ライブイメージングは​​、タキサン耐性乳癌における微小管の動的不安定性を研究するために

この実験の全体的な目標は、ドセタキセル耐性乳がん細胞の微小管の動的不安定性を測定することです。この方法は、生理学的条件下での微小管の動的不安定性に関する細胞生物学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。また、さまざまな薬物治療の後でも、この手法は有用です。この技術の主な利点は、生細胞の微小管ダイナミクスを研究するためのシンプルで信頼性が高く、生理学的に適用可能なプロトコルを提供することです。

手順を開始する前に、10 cmの培養皿で37°C、5%二酸化炭素の完全培養培地で乳がん細胞を適切な密度で増殖させます。実験前日、24mmポリL-リジンコーティングガラスカバースリップを70%アルコールですすぎ、一晩UVライトにさらします。翌朝、カバースリップを6ウェルプレートの各ウェルに1枚ずつ入れます。

次に、培養物をPBSで洗浄し、各皿の細胞を0.5ミリリットルのトリプシンEDTAで分離します。細胞がプレートの底から持ち上げられ始めたら、5ミリリットルの新鮮な培地でトリプシンを中和し、細胞を数えます。次に、各カバースリップに5番目の細胞を約10倍加え、プレートを静かに振って、細胞をインキュベーターに少なくとも36時間戻します。

細胞の微小管動態を測定するには、GFPタグ付きαチューブリンストック溶液を反転して数回混合し、ボルテックスのない均質な溶液を確保します。次に、各ウェルの培地を、40マイクロリットルのタグチューブリンを含む2ミリリットルの新鮮な培地と交換します。プレートを静かに振ってマーカーを培養培地と完全に混合し、プレートをさらに24時間インキュベーターに戻します。

翌日、培養培地をドセタキセルを含む新しい培地と交換し、プレートをインキュベーターに30分間戻します。細胞を阻害している間に、倒立蛍光顕微鏡の電源を入れ、サンプルホルダーを摂氏37度に予温します。次に、60X 1.42 NAオイル対物レンズを選択し、最初のカバースリップをサンプルホルダーに取り付けます。

サンプルを1ミリリットルの新鮮な摂氏37度のドセタキセル含有培地で覆い、高GFPタグ付きαチューブリン蛍光強度を示し、微小管構造がはっきりと見えるフラットセルのクラスターを見つけます。クラスター内のセルの1つの周辺領域に焦点を合わせ、画像取得頻度に適切な露光時間を設定します。ドセタキセルの最初のアリコートを追加してからちょうど50分後に、微小管のダイナミクスを2分間記録し始め、2秒ごとに写真を取得します。

すべての画像を取得したら、各ドセタキセル濃度の3つのウェルすべてから合計5つの細胞の画像が取得されるまで、示したばかりの次の細胞を画像化します。各阻害剤濃度についてすべての画像を取得したら、顕微鏡システム内でデコンボリューションプログラムを開き、クリックプロセスを行います。次に、deconvolveを選択し、画像ファイルを入力ウィンドウにドラッグします。

「do」をクリックして画像をデコンボリューションし、デコンボリューションした画像ファイルを顕微鏡ソフトウェアで開きます。[ファイル]をクリックしてムービーとして保存します。ムービーの形式を AV に、アニメーションのスタイルをフォワードに設定します。

圧縮品質を 100% に設定し、フレーム レートを 5/秒に設定します。次に、[時間を通じてアニメーション化]ボックスをオンにし、[実行]をクリックしてビデオを生成します。この代表的な実験では、正常乳がん細胞とドセタキセル抵抗性乳がん細胞をドセタキセルで治療し、示したように画像化しましたが、治療が微小管の成長と短縮に及ぼす影響は、非ドセタキセル耐性細胞に最も顕著に表

実際、0.5マイクロモルのドセタキセル治療条件下で微小管の成長速度と短縮速度を測定すると、ドセタキセル耐性細胞ではなく親細胞のチューブリン動態が強く阻害されることが明らかになりました。一度習得すると、テクニックが適切に実行されれば、プロセス全体を60時間以内に完了できます。この手順を試みる際には、GFPチューブリン蛍光強度の高いフラットセルを選択し、GFP蛍光の退色を避けるために励起蛍光の強度と曝露時間の両方を減らすことを覚えておくことが重要です。

この技術は、開発以来、細胞生物学およびがん生物学の分野の研究者が、正常細胞とがん細胞に対するさまざまな微小管標的剤の影響を評価する道を開いてきました。このビデオを見れば、さまざまな条件下で生細胞の微小管の動的不安定性を測定する方法について十分に理解できるはずです。