非形質転換ヒト線維芽細胞から増殖性四倍体細胞の樹立

この手順の全体的な目標は、正常なヒト線維芽細胞から、二倍体集団を含まない増殖性四倍体細胞を確立することです。この方法は、発がんの初期段階で異数性細胞がどのように発生するかなど、発がん研究の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、二倍体集団を含まない増殖性四倍体細胞を比較的簡単な手順で確立できることです。

一部の菌株は、紡錘体毒であるデメコルシンによる単純な治療によって完全に四倍体になりますが、ほとんどの菌株は、二倍体集団をエミュレートするために、その治療中にシェイクオフ法で処理する必要があります。シェイクオフ法を使わずに四倍体の誘導を開始するには、1/5培養細胞に約5×10を100mmの皿に継ぎます。皿を摂氏37度の5%二酸化炭素雰囲気で24時間インキュベートします。

この後、指数関数的に増殖する細胞を1ミリリットルあたり0.1マイクログラムのDCを含む培地で処理し、摂氏37度の5%二酸化炭素雰囲気で4日間インキュベートします。その後、DC含有培地を薬剤を含まない培地と交換します。増殖が再開するまで、5%二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。

シェイクオフ法を利用して四倍体性を誘導するには、培養細胞をT-75フラスコに継代し、各フラスコに1/6細胞の10倍以上が少なくとも1回含まれていることを確認します。フラスコを5%二酸化炭素雰囲気、摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、DCを含む培地で細胞を16〜18時間処理し、テキストプロトコルで概説されているように、有糸分裂で細胞を停止します。

インキュベーション後、逆位相コントラスト顕微鏡下のフラスコ内の細胞を確認します。次に、各フラスコを静かに振って、緩く付着した有糸分裂細胞の収集を開始します。激しく振ったり、ピペットの先端でフラスコの表面に触れたりするなどの不注意な取り扱いは避けてください。

接着した界面細胞で有糸分裂細胞を汚染しないでください。フラスコを温かい培地でやさしく洗い、細胞を遠心チューブに移します。原子セルカウンターを使用して、セル番号をカウントします。

細胞計数後、300 gで5分間遠心分離します。採取した有糸分裂細胞を16mm培養皿に再播種します。次に、めっき細胞を1ミリリットルあたり0.1マイクログラムのDCを含む培地で処理し、摂氏37度で5%二酸化炭素で3日間インキュベートします。

この後、DC含有培地を薬剤を含まない培地と交換してください。増殖が再開するまで、摂氏37度の5%二酸化炭素雰囲気でインキュベートします。DNA倍数性の解析には、細胞をPBSで洗浄します。

次に、0.05%トリプシンと0.02%EDTAを含む溶液を細胞に加えます。摂氏37度で10分間インキュベートします。この後、細胞懸濁液を遠心分離管に移します。

そして、10%の胎児ウシ血清を含む培地を添加してトリプシンを中和します。培地中の細胞を300倍gで5分間遠心分離します。細胞を5ミリリットルのPBSに再懸濁します。

その後、再度300倍gで5分間遠心分離します。次に、細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁します。100%エタノールの4ミリリットルを滴下しながら混合します。

懸濁液を室温で30分間休ませて、細胞を固定します。この後、細胞を固定液中で300倍gで5分間遠心分離します。そして、5ミリリットルのPBSに細胞を再懸濁します。

懸濁液を300倍gで5分間遠心分離します。次に、細胞を0.5ミリグラム/ミリリットルのRNA溶液475マイクロリットルで処理します。1ミリリットルあたり1ミリグラムの25マイクロリットルのプロピジウムヨウ素溶液を加えて、細胞を染色します。

そして、混ぜます。懸濁液を室温で30分間休ませます。次に、488ナノメートルのレーザーと赤色チャネル蛍光フィルターを備えたフローサイトメーターを使用して、細胞のDNA含有量を分析します。

本物の二倍体細胞から調製した参照サンプルも分析して、標的細胞の倍数性を評価します。まず、指数関数的に増殖する細胞を1ミリリットルあたり0.1マイクログラムのDCを含む培地で4時間処理し、中期の細胞を停止させます。この後、トリプシン処理により1/5細胞に対して10倍以上の5倍を収穫する。

採取した細胞をFBSを含む培地に懸濁します。懸濁液を300倍gで5分間遠心分離します。次に、0.075モルの塩化カリウム溶液を5ミリリットル加えます。

摂氏37度で10分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、懸濁液を300 gで5分間遠心分離します。細胞を5ミリリットルのCarnoy固定液に再懸濁します。

次に、懸濁液を300倍gで5分間遠心分離します。次に、上清を吸引し、0.5ミリリットルのCarnoy固定液で細胞を再懸濁します。細胞懸濁液の30マイクロリットルをスライドガラスに滴下します。

最後に、染色体数または核型解析のいずれかで細胞を染色および解析します。この研究では、二倍体集団を含まない増殖性四倍体細胞を、正常なヒト線維芽細胞から培養します。一部の細胞株はDCによる連続処理によって完全に四倍体になることができますが、ほとんどの細胞はDC処理の過程で二倍体集団を排除するためにシェイクオフ法で処理する必要があります。

ここでは、3つの線維芽細胞株における四倍体の誘導の代表的な結果を示します。TIG-1株は、DCによる単純な連続処理により、ほぼ完全に四倍体になりますが、この処理により、BJ株とTIG-hT株は二倍体と四肢の集団の混合物になります。したがって、治療過程ではシェイクオフ法による有糸分裂細胞の単離が必要です。

染色体カウントは、確立された四倍体細胞で実行されます。見てわかるように、モーダル染色体数はTIG-1細胞とBJ細胞の両方で92、TIG-hT細胞で91です。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2週間で完了します。

この手順を試みる際には、付着した界面細胞による有糸分裂細胞の汚染を引き起こさないように、シェイクオフステップでフラスコを静かに振ることを覚えておくことが重要です。