Name: 単層カーボンナノチューブ上のバイオミメティックポリマーとエンジニアリング分子認識 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学ぶ 単層カーボンナノチューブのバイオミメティックポリマー機能化による分子センサー開発。ドーパミン検出や生体内深部イメージングに応用可能な近赤外蛍光ナノセンサーの作製法を解説します。

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この研究は、サイモンズ財団の助成金、および脳行動研究財団の若手研究者助成金である、科学界のバロウズ・ウェルカム基金キャリア賞(CASI)によって支援されました。

注意：使用する前に、関連するすべての物質安全データシート（SDS）を参照してください。ナノ材料は、それらのバルク材料の対応と比較して、追加の危険性を有していてもよいです。工学的制御（ヒュームフード、ノイズエンクロージャ）と個人用保護具（安全眼鏡、ゴーグル、白衣、完全長ズボン、クローズドつま先の靴）を含むすべての適切な安全対策を使用してください。 バッファー、界面活性剤、およびポリマー溶液の調製<ol><li> 100mMのNaCl溶液の調製 <ol><li>イオン交換水80ミリリットル中のNaClの584ミリグラムを溶解させます。 100 mLに全量を純水を追加します。 </li></ol></li><li> 3％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液の調製 <ol><li>脱イオン水の80 mLのSDSを3gを溶解します。 100 mLに全量を純水を追加します。 </li></ol></li><li> 2％コール酸ナトリウム（SC）溶液の調製 <ol><li>芝の2グラムを溶かしIUMは、脱イオン水の80 mLの水和物​​コール酸塩。 100 mLに全量を純水を追加します。 </li></ol></li><li> 画像化バッファー（20 mMトリス、100mMのNaCl、1×トリス）の調製 <ol><li>トリス塩基の22.23グラムおよび磁気撹拌棒と板を使用して、脱イオン水500mL中のNaClの58.44グラムを溶かします。 </li><li> 8.1のpHに達するまで注意深く濃HClを加えます。 </li><li> 1リットルの最終体積に達するように脱イオン水を加えます</li></ol></li><li> RITC-PEG-RITCポリマーの合成 <ol><li>ジクロロメタンおよびジメチルホルムアミド（DMF）の1：1混合物1mLにアミン二官能ポリエチレングリコール（PEG）（5キロダルトンまたは20 kDaの、0.1モル/ L）およびローダミンイソチオシアネート（RITC、0.2モル/ L）を溶解させます。 </li><li> 0.2モルのN、N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）の/ Lを追加します。 </li><li> 3時間後、真空濾過、続いてジエチルエーテルの10倍容量で沈殿します。 </li><li> DMF中で再溶解し、エーテル沈殿folloを繰り返します真空濾過によって結婚。 注：同様の方法を用いて他のイソチオシアネート修飾分子（ 例えば、フルオレセインイソチオシアネート、FITC）は、PEGまたは他のアミン変性ポリマーに結合させることができます。 </li></ol></li><li> ペグ化-DNAの調製（PEG-DNA） <ol><li> 5&#39;-チオール修飾DNAの44.9μL（1ミリグラム/ 0.1 M NaCl中10μL）とトリスの100μL（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP）溶液（0.5 M、pH7.0）に結合し、4.855 mLに追加脱イオン水。 </li><li> 1時間撹拌しました。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水5mLにメトキシポリエチレングリコールマレイミドの500ミリグラムを溶解します。 </li><li> DNAおよびPEG溶液（10 mLの合計）を結合し、24時間撹拌します。 </li></ol></li></ol>単層カーボンナノチューブ（SWNTの）懸濁液の調製<ol><li> 触媒および不純物を除去するSWNTのウォッシュ。 <ol><li>プラスチック製遠心管のコンタに洗っていないSWNTの200から300ミリグラムを追加します。脱イオン水45 mLをining。 </li><li>ボルテックス5分間浴超音波処理器を使用して、2分間超音波処理のためのソリューション。その超音波処理器の設定は、楽器から楽器ごとに異なる注ので、SWNT液が増加の光学密度は、単層カーボンナノチューブが分散されていることを確実にするために（ すなわち 、黒くなる）ことを確認してください。 </li><li> 16,100×gで20分間この溶液を遠心分離し、上清を捨てます。 </li><li>新鮮な脱イオン水約45 mLを加え。 </li><li> 8回まで2.1.2-2.1.4の手順を繰り返します。 </li><li>可能性は、ペレット化したSWNTを乱し、空気乾燥さSWNTペレットを許可しないように注意してできるだけ多くの水を除去します。 </li></ol></li><li> SWNTの核酸懸濁液 <ol><li> 100mg / mLの濃度になるように0.1 M NaCl中の核酸（NA）を溶解します。 </li><li>使い捨てへら、マイクロ遠心チューブと帯電防止銃を使用して、SWNTストックから静電気を除去します。ヒュームフードでは、0の980μLにNA溶液20μLを追加.1 M NaClを1mgの単層カーボンナノチューブを添加しました。 </li><li>直径3mmの先端で超音波処理を使用して、氷浴中で40％の振幅で10分間この溶液を超音波処理します。 </li><li> G X 16,100で90分間TWICE DNA-SWNT溶液を遠心。 PEG-DNAを使用している場合は、100 kDaのスピンフィルタを使用して、過剰な未反応のDNAとPEGを精製します。 1.5分間、9300×gでスピンフィルタとスピンを満たすのに十分なPBSを追加し、この洗浄ステップを3回繰り返します。 </li><li>収集し、CNTの束と凝集体を含むペレットを乱さないように注意しながら、上清を保持します。ナノマテリアルのための適切な制度的有害廃棄物の手順に従って、ペレットを捨てます。 </li><li>ランベルト・ベールの法則と適切な希釈係数に従ってε= 0.036 L /センチ・MGを使用して、一時停止されたSWNTのおよその濃度を決定するために、UV /可視分光光度計を用いて632 nmでの溶液の吸光度を測定します。 </li></ol></li><li> 両親媒性ポリマーの懸濁液SWNTの<ol><li>使い捨てへら、マイクロ遠心管、およびSWNTストックから静電気を除去します。ドラフト内で、2％SC溶液5 mLに5ミリグラムの単層カーボンナノチューブを追加する（あるいは、SDS溶液を使用することができます）。 </li><li>直径6mmのチップを用いて超音波処理を使用して、氷浴中で40％の振幅で1時間、溶液を超音波処理します。 </li><li>超遠心機を使用して、慎重に上清を収集し、4時間150,000×gで遠心分離サンプル。 </li><li> SC-SWNT溶液中の両親媒性ポリマーの1重量％（ 例えば、RITC-PEG-RITC）を溶解します。 </li><li> 5日間、脱イオン水または緩衝液1 Lに対して3.5 kDaの透析膜を用いてポリマー - SC-SWNT溶液を透析。水を変更したり、時間2時間4の後に大きな透析膜をバッファリング、それが選択した界面活性剤の除去が、SWNTおよび両親媒性ポリマーの両方の保持を可能にするように、使用することができます。 </li><li>決定するために、UV /可視分光光度計を用いて632 nmでの溶液の吸光度を測定しますランベルト・ベールの法則と適切な希釈係数に従ってε= 0.036 L /センチ*ミリグラムを使用して、中断したSWNTのおよその濃度。 </li></ol></li></ol>表面固定化SWNTセンサーの調製<ol><li> BSA-ビオチンとニュートラストック溶液の調製 <ol><li> 4℃での10mg / mLのストック溶液とストアを作るために1 mLの脱イオン水に10mgの凍結乾燥BSAビオチンを溶解します。 </li><li> 5mg / mLのストック溶液を作製するために、脱イオン水2mL中10mgニュートラタンパク質（NAV、アビジンタンパク質を脱グリコシル化）を溶解します。分注して-20℃で保管。解凍したアリコートを、4℃で数日間保存することができます。 </li></ol></li><li> BSAビオチンコーティングされた顕微鏡スライドを準備 <ol><li>メタノール、アセトンおよび脱イオン水の最終すすぎに続いて脱イオン水で顕微鏡スライドおよび0.17ミリメートルのカバーガラス（または顕微鏡対物レンズに応じて）を、清掃してください。 </li><li&gt;きれいな顕微鏡スライド上に約5mm離れて両面テープのいくつかの部分を配置することによって、チャネルを作成します。長いガラスカバースリップを取り、両面テープの上部にそれを押してチャンネルを封印。カバースリップとスライドのエッジが同一平面ではないので、それは顕微鏡スライドの中央に配置されていることを確認してください。 </li><li> 1mg / mLの最終濃度に900μLの1xのトリス緩衝液にBSA-ビオチンストック溶液の100μLを加えます。 </li><li>一方の端部にソリューションをピペッティングし、組織を使用して他の溶液を離れてウィッキングすることによってチャネルにBSA-ビオチン溶液50μLを流れます。 0.1MのNaClの50μLと3-5フラッシュに続いて5分間インキュベートします。 </li><li> 0.2ミリグラム/ mLの最終濃度に960μLの1xトリス緩衝液中5mg / mLのNAVの株式の40μLに希釈します。 </li><li>一方の端部にソリューションをピペッティングし、組織を使用して他の溶液を離れてウィッキングすることによってチャネルにNAV溶液50μLを流れます。 2-5分間インキュベート0.1MのNaClの50μLと3-5フラッシュが続きます。 </li><li> 1-10 mg / Lでの濃度になるように、撮像バッファーに懸濁SWNTのストック溶液を希釈し、チャネル内に溶液50μLを流れ、5分間インキュベートします。 </li><li>ゆっくりイメージングバッファの50μLを使用して、過剰な単層カーボンナノチューブを洗い流します。 </li></ol></li><li> APTESシラン化顕微鏡スライドの調製 注：APTESは、スライドは方法は、ガラス基板の表面に負に帯電したDNA-包まれたSWNTを固定化することを可能にするシラン化。 <ol><li>エタノール中の（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン（APTES）の10％溶液を調製します。 </li><li> 3.2.2に記載されている手順を使用して作られたチャネルを使用して、1×トリス緩衝液100μLに流れます。 </li><li> APTES溶液でチャンネルをフラッシュし、5分間インキュベートします。 1×トリス緩衝液で洗浄します。 </li><li>チャネルとincubには1〜10mg /土地フロー溶液50μLの濃度になるように画像化バッファ中の浮遊DNA-SWNTのストック溶液を希釈5分間食べました。 </li><li>ゆっくりイメージングバッファの50μLを使用して、過剰な単層カーボンナノチューブを洗い流します。 </li></ol></li></ol> 4.蛍光分光法とSWNTセンサーの顕微鏡観察<ol><li> NIR蛍光顕微鏡 <ol><li>レーザ励起およびイメージングのためのInGaAsセンサアレイを装備した倒立顕微鏡を用いて表面に固定化SWNTの撮影を行います。 </li><li>調整可能なキネマティックマウントおよびポートの高さに設定し、ポストに取り付けられ菖蒲一対のミラーを用いた倒立顕微鏡の背面照明ポートを入力するレーザービームを向けます。ビームはレベルとその後のミラーの間に、それが照明ポートに入る前に置かれたとき、それは両方の虹彩を通過確認することでまっすぐであることを確認してください。必要であれば、潜望鏡アセンブリを使用してビームの高さを調整します。ビームを減衰させることになる照明ポート上の任意のショートパス熱フィルタを削除します。 </li><li>顕微鏡に適切なフィルターキューブを挿入目的に励起光を反射し、出射光を収集します。これは、典型的には、センサに当たるから散乱励起光を最小にするために、励起波長上記カットオフを有する二色性ロングパスフィルタで構成され（ 例えば 、750 LP）及び発光ロングパスフィルタ（ 例えば、850 LP）。また、発光フィルタは、特定のキラリティのSWNTの放出のために選択的に選択することができます。 </li><li> 1ミリメートルのピンホールを含む2オフセット、つや消しディスクで対物レンズを交換し、適切なアライメントキューブを挿入することにより、ビーム位置合わせの微調整を行います。両方の下部及び上部配向ディスクの中心にビームを合わせます。 </li><li>センサーサイズに対応するために、必要に応じて適切なアダプタと0.5Xレンズを用いて顕微鏡の側イメージング・ポートへの2DのInGaAsセンサアレイを接続します。 </li><li> 100X油浸対物レンズ（1.4 NA）を使用して、蛍光フリーイマージョンオイルを適用し、immobiを配置顕微鏡ステージ上にSWNTサンプルをlized。 </li><li>油に接触するまでカバーガラス（＃1.5、170ミクロン厚さ）の底に目的を上げます。必要に応じて、撮影条件、 例えば、温度、ガラスの厚さなどのために客観的なカラーを調整します</li><li>ゆっくりと上の励起源との目標を引き上げるとInGaAsカメラの蛍光シグナルを監視します。焦点面が表面に接近し、固定化されたセンサーが焦点に入って来るように蛍光強度が徐々に増加する必要があります。 </li></ol></li><li> NIR蛍光分光 注：蛍光分光法は、同じ顕微鏡セットアップを使用して行わなく顕微鏡本体の外分光器とInGaAsリニアアレイ検出器に収集された光を向けることによってすることができます。 <ol><li> NIRの定格キネマティックマウントとミラーを使用して、分光器の入射スリットに向けて光路を向けます。ダウンポイへの光の焦点を合わせます入り口は集束レンズを使用して、スリットntの上に（ 例えば 、平凸、F = 150ミリメートル）。この配向は、&lt;1ミリワットにレーザーパワーを減衰し、1「ミラーと顕微鏡対物レンズを交換すると50/50ビームスプリッタフィルターキューブを使用することによって達成される。励起光は、その後、出口ポートを介して顕微鏡本体を残すことができます入射スリット上にビームを集束するために、ミラーとレンズを調整するために使用されます。 </li><li>顕微鏡の対物レンズとロングパスフィルターを交換した後、ステージ上にウェルプレートを配置し、分光器とInGaAsアレイを用いて合焦サンプルのスペクトルを記録します。 </li></ol></li><li> ドーパミンへ（GT）15 DNA-SWNTの可逆的応答を測定 <ol><li>マウントセンサーは、顕微鏡ステージ上にチャンネルをコーティングし、100倍の油浸対物レンズとInGaAsカメラを使用してフォーカスに持ち込みます。流路やレコードにリン酸緩衝食塩水（PBS）に100μMのドーパミン溶液50μLを追加蛍光強度の変化。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水を使用して、ドーパミン溶液を洗い流し、個々のSWNTセンサーの蛍光の変化を観察します。 </li></ol></li><li> 単層カーボンナノチューブセンサの分析物応答のためのウェルプレートスクリーニング 注：異なる分析物のスクリーニングは、電動ステージを使用して制御透明なウェルプレートを用いて行うことができます。理想的なウェルプレートは、可視光と赤外線に対して透明であり、ウェル間のクロストークを最小限に抑えるために黒の側壁を有しています。 <ol><li> 384ウェルプレートのためによく均一に、一般的に&gt; 96ウェルプレート用の100μLと&gt; 30μLの底部をカバーするのに十分な各ウェルに中断したSWNTセンサー（ 例えば 、5 mg / Lの濃度）のピペット等容量、 。 </li><li>ウェルプレートにライブラリーをスクリーニングすることからピペット分析物（ 例えば 、2μL、100μMの最終容量）。ポテンシャルウェル間のばらつきを考慮するために三重に各検体を準備し、fluctuat励起強度、または温度のイオン。 </li><li>分光器とInGaAsアレイを用いた発光スペクトルを監視しながら、客観的（ 例えば 、20Xのachroplan、0.45 NA）を上げます。目的の最適な位置は、測定された強度の最大値に対応している必要がありウェル内の試料体積のほぼ中央に焦点面を配置します。 </li><li>各サンプルウェルについて、スペクトルを収集するために1月10日のエクスポージャーを記録。 </li><li>蛍光応答を定量化するために、追加の検体のないただのSWNTを含むコントロールに各ウェルについて発光スペクトルを比較してください。 </li></ol></li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

得られたSWNTポリマーハイブリッドのコロイド分散系によって提供される光学密度の増加によって示されるように、単層カーボンナノチューブを容易に、SDS又は一本鎖DNAとの直接的な超音波処理を介して、水溶液中に懸濁されます。 SDSおよびssDNAが分散し、疎水性またはπ-π相互作用を介してSWNT表面上に吸着させることによってSWNTのバンドルを可溶化します。さらに、ゲノムDNA、両親媒性ポリマー、共役ポリマーおよび脂質のような他のポリマーは、SCまたはSDSを用いて懸濁したサンプルを透析によって単層カーボンナノチューブの表面に吸着することができます。例えば、PEGのような親水性ポリマーは、ブロック共重合体の表面吸着を可能にするために、このようなRITCまたはFITCなどの疎水性「アンカー」を有する末端変性することができます。プローブ先端の超音波処理の高出力にさらされると、またはSWNTに低い結合親和性を有するポリマーのためのせん断または分解を受けやすいポリマーのために、透析は安定したSWNT-ポリマー懸濁液を製造するための最良の方法です。ポリマーENCAPS以下のピュレーションは、遠心分離が均一に分散サンプルを残すために大規模なSWNT...

単層カーボンナノチューブ（SWNT）は、アトミックの炭素原子の薄い層は、固有の電子的及び光学的特性を示す細長い円筒に巻かれています。 1このような特性は、その地域の環境に非常に敏感である励起子再結合を介して、近赤外（NIR）蛍光発光を生成するバンドギャップが含まれます。 SWNTのNIR放射は、光の侵入深さは、生物学的組織のために最大である近赤外窓内に入ります。 2,3また、SWNTは、有機蛍光色素分子とは対照的に、非定型のいくつかのユニークな特徴を示す：SWNTの展示大きなストークスシフト、退色しない、と点滅しません。 4最近、これらの特性を活用することは生物学への応用を有する新規分子センサーの品揃えの発展につながっています。 5,6未修飾は、しかしながら、SWNTは、水に不溶性であり、そして個々のSWNTの懸濁液を得ることが課題であることができます。 7,8 BundliNGの溶液中の単層カーボンナノチューブの集合体は、感知用途には適さない、それらをレンダリングそれらのバンドギャップ蛍光、2を難読化することができます。 水溶液中での個々のカーボンナノチューブを分散させて疎水性主導凝集を防止するために、それらの表面を修飾する必要があります。共有結合修飾は、単層カーボンナノチューブを、水溶性、10レンダリングならびに特定の結合化学を付与することができるが9、SWNT格子の欠陥サイトが減少またはそれらの蛍光発光を和らげます。疎水性およびπ-πスタッキング相互作用を介してナノチューブ表面に吸着13 -代わりに、SWNTの官能化は、界面活性剤、脂質、ポリマー及びDNA 9,11を使用することによって達成することができます。表面官能性SWNTの周囲の結果として生じる化学的環境は、そのコロナ相と呼ばれます。コロナ相の摂動はSWNTフッ素に変調を引き起こし、ナノチューブ表面上を移動する励起子に大きな影響を持つことができescence排出。これは、SWNTの大きな表面積に特異的な結合様式を組み込むことにより、新たな分子センサーの開発に利用することができるコロナ相とSWNTの蛍光との間のこの敏感な関係です。検体を結合するとSWNTコロナ相の摂動は、局所誘電環境の変化につながる電荷移動、またはシグナル伝達機構として機能するSWNTの蛍光放出を調節することができるすべてが格子欠陥を導入することができます。 14このアプローチは、DNA、15,16グルコース17ならびにATP、18の反応性酸素種19および窒素酸化物などの小分子を含む分子の多くの異なるクラスの検出のための新規蛍光センサーの開発に使用されます。 20,21しかし、これらのアプローチは、それらが標的分析物のための既知の結合様式の存在に依存しているという点で制限されています。 最近では、より一般的なアプリ蛍光センサーを設計するゴキブリは非共有結合性の両親媒性ヘテロ、リン脂質、およびポリ核酸で官能単層カーボンナノチューブを使用して開発されました。具体的には、タンパク質26,27または神経伝達物質のドーパミンを含む小分子を結合することができるユニークなコロナ相25 -これらの分子は、個々の単層カーボンナノチューブ22の非常に安定な懸濁液を生成するために、カーボンナノチューブの表面に吸着します。 28から30エンジニアリングのSWNTと特異的に結合する標的分析物を分散させるコロナ相としてコロナ相分子認識（CoPhMoRe）と呼ばれます。 28小型、低毒性、高い安定性とCoPhMoRe SWNTセンサーのunbleaching NIR蛍光はそれらに延長時間分解測定のための生体内検知のための優秀な候補となっています。 6最近の研究は、反応性窒素および酸素種の光学的検出のための植物組織における自分のアプリケーションを示しています。 31CoPhMoRe SWNTセンサーにとって特に刺激的な用途は、電気化学センシングまたは免疫組織化学などの他の技術は、空間分解能、時間分解能、および特異性の欠如に苦しんでいるような、生体内でドーパミンなどの神経伝達物質のラベルフリーの検出、の可能性です。 設計とCoPhMoRe SWNTセンサーを発見は、これまで特定のターゲットのためのセンサを発見する可能性を制限し、分散剤ライブラリーのサイズおよび化学的多様性によって拘束されています。現在までに、研究者は、唯一のSWNTセンサーのためのような機能的に活性な分散剤を提供することができ利用できる共役、共同ブロック、生物学的および生体模倣ポリマーの表面に傷しています。ここでは、両方の単層カーボンナノチューブを分散させ、高スループットスクリーニングのための単一のSWNTセンサー分析のためのそれらの蛍光を特徴付けるための別の方法を提示します。具体的には、ポリ核酸oligomとコーティングのSWNTのための手順を概説します者透析により界面活性剤交換により両親媒性ポリマーとSWNTを官能する方法だけでなく、直接超音波処理を使用して。私たちは、例として、ローダミンイソチオシアネート（RITC-PEG-RITC）で官能（GT）15 -DNAおよびポリエチレングリコールを使用しています。私たちは、ドーパミンの検出のためのCoPhMoReセンサとして（GT）15 -DNA SWNTの使用を示します。最後に、我々は、特性評価または単一分子検出のために使用することができる単一分子センサーの測定を行うための手順の概要を説明します。

<table><tbody><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>チョル酸ナトリウム水和物</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>C6445</td><td></td></tr><tr><td>トリス塩基 (トリズマ塩基)</td> <td>シグマ・アルドリッチ</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>アミン-PEG-アミン、NH<サブ>2</サブ>-PEG-NH<サブ>2</サブ</td><td>>ナノクス株式会社</td><td>PG2-AM-5k</td><td></td></tr><tr><td>ローダミンBイソチオシアネート</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>283924</td><td></td></tr>フル<tr><td>オレセインイソチオシアネート</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>F7250</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>676853</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>N,N-ジイソプロピルエチルアミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>673811</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>5'-チオール修飾DNA&nbsp;</td><td>統合されたDNA技術</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メトキシポリエチレングリコール マレイミド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63187</td><td></td></tr><tr><td>100 kDaスピンフィルター</td><td>ミリポア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPCO 超精製単層カーボンナノチューブ</td><td>Integris</td><td>HiPco 超精製</td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>静電気防止ガン</td><td>ミルティ</td><td>ミルティゼロスタット3</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>超音波発生器</td><td>コールパー</td><td>マーCV18</td><td></td></tr><tr><td>透析カセット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>スライド-A-ライザーG2 87722</td><td></td></tr><tr><td>BSA-ビオチン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>29130</td><td></td></tr>ニュー<tr><td>トラビジンタンパク質</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン (APTES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>Axio Observer.Z1</td><td></td></tr><tr><td>キネマティックミラー</td><td>ThorLabs</td><td>KM200-E03</td><td></td></tr><tr><td>ペリスコープ</td><td>ThorLabs</td><td>RS99</td><td></td></tr><tr><td>浸漬油</td><td>ツァイ</td><td>ス イマーゾール 518f</td><td></td></tr><tr><td>100倍対物レンズ</td> ツァ<td>イス</td><td>プランアポクロマート 100X オイル、1.4NA、PH3、420791-9911-000</td><td></td></tr><tr><td>20X 対物レンズ</td><td>Zeiss</td><td>N-Achroplan 0.45 NA、420953-9901-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>Healthrow Scientific</td><td>HS159879H</td><td></td></tr><tr><td>dopamine hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>赤外線 2Dアレイカメラ</td><td>プリンストンインスツルメンツ</td><td>NIRvana</td><td></td></tr><tr><td>赤外線1Dセンサーアレイ</td><td>プリンストンインスツルメンツ</td><td>PyLoN IR</td><td></td></tr><tr><td>nIR分光器</td><td>プリンストンインスツルメンツ</td><td>SCT-320</td><td></td></tr><tr><td>平凸レンズ</td><td>ThorLabs</td><td>LA1384</td><td></td></tr><tr><td>ウェルプレート(ガラス底)</td><td>コーニング</td><td>4580</td><td></td></tr></tbody></table>

単層カーボンナノチューブ上のバイオミメティックポリマーとエンジニアリング分子認識

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

半導体単層カーボンナノチューブ(SWNT)は、近赤外線で蛍光を発する光学活性ナノマテリアルの一種で、生物学的サンプルが最も透明な光学窓と一致します。ここでは、両親媒性ポリマーと多核酸をSWNTの表面に吸着してコロナ相を操作し、低分子とタンパク質の新しい分子センサーを作成する技術について概説します。これらの機能化されたSWNTセンサーは、生体適合性と安定性を兼ね備えています。ポリマーは、SWNTおよびポリマーの直接超音波処理または界面活性剤を用いてSWNTを懸濁し、続いてポリマーによる透析によってナノチューブ表面に吸着される。これらのセンサーの蛍光発光、安定性、および標的分析物に対する応答は、吸光度および近赤外蛍光分光法を使用して確認されます。さらに、センサーをスライドガラス上に表面固定化することで、単一分子蛍光顕微鏡でポリマーの吸着と分析物の結合速度を特徴づけることができます。

単層カーボンナノチューブは、直接超音波処理により透析交換により界面活性剤及び両親媒性ポリマーの両方を使用して水溶液中に懸濁させました。 図1は、SC、RITC-PEF20-RITCを使用して中断し、鉄カルボニル触媒による方法（HiPCO法）を用いて成長させ、かつ、単層カーボンナノチューブを示している（GT）15 -DNA。 SDS（またはポリマー）とSWNTの光学密度を超音波処理した後に劇的に増加させ、遠心分離による精製（ 図1）を介して凝集し、汚染物質の除去の際に減少します。中断SWNTの濃度を定量化nmの632での吸光度の測定。 28 SWNTの懸濁液の光物理的特性は、吸光度および蛍光分光法を用いて特徴付けられます。 図2（GT）15 -DNAとRITC-PEG20-RITCを使用...

私たちは、両親媒性ポリマーとDNAを使用して近赤外蛍光単層カーボンナノチューブ(SWNT)のコロナ相を工学的に操作し、既知の認識要素を持たない分子標的のセンサーを開発するためのプロトコルを提示します。

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

この手順の全体的な目標は、生体模倣ポリマーを使用して官能基化された分子センシング用の近赤外蛍光単層カーボンナノチューブを調製することです。これらのナノセンサーは、生体組織での時間分解イメージングを可能にします。例えば、脳内のドーパミンを検出するために使用することができます。これらのセンサーの主な利点は、固有の近赤外蛍光であり、これにより組織のより深いところまでイメージングできます。合成センサーは、天然の分子認識要素を持たない分子の検出を可能にするため、この汎用的なセンサー開発方法は、低分子の検出に特に役立ちます。SWNTの核酸懸濁液を調製するには、まず核酸を0.1モルの塩化ナトリウムに溶解し、1ミリグラム/ミリリットルの濃度にします。ヒュームフードで、使い捨てヘラ、微量遠心チューブ、SWMTストックから静電気を帯電防止ガンで取り除きます。次に、20マイクロリットルの核酸溶液を980マイクロリットルの0.1モル塩化ナトリウムに加えます。次に、混合物を超音波処理する前に、得られた核酸溶液に1ミリグラムの洗浄したSWNTを加えます。超音波処理中にプローブチップを配置することが重要です。泡立ちが発生した場合は、プローブの先端の位置を変え、振幅を下げてみてください。あるいは、懸濁液が不十分なままの場合は、超音波処理または入浴超音波処理のパルスを試すことができます。直径3ミリメートルの先端を有する超音波装置を使用して、氷浴中で40%振幅で10分間溶液を超音波処理する。DNA SWNT溶液を16、100 xgで90分間2回遠心分離します。上清は、カーボンナノチューブの束や凝集体が入ったペレットを乱さないように注意しながら、集めて保管してください。ペレットは、ナノマテリアルに適した施設の有害廃棄物手順に従って廃棄してください。紫外可視分光光度計を使用して632ナノメートルの溶液吸光度を測定し、ランバート・ビールの法則に従って懸濁したSWNTのおおよその濃度と適切な希釈係数を決定します。両親媒性ポリマー懸濁液の場合、まず使い捨てスパチュラ、微量遠心チューブ、およびSWNTストックから静電気を取り除きます。ドラフト内で、5ミリリットルの2%コール酸ナトリウム溶液に5ミリグラムのSWNTを加えます。直径6ミリメートルの先端を有する超音波装置を使用して、氷浴中で40%振幅で1時間溶液を超音波処理する。上清を慎重に収集する前に、超遠心分離機を使用して4時間、150、000 xgでサンプルを遠心分離します。次に、1%重量の両親媒性ポリマーをscSWNT溶液に溶解します。次に、3.5キロダルトンの透析膜を使用して、1リットルの脱イオン水または緩衝液に対してポリマーscSWNT溶液を5日間透析します。2時間目と4時間目に水またはバッファーを交換します。UV-Vis分光光度計を使用して632ナノメートルの溶液吸光度を測定し、懸濁したSWNTのおおよその濃度を決定します。BSA-ビオチンコーティングスライドを調製するには、顕微鏡スライドと0.17mmカバーガラスを脱イオン水で洗浄し、続いてメタノール、アセトン、および最後に脱イオン水ですすいでください。きれいな顕微鏡スライド上に約5mm間隔で両面テープを数枚配置して、チャネルを作成します。長いガラスカバースリップを取り、両面テープの上部に押し付けて、チャネルをシールします。カバースリップとスライドの端が平らにならないように、必ず顕微鏡スライドの中央に配置してください。次に、1x Trisバッファー900マイクロリットルに100マイクロリットルのBSA-ビオチンストック溶液を加えて、最終濃度を1ミリグラム/ミリリットルにします。50マイクロリットルのBSA-ビオチン溶液をチャネルに流します。これには、溶液を一方の端にピペッティングし、もう一方の端で組織を使用して溶液を吸い上げます。溶液を5分間インキュベートした後、50マイクロリットルの0.1モル塩化ナトリウムで3〜5回のフラッシュを行います。次に、5ミリグラム/ミリリットルのNAV原液40マイクロリットルを960マイクロリットルの1xトリス緩衝液に希釈し、最終濃度が0.2ミリグラム/ミリリットルになるまでします。50マイクロリットルのNAV溶液をチャネルに流し、溶液を一方の端にピペッティングし、もう一方の端で組織を使用して溶液を吸い上げます。スライドを2〜5分間インキュベートした後、50マイクロリットルの0.1モル塩化ナトリウムで3〜5回のフラッシュを行います。次に、懸濁したSWNTとイメージングバッファーのストック溶液を1リットルあたり1〜10ミリグラムの濃度に希釈します。この溶液の50マイクロリットルをチャネルに流し、5分間インキュベートします。50マイクロリットルのイメージングバッファーを使用して、余分なSWNTをやさしく洗い流します。ドーパミンに対するGT15 DNA-SWNTの可逆応答を測定するには、まずセンサーコーティングされたチャンネルを蛍光顕微鏡ステージに取り付けます。100X Oil Objective とインジウムガリウムヒ素カメラを使用して、チャンネルにピントを合わせます。次に、リン酸緩衝生理食塩水に50マイクロリットルの100マイクロモルドーパミン溶液を流路に加え、蛍光強度の変化を記録します。リン酸緩衝生理食塩水を使用してドーパミン溶液を洗い流し、個々のSWNTセンサーの蛍光の変化を観察します。生体模倣ポリマーSWNTの分析物応答のウェルプレートスクリーニングを行うには、懸濁したSWNTセンサーを等量ずつ各ウェルにピペットで入れます。井戸の底を均一に覆うのに十分な量を使用してください。次に、スクリーニングライブラリーから分析物をウェルプレートにピペットで移します。各分析種を三重に調製して、井戸間の潜在的な変動や励起強度、または温度の変動を考慮します。分光器とインジウムガリウムヒ素アレイを使用して発光スペクトルを監視しながら対物レンズを上げます。対物レンズの最適な位置は、焦点面をウェル内のサンプルボリュームのほぼ中央に配置し、これは測定強度の最大値に対応する必要があります。各サンプルウェルについて、1〜10秒の曝露を記録してスペクトルを収集します。各ウェルの発光スペクトルを、追加の分析種を含まないSWNTのみを含むコントロールと比較し、蛍光応答を定量化します。GT15 DNAナノチューブセンサーの吸光度スペクトルは、異なるキラリティーの十分に分散したカーボンナノチューブに対応する複数のピークを示しています。GT15 DNAナノチューブセンサーの近赤外蛍光が示されています。興味深いことに、蛍光強度はドーパミンに応答して約2倍になります。この図では、近赤外蛍光顕微鏡により、ガラスカバースリップの表面に固定された単一のGT15 DNAナノチューブセンサーが明らかになります。今後は、例えば、分子の競合物質を含むように分析種ライブラリを拡張したり、生物学的に関連性のある濃度領域での応答の直線性をテストしたり、可逆性をテストしたりするなど、センサーをin vivoで使用するためのテストを行うことが重要です。このアプローチを習得すると、既知の分子認識要素を持たない分子からさまざまな合成センサーのライブラリを作成するために使用できます。

engineering-molecular-recognition-with-bio-mimetic-polymers-on-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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単層カーボンナノチューブ上のバイオミメティックポリマーとエンジニアリング分子認識

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