Name: 非形質転換ヒト線維芽細胞から増殖性四倍体細胞の樹立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学ぼう、非形質転換ヒト線維芽細胞から増殖性四倍体細胞を樹立する手法。デメコルシン処理とシェイクオフ法を用いて二倍体細胞を排除し、染色体不安定性やがん発生初期の非整倍体細胞の発生機構を研究する。

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技術支援をいただいた松本さんに感謝いたします。

1.細胞培養<ol><li>四倍を誘導するために細胞を得ます。現在までに、この技術は、ヒト線維芽細胞株TIG-1、BJ、IMR-90およびテロメラーゼ不死化TIG-1（TIG-HT）に適用できることが確認されました。 </li><li> α改変または/ 5％（Vでインキュベートすることにより、10％（v / v）の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を補充した研究する細胞型に適した任意の他の細胞培養培地で最小必須培地中で細胞を増殖させます37℃でのv）のCO 2雰囲気。継代細胞ごとに3〜4日には、サブコンフルエント密度を超えません。 注：集団倍加レベル（PDL）細胞増殖と細胞齢を評価するために、継代時に各時間を計算しなければなりません。 PDLは、細胞数から計算することができ、以下の式（X初期PDLである）を用いてディッシュ（N1）と次の継代（N2）で採取された細胞数に播種。 PDL = X +（N1を記録 - N2をログ）/ログ2 </li></ol> 2.誘導とエスタ二倍体線維芽細胞から四倍細胞のblishment <ol><li>振り切りなしで四倍誘導します。 注：次のようにいくつかの細胞株（ 例えば TIG-1）がデメコルチン（DC）で連続的に処理することにより、ほぼ完全に四倍になることができます。 <ol><li>治療前の日に1または2 100mm皿に継代細胞は、四倍誘導しました。通常、四倍体細胞の誘導のために皿当たり5×10 5×10 6〜1細胞を調製。 </li><li> 4日間は0.1μg/ mLのDCを含む培地で指数関数的に増殖する細胞を扱います。 </li><li>薬物を含まない培地でのDCを含む培地を交換し、37℃で5％（v / v）のCO 2雰囲気中で細胞をインキュベートします。細胞は通常、1週間以内に増殖を再開します。 </li></ol></li><li>振り切りで四倍誘導します。 注：ほとんどの細胞はDCとの単純な処理の結果として二倍体と四倍体集団の混合物は、上記（2.1）説明になります。 Pのため、いくつかの変更（ 図1）を次のように二倍体の集団を除去するrocedureが必要です。 <ol><li>いくつかのT75への継代細胞は、四倍を誘導するために、治療前の日をフラスコ。通常、四倍体細胞の誘導のために少なくとも5×10 6細胞（フラスコ当たり1×10 6細胞）を準備します。 </li><li>有糸分裂中の細胞を逮捕するために18時間 - 16のためには0.1μg/ mLのDCを含む培地で指数関数的に増殖する細胞を扱います。有糸分裂中の細胞を阻止するのに必要な時間は、標的細胞に依存してもよいし、可能な限り多くの有糸分裂細胞を得るために、予備実験によって決定されるべきです。例えば、遅い成長している細胞が速く増殖する細胞よりも長い時間DCで治療すべきです。 注：細胞が長すぎる、この段階での治療を受けている場合、彼らは分裂滑りを受ける可能性があり、それができなく次のステップで振り切りにより有糸分裂細胞を収集すること、皿表面に付着します。 </li><li> WHで、振り切り法によりDC-逮捕有糸分裂細胞を収集ICH緩く付着した有糸分裂細胞を遠心分離し、フラスコと培地での洗浄の穏やかに振盪（300×gで、5分間）によって収集されます。この段階での適切な方法により、細胞数をカウントします。 </li><li> 60mm培養皿に収集した有糸分裂細胞を再シードし、さらに3日間は0.1μg/ mLのDCで細胞を扱います。細胞の10％未満が、この処理に耐えることができるので、皿当たり以上、1×10 6個の有糸分裂細胞を播種。 </li><li>薬物を含まない培地でのDCを含む培地を交換し、細胞は通常、1週間以内に発生した増殖を再開するのを待ちます。 </li></ol></li><li>同様に、元の二倍体細胞に継代細胞。 </li></ol> DNA倍数性の3.検討注：これは、十分に確立された手順で、技術的なマニュアルは、詳細な手順と技術的なヒントについては、を参照されたいです。 <ol><li>ソリューション詐欺で細胞をインキュベートすることにより-収穫細胞（1×10 6、5×10 5）37℃で10分間、0.05％トリプシンおよび0.02％EDTAをtaining、10％FBSを含む培地によりトリプシンを中和します。 </li><li>培地中の遠心細胞及び遠心分離（300×gで、5分間）、続いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）5mLに再懸濁することにより、それらを洗浄します。 </li><li>次の2つの方法のいずれかによってDNA分析のための細胞を調製します<ol><li>未固定細胞10を分析するための方法 注：この方法は、細胞周期分析のために市販のキットを用いて行うことができます。細胞が手順で固定されていないと染色された核は時間をかけて破損しますので、この方法で調製した試料は、直ちに分析する必要があります。 <ol><li> 250mMのスクロースを含む40 mMのクエン酸緩衝液で細胞を洗浄。その後室温で10分間、250mMのスクロースを含有する200μLの40 mMのクエン酸緩衝液中の0.1％（v / v）のノニデットP40の30 / mlのトリプシンの250μLで細胞を治療します。 </li><li> 0.5μgの/ mLのトリプシンINHの200μLを追加ibitor及び250mMのスクロースを含む40mMのクエン酸緩衝液中の0.1 / mlのRNアーゼA、室温で10分間細胞をインキュベートします。 </li><li> 250mMのスクロースを含む40mMのクエン酸緩衝液中の0.4mg / mLのヨウ化プロピジウム（PI）の200μLを加え、細胞核を染色し、室温で10分間細胞をインキュベートします。 </li></ol></li><li>固定した細胞を分析するための方法<ol><li>細胞懸濁液を混合し、室温で30分間そのままの100％EtOH滴下を4mLを加えて1mlのPBSに細胞を懸濁し、80％エタノールで細胞を固定。この固定液中の細胞は数週間-20℃で保存することができます。 </li><li> PBS 5mLにそれらを再懸濁することにより洗浄細胞を遠心分離（300×gで、5分間）しました。 0.5ミリグラム/ mLのRNase Aで細胞を処理し、室温で30分間、50μg/ mlのヨウ化プロピジウム（PI）（0.5ミリグラム/ mlのRNase Aおよび1mg / mLのPIの25μLの475μL）でそれらを染色します。 </li></ol></li></ol></li><li>トンのDNA含有量を分析彼488 nmのレーザー、赤チャンネル発光フィルタ（ロングパス&gt; 610 nm）を用いてフローサイトメーターを用いて細胞。標的細胞の倍数性を評価するために、同時に本物の二倍体細胞から調製された基準試料を分析します。 <ol><li>代替的に、二倍体細胞対ビーズの蛍光強度比を評価するために、蛍光標準ビーズを加えます。二倍体細胞11の単四倍体細胞と凝集塊とを区別するために、フローサイトメーターのオプション&#39;パルス幅対パルス高さ&#39;を使用します。 </li></ol></li></ol>染色体の数および核型分析4.審査注：これらはすべてが順調に確立された手法であり、技術マニュアルか、製造元のプロトコルが詳細な手順と技術的なヒントについては、を参照されたいです。 <ol><li>中期で細胞を停止するために4時間を0.1μg/ mLのDCで、指数関数的に増殖する細胞を扱います。 </li><li>染色体スライドを準備します。 <ol><li&gt;をトリプシン処理により細胞を回収し（少なくとも5×10 5細胞）およびFBSを含む培地中で中断。 </li><li>培地中の遠心細胞（300×gで、5分間）し、10分間37℃で低張液（0.075 MのKCl 5 mL）で治療します。 </li><li>修正し、カルノア固定液で細胞を懸濁（メタノール：酢酸= 3：1）。 </li><li>細胞懸濁液の - （35μL25）、少量をドロップすることにより、スライドガラス上に細胞を広げました。このような高温の蒸気への暴露などの追加の手順が広がり、染色体を改善する必要があるかもしれません。 </li></ol></li><li> in situハイブリダイゼーション染色体数や核型分析や多色蛍光染色する細胞（mFISH）。 <ol><li>染色体数。 <ol><li> 20分 - 5％ギムザ溶液（又は蛍光顕微鏡検査のために0.5mg / mlのRNase Aを含むに5μg/ mLのPI）15を有する染色細胞。 </li><li>デジタル少なくとも50中期細胞を撮影。 </li><li>画像解析softwaを用いて細胞あたりの染色体数を数えます写真編集ソフトウェアを使用して染色体をタッチし、重複を手動で分離した後の再。染色体数を手動で採点することができますが、コンピュータ化されたスコアリングが推奨されます。 </li></ol></li><li>核型分析 注：この分析は、訓練を受けた技術者または専門の会社が行ってください。 <ol><li>標準G-バンディング技術12に従って染色細胞。 </li><li>標準karyograms 12を作るために染色体を分析します。 </li></ol></li><li> mFISH 注：この手順はオプションであり、必要に応じて行われるべきです。 <ol><li>製造業者のプロトコル13に記載のヒト染色体のための多色FISHプローブを使用して染色細胞。 </li><li>適切なフィルターとmFISH分析13については、ソフトウェアに蛍光顕微鏡を用いて染色体を分析します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利害関係を持っていないことを宣言します。

化学物質による、細胞質分裂阻害剤によるスピンドル阻害剤のいずれかによって二倍体細胞から四倍の誘導における主要な問題は、細胞がしばしば二倍体と四倍体集団の混合物となり、四倍体細胞は二倍体細胞から分離されなければならないということです。二倍体細胞の自由な四倍体の集団を単離するための最も一般的なアプローチは、希釈を制限することによって、FACSまたはクローニングを使用します。しかし、これらの手順は、面倒で実行することは容易ではありません。本稿では、正常なヒト線維芽細胞からの二倍体の人口の無料増殖性四倍体細胞を確立するための新しいプロトコルを提示します。プロトコルは、有糸分裂で二倍体細胞を停止するスピンドル毒のDCを使用し、皿表面に付着した二倍体間期細胞から振り切りで分離されている有糸分裂細胞を逮捕しました。回収した細胞をさらに3日間DCで処理され、そして二倍体有糸分裂細胞は、この長期のDC処理恐らくbで四倍体G1細胞に変換します（また、有糸分裂スリッページと呼ばれる）のyチェックポイント適応。これらの細胞は、薬物除去の数日間増殖停止後の四倍体細胞のような細胞増殖を再起動します。 この方法...

倍数性は、哺乳動物種の特殊な組織でも、癌や変性疾患のような病的状態の様々なだけでなく、観察されました。倍数体（主に四倍体）細胞は、しばしば、頸部3,4のバレット食道1,2または扁平上皮内病変のようなヒト組織の前癌病変において観察され、そしてそれらの組織5における悪性異数性細胞の供給源であると考えられています、6。それは異数体細胞への四倍の変換は腫瘍形成の初期段階において重要な事象である可能性が示唆されていますが、このプロセスに関与するメカニズムは完全には理解されていません。非形質転換倍数体ヒト細胞を伝播することができる場所ないin vitroモデルが利用できなかったので、これは部分的です。 一部の研究者は、INHによって二核細胞の生成を介して非形質転換ヒト上皮細胞に四倍を誘発しました細胞質分裂7-9 ibiting。しかし、この方法では、不要な二倍体細胞は、蛍光活性化細胞選別（FACS）7,8によって除去されなければなりません または希釈9を制限することによってクローニング。これらの手順が面倒で実行することは容易ではないので、非形質転換四倍体細胞を確立するための簡単な方法は、この分野の研究のために望まれています。 本報告書では、比較的簡単な手順で、正常ヒト線維芽細胞またはテロメラーゼ不死化ヒト線維芽細胞から増殖性四倍体細胞を確立するためのプロトコルについて説明します。手順は、有糸分裂で二倍体細胞を逮捕するためにスピンドル毒デメコルチン（DC）を使用し、オフ振とうすることにより収集有糸分裂細胞は、更に、DCで処理されています。長時間DCで処理された二倍体有糸分裂細胞は、四倍体G1細胞に変換し、これらの細胞は、薬物除去後数日間増殖停止した後に四倍体細胞として増殖します。このプロトコルは、提供します染色体不安定性と倍数体ヒト細胞の発癌性との間の関係を研究するための有用なモデルを作成するための効率的な方法。

<table><tbody><tr><td>MEM-&alpha;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8042-500ML</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>デメコルシン溶液 (10 &mu;HBSSのg / mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1925-10ML</td><td></td></tr><tr><td>BD CycleTES Plus DNA試薬キット</td><td>BD Biosciences</td><td>#340242</td><td>フローサイトメトリーによるDNA倍数性の検査</td></tr><tr><td>ヒト染色体多色FISHプローブ 24XCyte</td><td>MetaSystems</td> <td>#D-0125-060-DI</td><td>mFISH分析用の専用フィルターセットとソフトウェアが必要です</td></tr><tr><td>mFISH&nbsp;ソフトウェア&nbsp;</td><td>MetaSystems</td><td></td><td>Specialized プローブキットが必要です</td></tr></tbody></table>

非形質転換ヒト線維芽細胞から増殖性四倍体細胞の樹立

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

倍数体細胞は、ヒト組織の腫瘍前病変でよく観察され、その染色体不安定性がそのような組織での発がんの原因であると考えられています。倍数体細胞の染色体不安定性を解析するには増殖性倍数体細胞が必要ですが、形質転換されていないヒト細胞からそのような細胞を作成することはかなり困難です。化学薬品による四倍体の誘導は、通常、二倍体と四倍体の集団の混合物をもたらし、ほとんどの研究では、希釈を二倍体細胞から四倍体細胞から分離するために制限することにより、蛍光活性化細胞の選別またはクローニングを採用しました。しかし、これらの手続きには時間と手間がかかります。本報告は、二倍体細胞による汚染を最小限に抑えて、正常なヒト線維芽細胞から増殖性四倍体細胞を誘導するための比較的単純なプロトコルを説明しています。簡単に言えば、このプロトコルは、デメコルシン(DC)による有糸分裂中の細胞の停止、振死後の有糸分裂細胞の収集、収集した細胞をDCとさらに3日間インキュベート、および薬物を含まない培地での細胞のインキュベーション(数日以内に四倍体細胞として増殖を再開する)で構成されています。細胞の種類によっては、振とうによる有糸分裂細胞の収集が省略される場合があります。このプロトコルは、正常なヒト線維芽細胞から増殖性四倍体細胞を確立するための簡単で実行可能な方法を提供します。この方法で確立された四倍体細胞は、染色体の不安定性と倍数体ヒト細胞の発がん性を研究するための有用なモデルになる可能性があります。

我々の経験では、TIG-1細胞を4日間は0.1μg/ mLのDC（ 図2A）との単純な連続処理によってほぼ完全に四倍にすることができます。これとは対照的に、このようなBJまたはIMR-90、およびTIG-HT細胞のような他の線維芽細胞株は、同じ治療後の二倍体と四倍体集団の混合物となり、振り切り法による有糸分裂細胞の単離はもちろん、中に必要ですDCの治療（通常は16から18時間、治療の開始後）（ 図2B、C）。 3日間のDCでの追加処理した後、細胞が増殖停止を受け、大規模な展示、数日間形態を平坦化。一般的には1週間以内に、小さな増殖細胞は、大規模な平坦化細胞（ 図3）の間に現れました。 DC処理後3週間 - 細胞は2でほぼ完全に四倍になりました。確立された四倍体細胞におけるモーダル染色体数は、ほとんどの場合、exce 92でしたPT TIG-HT細胞から確立された四倍体細胞株の一つは、細胞の大部分において91染色体（ 図4）を有し<stro...

倍数体細胞の染色体不安定性を分析するためには増殖性倍数体細胞が必要ですが、そのような細胞を形質転換されていないヒト細胞から作成することは容易ではありません。本報告は、正常なヒト線維芽細胞からの二倍体集団を含まない増殖性四倍体細胞を確立するための比較的簡単な手順を述べている。

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

この手順の全体的な目標は、正常なヒト線維芽細胞から、二倍体集団を含まない増殖性四倍体細胞を確立することです。この方法は、発がんの初期段階で異数性細胞がどのように発生するかなど、発がん研究の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、二倍体集団を含まない増殖性四倍体細胞を比較的簡単な手順で確立できることです。一部の菌株は、紡錘体毒であるデメコルシンによる単純な治療によって完全に四倍体になりますが、ほとんどの菌株は、二倍体集団をエミュレートするために、その治療中にシェイクオフ法で処理する必要があります。シェイクオフ法を使わずに四倍体の誘導を開始するには、1/5培養細胞に約5×10を100mmの皿に継ぎます。皿を摂氏37度の5%二酸化炭素雰囲気で24時間インキュベートします。この後、指数関数的に増殖する細胞を1ミリリットルあたり0.1マイクログラムのDCを含む培地で処理し、摂氏37度の5%二酸化炭素雰囲気で4日間インキュベートします。その後、DC含有培地を薬剤を含まない培地と交換します。増殖が再開するまで、5%二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。シェイクオフ法を利用して四倍体性を誘導するには、培養細胞をT-75フラスコに継代し、各フラスコに1/6細胞の10倍以上が少なくとも1回含まれていることを確認します。フラスコを5%二酸化炭素雰囲気、摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、DCを含む培地で細胞を16〜18時間処理し、テキストプロトコルで概説されているように、有糸分裂で細胞を停止します。インキュベーション後、逆位相コントラスト顕微鏡下のフラスコ内の細胞を確認します。次に、各フラスコを静かに振って、緩く付着した有糸分裂細胞の収集を開始します。激しく振ったり、ピペットの先端でフラスコの表面に触れたりするなどの不注意な取り扱いは避けてください。接着した界面細胞で有糸分裂細胞を汚染しないでください。フラスコを温かい培地でやさしく洗い、細胞を遠心チューブに移します。原子セルカウンターを使用して、セル番号をカウントします。細胞計数後、300 gで5分間遠心分離します。採取した有糸分裂細胞を16mm培養皿に再播種します。次に、めっき細胞を1ミリリットルあたり0.1マイクログラムのDCを含む培地で処理し、摂氏37度で5%二酸化炭素で3日間インキュベートします。この後、DC含有培地を薬剤を含まない培地と交換してください。増殖が再開するまで、摂氏37度の5%二酸化炭素雰囲気でインキュベートします。DNA倍数性の解析には、細胞をPBSで洗浄します。次に、0.05%トリプシンと0.02%EDTAを含む溶液を細胞に加えます。摂氏37度で10分間インキュベートします。この後、細胞懸濁液を遠心分離管に移します。そして、10%の胎児ウシ血清を含む培地を添加してトリプシンを中和します。培地中の細胞を300倍gで5分間遠心分離します。細胞を5ミリリットルのPBSに再懸濁します。その後、再度300倍gで5分間遠心分離します。次に、細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁します。100%エタノールの4ミリリットルを滴下しながら混合します。懸濁液を室温で30分間休ませて、細胞を固定します。この後、細胞を固定液中で300倍gで5分間遠心分離します。そして、5ミリリットルのPBSに細胞を再懸濁します。懸濁液を300倍gで5分間遠心分離します。次に、細胞を0.5ミリグラム/ミリリットルのRNA溶液475マイクロリットルで処理します。1ミリリットルあたり1ミリグラムの25マイクロリットルのプロピジウムヨウ素溶液を加えて、細胞を染色します。そして、混ぜます。懸濁液を室温で30分間休ませます。次に、488ナノメートルのレーザーと赤色チャネル蛍光フィルターを備えたフローサイトメーターを使用して、細胞のDNA含有量を分析します。本物の二倍体細胞から調製した参照サンプルも分析して、標的細胞の倍数性を評価します。まず、指数関数的に増殖する細胞を1ミリリットルあたり0.1マイクログラムのDCを含む培地で4時間処理し、中期の細胞を停止させます。この後、トリプシン処理により1/5細胞に対して10倍以上の5倍を収穫する。採取した細胞をFBSを含む培地に懸濁します。懸濁液を300倍gで5分間遠心分離します。次に、0.075モルの塩化カリウム溶液を5ミリリットル加えます。摂氏37度で10分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、懸濁液を300 gで5分間遠心分離します。細胞を5ミリリットルのCarnoy固定液に再懸濁します。次に、懸濁液を300倍gで5分間遠心分離します。次に、上清を吸引し、0.5ミリリットルのCarnoy固定液で細胞を再懸濁します。細胞懸濁液の30マイクロリットルをスライドガラスに滴下します。最後に、染色体数または核型解析のいずれかで細胞を染色および解析します。この研究では、二倍体集団を含まない増殖性四倍体細胞を、正常なヒト線維芽細胞から培養します。一部の細胞株はDCによる連続処理によって完全に四倍体になることができますが、ほとんどの細胞はDC処理の過程で二倍体集団を排除するためにシェイクオフ法で処理する必要があります。ここでは、3つの線維芽細胞株における四倍体の誘導の代表的な結果を示します。TIG-1株は、DCによる単純な連続処理により、ほぼ完全に四倍体になりますが、この処理により、BJ株とTIG-hT株は二倍体と四肢の集団の混合物になります。したがって、治療過程ではシェイクオフ法による有糸分裂細胞の単離が必要です。染色体カウントは、確立された四倍体細胞で実行されます。見てわかるように、モーダル染色体数はTIG-1細胞とBJ細胞の両方で92、TIG-hT細胞で91です。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2週間で完了します。この手順を試みる際には、付着した界面細胞による有糸分裂細胞の汚染を引き起こさないように、シェイクオフステップでフラスコを静かに振ることを覚えておくことが重要です。

establishment-proliferative-tetraploid-cells-from-nontransformed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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