイペプチンおよびペプスタチンAを50μg/ mLの有無にかかわらず、完全な培地を追加します。 37℃で細胞をインキュベートします。培地は、インキュベーションの24時間後の間、6時間ごとに交換する必要があります。 </li><li>インキュベーションの24時間後、再び（レイ/ PEPの有無にかかわらず）培地を交換し、この時間は、10 nmのCLCを追加：CLF-1。 5時間37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li> PBSで1回細胞を洗浄し、室温で15分間、4％パラホルムアルデヒド、pHは7でそれらを修正。 注意：パラホルムアルデヒドは皮膚、目、および粘膜との接触を避けるため、非常に有毒です。手袋と安全メガネを着用し、解決策は、ヒュームフードの内側になされるべきです。 </li><li> PBSで細胞を1回洗浄し、PBS（0.5％サポニン）で希釈したサポニンに室温で5分間、細胞を透過性。 </li><li>特に（ヤギ抗CNTFRα（1μg/ ml）を希釈ないマウス抗Mycは、0.5％サポニンでウエスタンブロット）およびマウス、抗LAMP-1（15μgの/ mL）の抗体を使用し、室温で2時間、抗体と細胞をインキュベートします。 </li><li> 0.5％サポニン中で細胞を4×（5分間）洗浄し、室温で2時間、ロバ抗ヤギアレクサ488およびロバ抗マウスアレクサ有する細胞568結合二次抗体（6μgの/ ml）をインキュベートします。 </li><li>脱イオン水で2回（1分）で、0.5％サポニン中で細胞4倍（5分間）洗浄し、実装メディアを使用して、顕微鏡スライド上にカバースライドをマウントします。 </li><li> 63X C-アポクロマート水浸対物レンズ、NA 1.2を有するレーザ走査型共焦点顕微鏡を用いた共焦点顕微鏡による細胞の抗体染色を分析します。 </li></ol> pSTAT3レベルの3ウエスタンブロット検出<ol><li> 図3に示すように、4ウェルプレートに（CNTFRαの内因性レベルを発現する）HEK293-sorLA細胞をシード。文化としての上記の完全培地中の細胞。 </li><li>まで待って80％コンフルエント - 細胞は50です。 </li><li>ウェルから培地を除去し、PBSで1回洗浄し、10 nmのCLCの有無にかかわらず、新鮮な完全培地を追加：CLF-1細胞に、図3に示すように。 5時間37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li> 、培地を除去非補充DMEM中で細胞を2回洗浄（ブランクメディア; FBSおよび抗生物質を含まない）、その後、ブランク培地中で90分間（37℃）のための細胞をreincubate。 </li><li>もう一度、培地を除去し、5 nmのCLCの有無にかかわらず、新鮮なブランクメディアを追加します。 図3に示すようにCLF-1（STAT3のリン酸化を開始します）。 37℃で15分間インキュベートします。 </li><li>素早く（1分、4℃）、プロテイナーゼ阻害剤カクテルおよびホスファターゼ阻害剤を補充した1％トリトンX-100溶解緩衝液（20mMのTris-HCl、10mMのEDTA、pH8.0）に添加することによって細胞を培地を除去し、溶解各ウェルにカクテル。その後、1.5 mLチューブ（4℃）に細胞溶解物を移します。 </li><li>転送5μLO後でタンパク質含有量を測定するためにそれらを使用する（ステップ3.8） - 新しい1.5 mLチューブに各上清F。すぐに、すべての上清に非還元LDSサンプルバッファーを追加し、サンプルをボルテックス。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って市販のタンパク質アッセイを用いて、5μLアリコートのタンパク質含有量を測定します。 </li><li>室温で超音波処理し、各サンプルそれらがもはや粘性（約1分）されず、その後、5分間95℃でそれらを加熱するまで。 </li><li>対象13を吸い取り、各サンプルからSDS-PAGE 13と西洋に等量のタンパク質と細胞ウサギ抗のpSTAT3を使用して溶解物（1：2000）でのpSTAT3と総STAT3のコンテンツ視覚化し、マウス抗STAT3（1：1,000 ）抗体および適切なHRP-リンクマウスおよびウサギ二次抗体（1：2000）。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、デンシトメトリーによってバンドを定量化します。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

ここで説明するプロトコルは、sorLA媒介CLCを実証するために特に使用することができます：CLF-1依存ダウンレギュレーションとCNTFRαの標的リソソーム、ならびにCLCに付随弱体化応答：CLF-1刺激。 彼らは、CNTFRαとsorLAのわずかな内因性発現を持って急行のgp130 /LIFRβ、トランスフェクションが容易であり、免疫細胞化学に適した大細胞体を、持っているとして、HEK293細胞株は、このプロトコルに適しています。しかし、理論的には類似の特性を有する任意の細胞株も同様に動作するはずです。 プロトコルは、2つの重要なステップがあります。最初の懸念はレイ/ PEP媒体を24時間、約6時間ごとに交換する必要がある2.3、ステップ。そうしないと、アクティブなリソソーム酵素の少ないまたはリソソームにおけるタンパク質の検出不可能な蓄積をもたらすことがあります。第二の重要なステップ（3.4）CLCでプレインキュベーションで洗浄懸念：CLF-1。それがimですportant未結合リガンドを除去するために、細胞の時間が非補充DMEM（ブランク培地）中で（続き刺激を避けて）回復できるようにします。 CLF-1（ステップ3.5）：これはCLCとその後の再刺激中のpSTAT3の低いバックグラウンドレベルを確保します。 なお、 図6は、細胞応答（のpSTAT3）はCNTFRαのsorLA媒介ダウンレギュレーションと並行して減少することを示しています。減少した応答がCNTFRαプールの減少によるものである（そして時に予想されること）が、それは単独で低CNTFRαの発現が減少した細胞応答を占めていることを証明していないことが強調されるべきです。したがって、変更 - 刺激前またはトランスフェクションから生じる - 上流のpSTAT3へのシグナル伝達経路の機能要素のいずれかでは、変更された応答に寄与している可能性があります。 プロトコルの基本的な概念は、このparticuに限定されるものではありませんLAR受容体システム。 （ すなわち、他の細胞株、他の抗体、他のリガンドなど ） -かかわらずsorLA&#39;s関与のプロトコルを変更することにより、他の受容体のリガンド誘導性下方制御を決定することができます。しかし、ウエスタンブロット法による受容体-ダウンレギュレーションの分析は、遅い売上高および非刺激細胞における新たな合成の低度を示す例えば 、GPIアンカー型受容体、受容体のために主に適していることに留意すべきです。したがって、新たな合成の高レベルを示す受容体で、リガンド誘導性下方制御は、新たな受容体を合成することによって補償することができます。 21に記載されるように、これらの状況下では、受容体プールのダウンレギュレーションは、代わりに、代謝標識し、パルスチェイス実験によって決定することができます。代替的に、受容体を妨害しないヨウ素化抗体（好ましくたFc断片）は、「タグ」RECEPTの細胞外ドメインに使用することができる結合しますまたは、及び予想される下方制御は、次いで、細胞ペレットおよび培地の放射能計数によって決定することができます。 ロジスティックな理由から、私たちはCNTFRαと私たちの細胞がMycのタグを運ぶ構築トランスフェクションされ、本プロトコルでは、マウス抗Myc抗体は、受容体のウェスタンブロット検出のために使用しました。対照的に、LAMP-1は、マウス抗体によって検出されたように、ヤギ抗CNTFRα抗体は、免疫細胞化学および二重標識のために使用した - 二つの主要なマウス抗体を使用して明らかにする二次抗体との非特異的な（重複）染色をもたらします。ヤギ抗CNTFRαも（図示せず）ウェスタンブロッティングで動作するので、プロトコルは簡単に変更し、タグなしCNTFRαでトランスフェクトした細胞に適用することができることに注意してください。 高親和性の22 CLF-1：最後に、最近では、エンドサイトーシス受容体ソルチリンがCLCに結合することが示されています。したがって、それは次のように、考えられることソルチリンですsorLA、CLCへの相互接続：CLF-1を介してCNTFRαと同様CNTFRαの標的エンドサイトーシスおよびリソソームを仲介することができます。代わりsorLAのソルチリンを使用して、現在のプロトコルは、この問題を明確にするために使用することができます。

CLF-1 1-3：CLCとCLF-1は、ヘテロサイトカインCLCの二つのサブユニットを構成しています。細胞シグナル誘導に、CLC：CLF-1第一のターゲットCNTFRα、その一次およびGPIアンカー型受容体は、膜結合三量体複合体を形成します。 CLC：CLF-1：CNTFRα複合体は、その後、転写3（JAK / STAT3）経路4のヤヌスキナーゼ/信号トランスデューサーおよびアクチベーターを介して膜貫通シグナル伝達を仲介するのgp130 /LIFRβを募集しています。 3つのサブユニットのいずれかを欠損したマウスは、1と同じ表現型を表示し、原因で顔面神経細胞および不十分な授乳5-8の数の減少に出生後24時間以内に死亡します。ヒトでの調査結果は、同様に、3つのサブユニットの機能的な一貫性を強調しています。このように、ヒトの変異（ホモ接合体または化合物）CLCの原因となる障害：CLF-1またはCNTFRα、いわゆる低温で誘導される発汗/ Crisponi症候群ですべての結果、このようなimpaiなどの症状を特徴とする状態赤授乳や嚥下、様々な異形症の特徴、温度の急上昇と、逆説的と低温9-11で発汗灌流。 インビトロでは、CLCとCNTFRαの組み合わせが必要とgp130 /LIFRβとの相互作用、細胞12内シグナル伝達の誘導に十分です。一方、CLF-1の役割はあまり明確ではありません。これは、直接シグナル伝達に関与しない、長主としてCLC 1の細胞分泌を促進するのに役立つ付録と考えられてきました。しかしながら、最近の知見は、CLF-1は、CLCとCNTFRαのシグナル伝達および代謝回転の両方が関与し、追加の、より重要な機能を有することを示します。したがって、CLF-1は、3つの独立した結合部位を含有すると思われる。その周知CLCへの結合のための1つを、 CNTFRαへの直接結合を媒介する1。およびエンドサイトーシス受容体sorLAとの相互作用のための第三（高親和性）サイト。 CLCとCLF-1の両方が見える＆＃として160; CLCよりもかなり低い親和性でCNTFRαを対象とする：CLF-1複合体は、（そのCNTFRα結合部位を介して）CLF-1はCLCとCNTFRαの統一を促進し、それによって13のシグナル伝達を容易にすることが考えられます。 sorLAとCLF-1の相互作用は、現在のプレゼンテーションの主な問題は、完全に異なる役割を果たしています。 SorLAはVps10pドメイン受容体ファミリー14を構成する5タイプ1受容体の一つです。これは、種々の組織ではなく、脳や神経組織15内の特定で表現されています。他のファミリーメンバーに類似sorLAはVps10pドメイン結合N末端リガンドを担持し、それに加えて、それはまた、低密度リポタンパク質受容体ファミリー15のメンバーに見られるリガンド結合要素を含む他のドメインの種類を含みます。その細胞質尾部は、 例えば 、いくつかのアダプタータンパク質と相互作用アダプタータンパク質-1、-2、およびsorLAは、効率的なendocytosを伝えますあるだけでなく、結合したタンパク質16-18の細胞内選別および輸送。 Vps10pドメインはCLF-1（しかし特に、CLCない）13を含む無関係なリガンドのシリーズを結合する大10枚羽根のβプロペラ19,20を備えます。 CLF-1および三量体複合体CLC：CLF-1：CNTFRα13 CLF-1中の結合部位があってもsorLAは無料CLF-1だけでなく、CLCないだけに結合することを意味CLCとCNTFRαとの複合体形成後もアクセス可能です。 SorLAはCLF-1およびCLCの急速なエンドサイトーシス伝える：CLF-1を、しかしCNTFRαは、GPIアンカーによって表面膜に固定されているのに対し、これらは、可溶性タンパク質です。 CLCの結合場合、問題はそのためです：CLF-1：/、および：CNTFRαはsorLAが複合体全体を内部化し、それによってCNTFRαの表面膜式（CLF-1信号の誘導およびCLCへのその後の細胞の感受性を）変更することができますまたはCNTFRαの売上高。 現在で記載した実験報告書は、以下の質問を明確にするために設計しました： 表面膜CNTFRαのCLF-1依存ダウンレギュレーション：sorLAはCLCを仲介していますか？これを明確にするために、それは最初に21で説明したように代謝標識およびパルスチェイス実験により（不在とsorLAの存在下で）CNTFRαの代謝回転を決定することを試みました。ただし、[S 35]システインおよび[S 35]メチオニンの混合物を使用してCNTFRαにラベルを付ける試みは、放射能の悪い取り込みを示しました。これは、すべての確率で受容体の急激かつ大幅な損失を補償することができないであろう新たな合成の非常に低い程度を、提案しました。 CLCを介して相互に接続するときCNTFRαがダウンレギュレートされたかどうかを確認するには：CLF-1 sorLAに、それは、したがって、単に前とCLCへの曝露後（ウェスタンブロッティングを使用して）CNTFRαの全細胞プールを測定することを決定しました：CLF-1は - との結果を比較します細胞にトランスフェクトされたかどうかをトランスフェクトしましたsorLA。 sorLAはリソソームにCNTFRαをターゲットにしていますか？この質問に答えるために、CNTFRαの局在 - そのCLCを介して内在化：CLF-1媒介sorLAへの結合は、 - 免疫細胞化学を用いて検討し、抗体による標識はCNTFRαと後期エンドソーム/リソソームマーカーリソソーム関連膜タンパク質1に向けました（LAMP-1）。実験は、同様に、未処理のリソソーム酵素の阻害剤で処理した細胞で行いました。アイデアはCNTFRαがリソソームで分解された場合、未処理の細胞はCNTFRαのためのほとんど、あるいは全く染色を示すことになるのに対し、酵素阻害剤で処理した細胞は、LAMP-1陽性の小胞に蓄積CNTFRα染色を提示することは当然でした。 CLF-1刺激：CNTFRαダウンレギュレーションは、CLCに対する細胞応答を下げていますか？ JAK / STAT3を使用してのgp130 /LIFRβヘテロ介して、CLC、CLF-1、およびCNTFRα信号からなる三量体複合体経路。したがって、CLCに応答する細胞の能力は：CNTFRαのダウンレギュレーション時にCLF-1シグナル伝達はsorLAトランスフェにおけるホスホSTAT3（のpSTAT3）/総STAT3レベルのウェスタンブロット検出および定量することにより調査しました。

<table><tbody><tr><td>Zeocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-zn-1</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B Gold</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 トランスフェクション試薬&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11 815 091 001</td><td></td></tr><tr><td>4ウェルプレート(Nunclon Delta Surface)</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle&acute;S Medium (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F/U1</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Phosphate Buffered Saline&nbsp;(DPBS)</td><td>ハイクローン</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>CLC:CLF-1</td><td>R&D Systems</td><td>1151-CL/CF</td><td></td></tr><tr><td>マウス アンチ LAMP-1&nbsp;</td><td>DSHP</td><td>H4A3</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-sorLA</td><td></td><td></td><td>参考文献 16</td></tr><tr><td>マウス抗b-actin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2228</td><td></td></tr><tr><td>マウス 抗 Myc</td><td>Genscript</td><td>A00704</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 抗 CNTFRa&nbsp;</td><td>R&Dシステム</td><td>ズAF-303</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗pSTAT3&nbsp;</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>9145s</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗STAT3&nbsp;</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>9139s</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスHRP結合抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>7076s</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギHRP結合抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>7074s</td><td></td></tr><tr><td>抗ヤギHRP結合抗体</td><td>Dako</td><td>P0160</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ヤギ二次抗体、Alexa Fluor 488 標識</td><td>Invitrogen</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗マウス二次抗体、Alexa Fluor 568コンジュゲート</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td></td><td>Sigma L8511-5MG</td><td></td></tr><tr><td>ペプスタチンA&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>P4265-5MG</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1388</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>メルク</td><td>1,082,191,000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA:Titriplex III</td><td>メルク</td><td>1,084,180,250</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete mini EDTA-free</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>04 906 837 001</td><td></td></tr><tr><td>LDS sample buffer (4x)</td><td>Novex</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay</td><td>バイオ・ラッド</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>VWR</td><td>97,135,000</td><td></td></tr><tr><td>サポニン</td><td>Σ</td><td>S7900-100G</td><td></td></tr><tr><td>封入剤</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr></tbody></table>

sorlaとclc：ウェスタンブロッティング、リソソーム酵素の阻害、および免疫細胞化学によって実証されるようにcntfrαのclf-1依存ダウンレギュレーション

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

ヘテロ二量体サイトカインカルジオトロフィン様サイトカイン：サイトカイン様因子-1（CLC：CLF-1）は、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）は、その後130 /白血病抑制因子受容体β（gp130のを/糖タンパク質リクルート三量体複合体を形成するためにCNTFRαを-anchoredターゲットにシグナリングのためLIFRβ）。 CLCとCNTFRαの両方は、シグナリングのために必要であるが、これまでCLF-1はCLC分泌の推定上のファシリテーターとして知られています。しかし、最近、CLF-1は、3種の結合部位を含有することが示された：CLCに1つ。 CNTFRαのための1つ（すなわち、三量体複合体の構築を促進することができます）。およびエンドサイトーシス受容体sorLAのための1つ。後者のサイトはCLC、CLF-1の高親和性結合を提供：CLF-1、ならびに三量体（CLC：CLF-1：CNTFRα）sorLAに複雑で、かつsorLA発現細胞可溶性リガンドCLF-1とCLCで：CLF-1は急速に取り込まれ、内在化されます。 CNTFRαとsorLAを共発現する細胞では、CNTFRαは最初のCLCをバインド：CLF-1を形成します膜結合型三量体複合体は、それはまた、CLF-1での無料sorLA結合部位を介してsorLAに接続します。その結果、独自にエンドサイトーシスのための能力を持っていないCNTFRαは、に沿って引っ張られ、CLCのsorLA媒介エンドサイトーシスによって内在：CLF-1。 現在のプロトコルは、i）を示すために使用される実験手順を説明しsorLA媒介とCLC：表面膜CNTFRα式のCLF-1依存ダウンレギュレーションを。 CNTFRαの標的II）sorLA媒介エンドサイトーシスおよびリソソーム;そしてiii）CLCに低下細胞応答：CNTFRαのsorLA媒介ダウンレギュレーション時にCLF-1刺激。

図1は、細胞播種とCLCの略図を示しています。プロトコル1、図2のCLF-1のインキュベーションは、細胞播種とレイ/ PEPとCLCの略図を示していますプロトコルにおけるCLF-1のインキュベーション2. 図3細胞播種とCLCの略図を示しています。CNTFRαのCLF-1依存ダウンレギュレーション：プロトコルにおけるCLF-1のインキュベーションおよび刺激3、図4は、sorLA媒介CLCを示しています。 図5は CNTFRαの標的sorLA媒介性エンドサイトーシスおよびリソソームを示しています。 CNTFRαのダウンレギュレーション後のCLF-1刺激： 図6は、CLCに低い応答を示しています。 CNTFRα-mycのダウンレギュレーションがsorLAトランスフェAFTEに弱いバンドによって実証されているのに対し、CNTFRα-Mycのを意味するバンドは、時間ゼロで同様の密度を持っていることに注意してくださいR 5はH（ 図4）。 図5は CNTFRα-Mycのは、レイ/ pepを処理した細胞のLAMP-1陽性の小胞に蓄積していることを示しています。対照的に、CNTFRα-MYCの蓄積は、ロイシン/ PEPの処理が施されていない細胞では見られません。これはCNTFRα-Mycのは、リソソームにソートされ、分解されることを示しています。 CLF-1： 図6に見られるようにCLCにさらされていない細胞におけるレベルと比較して、のpSTAT3のレベルは有意に予備刺激した細胞において減少します。これは、予備刺激した細胞におけるCNTFRαの観察sorLA媒介下方制御（ 図4）に従います。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig1.jpg" /> 図1：2、4-におけるプロトコルにおけるCLF-1インキュベーションは1種HEK293-CNTFRα-MycおよびHEK293-CNTFRα-Mycを/ sorLA細胞：細胞播種とCLCの略図ウェルプレート（0、5時間）とCLCで細胞をインキュベート：CLF-1を示すように。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig2.jpg" /> 図2：細胞播種およびレイ/ PEPとの略図CLC：CLF-1 4ウェルプレートでカバースライド上のプロトコル2.種子HEK293-CNTFRα-Mycの/ sorLA細胞中でのインキュベーションおよびまたはレイせずに細胞をインキュベート/ PEPとCLC：CLF-1示されているように。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig3.jpg" /> 図3： 細胞播種とCLCの &gt; 略図：プロトコルにおけるCLFのインキュベーションおよび刺激 1 4ウェルプレートで3シードHEK293-sorLA細胞およびCLCの有無にかかわらず、細胞をインキュベート：CLF-1ダウンレギュレートする（プレEXP。）示されているようにSTAT3リン酸化を開始するためにCLF-1刺激（STIM。）：CNTFRαはCLCが続きます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig4.jpg" /> 図4：SorLA はCLCを媒介することを示す結果：CNTFRαのCLF-1依存ダウンレギュレーション。 CLF-1：（A）HEK293-CNTFRα-Mycおよび（B）HEK293-CNTFRα-MYC / sorLA細胞を、10 nmのCLCの非存在下（白カラム）または存在下（灰色カラム）中でインキュベートしました。 0の後と5時間のインキュベーションを停止し、媒体（M）、および細胞溶解物（L）中CNTFRα-MYCの含有量は、ウェスタンブロッティングによって検出され、デンシトメトリーにより定量しました。上のパネルは、代表的な実験からのウェスタンブロットの結果を示し、下のパネルは、細胞溶解物に見られるCNTFRα-mycの検出レベルを示します。レベルは0時間での単一および二重トランスフェクタントでCNTFRα-Mycのレベルを基準に示されています。各カラムは、平均±SEMを表した（n = 3）。 t検定を用いて計算したp値。元の図13の後に再生されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig5.jpg" /> 図5：結果SorLAはCNTFRαのエンドサイトーシスおよびリソソーム標的化を媒介することを示します。 HEK293-CNTFRα-MYC / sorLA細胞を、10 nmのCLCとインキュベートし、またはロイシン/ PEPずに処理した：プロトコールに記載されるようにCLF-1、5時間、抗CNTFRα及び抗LAMP-1抗体を用いて固定し、最終的に染色されました2.スケールバー：5μmです。元の図13の後に再生されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig6.jpg" /> 図6：CLF-1 刺激：CNTFRαのSorLA媒介ダウンレギュレーションは、CLCに低下細胞応答を伴っています。 HEK293-sorLA細胞を、10 nmのCLCの非存在下または存在下でプレインキュベートした：CLF-1 5時間（予備EXP。）、BLANで飢餓状態のためにk個の90分間中、5 nmのCLCで刺激：CLF-1 15分間（STIM。）。 （ 左 ）の列は、細胞内でのpSTAT3の相対的レベルを示します。 CLF-1が、CLCで刺激：CLF-1の各列には、CLCの不存在下でプレインキュベートした細胞内のpSTAT3のレベルに（n = 3）での相対的な平均値±SEMを表します。 t検定を用いて計算したp値。 （ 右 ）ウエスタンブロットは、代表的な実験で得られたのpSTAT3とSTAT3の応答を示しています。元の図13の後に再生されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

本プロトコルは、リソソーム酵素の阻害と組み合わせたウエスタンブロッティングおよび免疫細胞化学は、サイトカイン様因子1（CLF-1との相互作用によって搬送される毛様体神経栄養因子受容体α（CNTFRα）のダウンレギュレーションを示すために使用することができる方法について説明します）およびエンドサイトーシス受容体sorLA。

SorLAとCLC：ウェスタンブロッティング、リソソーム酵素の阻害、および免疫細胞化学によって実証されるようにCNTFRαのCLF-1依存ダウンレギュレーション

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

このプレゼンテーションの目的は、ウェスタンブロッティングと免疫細胞化学を使用して、ヒト細胞トランスフェクタントにおけるCNTF受容体のSorLAおよびCLC:CLF-1を介したダウンレギュレーションとリソソーム分解を実証する方法を示すことです。この方法は、GPIアンカー型CNTF受容体がエンドサイトーシス受容体SorLAと共発現したときの代謝回転と、両者を相互接続するCLC:CLFへの曝露に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、放射能を伴わず、わずかな分解しか示さず、刺激を受けていない細胞での合成を使用する膜タンパク質に適していることです。Mycタグ付きCNTF受容体を発現する、またはMycタグ付きCNTF受容体とSorLAを共発現するヒト胚性腎臓293トランスフェクタントの安定クローンを使用します。2つの4ウェルプレートに同数の細胞を播種します。10%FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを添加したDMEMを5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度のフル培地で細胞を培養します。細胞が50〜80%コンフルエントになったら、培地をウェルから取り出します。ダルベッコPBSで一度洗浄した後、10ナノモルCLC:CLF-1の有無にかかわらず、両方のプレート上の各細胞タイプに新鮮なフル培地を加えます。次に、細胞を摂氏37度でインキュベートします。0時間から5時間のインキュベーション後、培地を回収し、1.5ミリリットルのチューブに摂氏4度で保存します。次に、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した1%Triton X-100溶解バッファーを各ウェルに加えます。続いて、細胞ライセートを1.5ミリリットルチューブに移します。次に、培地と細胞ライセートの入ったチューブを回転させます。終了したら、上清を1.5ミリリットルのチューブに移し、ペレットを捨てます。各細胞溶解物上清の5マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに移し、タンパク質含有量の測定に使用します。次に、すぐに非還元LDSサンプルバッファーをすべての上清に追加し、サンプルをボルテックスします。メーカーのプロトコルに従って、市販のタンパク質アッセイを使用して、細胞溶解物上清中のタンパク質含有量を測定します。その後、サンプルを摂氏95度で5分間加熱します。各サンプルから同量のタンパク質を還元SDSページおよびウェスタンブロッティングにさらし、培地および細胞溶解物中のSorLA、β-actin、およびMycタグ付きCNTF受容体の含有量を視覚化します。デンシトメトリーにより、メーカーのプロトコルに従って個々のバンドを定量化します。Mycタグ付きCNTF受容体とSorLAを安定してトランスフェクトしたヒト胚性腎臓293細胞を4ウェルプレートのスライドスライドに播種します。細胞をカバースライドに付着させるには、摂氏37度で1時間インキュベートします。前述したように、細胞をフル培地で培養します。細胞が20〜40%コンフルエントになったら、培地をウェルから取り出し、ロイペプチンとペプスタチンAのミリリットルあたり50マイクログラムの有無にかかわらず、完全な培地を細胞に加えます。次に、細胞を摂氏37度でインキュベートします。ロイペプチンとペプスタチンA培地は、約6時間ごとに24時間交換する必要があります。.そうしないと、活性リソソーム酵素が発生し、リソソーム内のタンパク質の検出可能な蓄積が減少またはまったくなくなる可能性があります。24時間のインキュベーション後、培地を交換し、CLC:CLF-1の10ナノモルを追加します。細胞を37°Cで5時間インキュベートした後、PBSで1回洗浄し、室温で4%パラホルムアルデヒドに15分間固定します。細胞をPBSで1回洗浄した後、PBS中の0.5%サポニンに室温で5分間浸透させます。次に、ヤギ抗CNTF受容体抗体とマウス抗LAMP-1抗体をPBS中の0.5%サポニンで希釈し、抗体と室温で2時間インキュベートします。PBS中の0.5%サポニンで細胞を4回洗浄した後、ロバ抗ヤギAlexa 488およびロバ抗マウスAlexa 568標識二次抗体をそれぞれ6μg/ミリリットルでインキュベートし、暗所で室温で2時間インキュベートします。これに続いて、細胞をPBS中の0.5%サポニンで4回、脱イオン水で2回洗浄します。次に、封入剤を使用してカバースライドを顕微鏡スライドにマウントします。細胞の抗体染色を、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いた共焦点顕微鏡で解析します。ヒト胚性腎臓SorLA細胞を4ウェルプレートに播種します。前述したように、細胞をフル培地で培養します。細胞が50〜80%コンフルエントになったら、培地をウェルから取り出します。PBSで一度洗浄し、CLC:CLF-1の10ナノモルの有無にかかわらず、新鮮なフルメディウムを細胞に加えます。細胞を摂氏37度で5時間インキュベートした後、培地を取り出します。次に、DMEMを添加していないブランク培地で細胞を2回洗浄します。90分間再インキュベートした後、培地を取り出し、CLC:CLF-1の5ナノモルの有無にかかわらず、新しいブランク培地を加えます。その後、摂氏37度で15分間インキュベートします。その後、培地を迅速に取り出し、プロテアーゼ阻害剤カクテルとホスファターゼ阻害剤カクテルを添加した1%Triton X-100溶解バッファーを各ウェルに添加して細胞を溶解します。続いて、細胞ライセートを1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、各上清の5マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに移し、タンパク質含有量を測定するために使用します。次に、すぐに非還元LDSサンプルバッファーをすべての上清に追加し、サンプルをボルテックスします。サンプルバッファーの即時添加は、反応を止め、脱リン酸化を防ぐために重要です。市販のタンパク質アッセイを用いて、メーカーのプロトコールに従って、細胞溶解物上清のタンパク質含有量を測定します。次に、各サンプルが粘性がなくなるまで室温で超音波処理します。その後、サンプルを摂氏95度で5分間加熱します。各サンプルから等量のタンパク質をSDSページとウェスタンブロッティングにさらし、適切な抗STAT3抗体とHRP結合二次抗体を使用して、細胞溶解物中のリン酸化STAT3および総STAT3の含有量を視覚化します。ここでは、SorLAを介したCLC:CLF-1依存的なCNTF受容体のダウンレギュレーションを示しています。Mycタグ付きCNTF受容体とCLC:CLF-1刺激および非刺激の単一トランスフェクタントを表すバンドは、両方の時点で類似していることに注意してください。対照的に、Mycタグ付きCNTF受容体のダウンレギュレーションは、刺激されたダブルトランスフェクタントの比較的弱いバンドによって5時間後に反映されます。SorLAを介したエンドサイトーシスとリソソームによるCNTF受容体の標的化は、ロイペプチンおよびペプスタチンAで処理した細胞のLAMP-1陽性小胞にMycタグ付きCNTF受容体が蓄積していることを示しています。対照的に、治療を受けていない細胞ではMycタグ付きCNTF受容体の蓄積は見られず、Mycタグ付きCNTF受容体がリソソームに選別されて分解されることを示しています。pSTAT3のレベルは、CLC:CLF-1に事前に曝露されていない細胞のレベルと比較して、事前に刺激された細胞では大幅に低下します。これは、前述したように、前刺激細胞におけるCNTF受容体のSorLAを介したダウンレギュレーションが観察されたことと一致しています。このビデオを見れば、CNTF受容体のSorLA媒介性およびCLC:CLF-1依存性のダウンレギュレーションとリソソーム分解を示すためのウェスタンブロッティングと免疫細胞化学の使用方法を十分に理解できるはずです。

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Biochemistry

生物化学

クラスリン依存性エンドサイトーシスは、貨物の選択とクラスリン被覆のアセンブリを調整するアダプタータンパク質に依存します。ここではモデルとして酵母エンドサイトーシスのアダプタータンパク質のSla1pを使用してアダプタクラスリンの物理的相互作用および生細胞イメージングのアプローチを研究するための手順を説明します。...

in vivoおよびアダプター、クラスリンの相互作用のin vitro試験

遺伝子発現制御に重要な役割を果たしているクロマチンのループただし、クロマチンのループの選択的かつ可逆的な変更を可能にする技術の進歩はいません。ここでクロマチンのループの再編成のための強力なシステムを記述対象遺伝子座に CRISPR dCas9 (CLOuD9)...

クロマチンのループ構造の再編を CRISPR 媒介

このプロトコルでは、樹状性フィロポジア間の特異的かつ強い親和性を利用して、培養海馬ニューロン上の食中毒カップ様突起構造から樹状フィロポジアが豊富な画分を精製する方法を紹介する。接着分子、TLCN、および細胞外マトリックス分子、ビトロネクチン。...

樹状フィロポディアリッチ画の精製

このプロトコルは、原発性慢性リンパ球性白血病細胞からの核および細胞質画分の最適化およびその後の効率的な生成を可能にする。これらのサンプルは、タンパク質の局在化と、細胞刺激および薬物治療時に核と細胞質区画の間で起こるタンパク質の密売の変化を決定するために使用されます。...

核/細胞質タンパク質の密売を監視する原発性慢性リンパ球性白血病細胞の細胞分画

本研究では、特定のshRNAを使用して、PERK経路の2つの下流シグナル伝達成分である細胞保護カルシニューリンとアポトーシス促進型CHOPの発現をノックダウンします。反対に、これらは小胞体ストレスの誘導後の神経突起萎縮に対する初代皮質ニューロンの感受性を調節する。...

小胞体ストレスニューロンにおけるレンチウイルス送達特異的shRNAによる分子調節

蛍光活性化細胞選別 - 放射性リガンド処理組織(FACS-RTT)は、アルツハイマー病における18 kDaトランスロケータータンパク質またはセロトニン5HT2A受容体発現の役割を細胞規模で研究するための強力なツールです。このプロトコールは、TgF344−ADラットモデルにおけるFACS−RTTの エクスビボ...

蛍光活性化細胞選別-放射性リガンド処理組織(FACS-RTT)による放射性シグナルの細胞起源の決定

ここでは、ヒトの辺縁ニッチ細胞を単離して同定するためのプロトコルを紹介します。...

辺縁ニッチ細胞の単離と同定

電気生理学は、イオンチャネル活性を調査するためのゴールドスタンダードです。ただし、光学的方法など、多くの代替アプローチがあります。ここでは、8チャネル(LRRC8)形成陰イオンチャネルを含むロイシンリッチリピートの活性を、サブユニット間フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)ベースの方法を用いてモニターする方法について述べる。...

感作蛍光フェルスター共鳴エネルギー移動(SE-FRET)を使用したロイシンリッチリピート含有8チャネル(LRRC8/VRAC)活性のモニタリング

酵素スクリーニングのためのハイスループットアッセイについて説明しています。このマルチプレックスのすぐに使用できるアッセイキットは、事前に選択されたC高原性PオリマーHイドロゲル(CPH)基質と複合体I不溶性C糖素性Bアイオマス(ICB)基質で構成されています。標的酵素は、多糖類分解エンド酵素とプロテアーゼです。...

新規不溶性発色基質アッセイキットを使用した炭水化物分解酵素のハイスループットスクリーニング

この論文では、凍結耐性植物の氷結合タンパク質の同定について、氷再結晶阻害活性の評価とその後の氷親和性精製を用いた天然IBPの単離について概説する。...

アイスアフィニティー精製を用いた氷再結晶阻害とアイソレーションの評価による植物の氷結合タンパク質の同定

学ぶ、SorLAとCLC:CLF-1によるCNTFRαのダウンレギュレーションとリソソーム分解をウェスタンブロッティングと免疫細胞化学で解析する方法。ヒト細胞トランスフェクタントを用いた膜タンパク質動態の研究に適した非放射性技術です。

SorLAとCLC：ウェスタンブロッティング、リソソーム酵素の阻害、および免疫細胞化学によって実証されるようにCNTFRαのCLF-1依存ダウンレギュレーション

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