単層カーボンナノチューブ上のバイオミメティックポリマーとエンジニアリング分子認識

この手順の全体的な目標は、生体模倣ポリマーを使用して官能基化された分子センシング用の近赤外蛍光単層カーボンナノチューブを調製することです。これらのナノセンサーは、生体組織での時間分解イメージングを可能にします。例えば、脳内のドーパミンを検出するために使用することができます。

これらのセンサーの主な利点は、固有の近赤外蛍光であり、これにより組織のより深いところまでイメージングできます。合成センサーは、天然の分子認識要素を持たない分子の検出を可能にするため、この汎用的なセンサー開発方法は、低分子の検出に特に役立ちます。SWNTの核酸懸濁液を調製するには、まず核酸を0.1モルの塩化ナトリウムに溶解し、1ミリグラム/ミリリットルの濃度にします。

ヒュームフードで、使い捨てヘラ、微量遠心チューブ、SWMTストックから静電気を帯電防止ガンで取り除きます。次に、20マイクロリットルの核酸溶液を980マイクロリットルの0.1モル塩化ナトリウムに加えます。次に、混合物を超音波処理する前に、得られた核酸溶液に1ミリグラムの洗浄したSWNTを加えます。

超音波処理中にプローブチップを配置することが重要です。泡立ちが発生した場合は、プローブの先端の位置を変え、振幅を下げてみてください。あるいは、懸濁液が不十分なままの場合は、超音波処理または入浴超音波処理のパルスを試すことができます。

直径3ミリメートルの先端を有する超音波装置を使用して、氷浴中で40%振幅で10分間溶液を超音波処理する。DNA SWNT溶液を16、100 xgで90分間2回遠心分離します。上清は、カーボンナノチューブの束や凝集体が入ったペレットを乱さないように注意しながら、集めて保管してください。

ペレットは、ナノマテリアルに適した施設の有害廃棄物手順に従って廃棄してください。紫外可視分光光度計を使用して632ナノメートルの溶液吸光度を測定し、ランバート・ビールの法則に従って懸濁したSWNTのおおよその濃度と適切な希釈係数を決定します。両親媒性ポリマー懸濁液の場合、まず使い捨てスパチュラ、微量遠心チューブ、およびSWNTストックから静電気を取り除きます。

ドラフト内で、5ミリリットルの2%コール酸ナトリウム溶液に5ミリグラムのSWNTを加えます。直径6ミリメートルの先端を有する超音波装置を使用して、氷浴中で40%振幅で1時間溶液を超音波処理する。上清を慎重に収集する前に、超遠心分離機を使用して4時間、150、000 xgでサンプルを遠心分離します。

次に、1%重量の両親媒性ポリマーをscSWNT溶液に溶解します。次に、3.5キロダルトンの透析膜を使用して、1リットルの脱イオン水または緩衝液に対してポリマーscSWNT溶液を5日間透析します。2時間目と4時間目に水またはバッファーを交換します。

UV-Vis分光光度計を使用して632ナノメートルの溶液吸光度を測定し、懸濁したSWNTのおおよその濃度を決定します。BSA-ビオチンコーティングスライドを調製するには、顕微鏡スライドと0.17mmカバーガラスを脱イオン水で洗浄し、続いてメタノール、アセトン、および最後に脱イオン水ですすいでください。きれいな顕微鏡スライド上に約5mm間隔で両面テープを数枚配置して、チャネルを作成します。

長いガラスカバースリップを取り、両面テープの上部に押し付けて、チャネルをシールします。カバースリップとスライドの端が平らにならないように、必ず顕微鏡スライドの中央に配置してください。次に、1x Trisバッファー900マイクロリットルに100マイクロリットルのBSA-ビオチンストック溶液を加えて、最終濃度を1ミリグラム/ミリリットルにします。

50マイクロリットルのBSA-ビオチン溶液をチャネルに流します。これには、溶液を一方の端にピペッティングし、もう一方の端で組織を使用して溶液を吸い上げます。溶液を5分間インキュベートした後、50マイクロリットルの0.1モル塩化ナトリウムで3〜5回のフラッシュを行います。次に、5ミリグラム/ミリリットルのNAV原液40マイクロリットルを960マイクロリットルの1xトリス緩衝液に希釈し、最終濃度が0.2ミリグラム/ミリリットルになるまでします。

50マイクロリットルのNAV溶液をチャネルに流し、溶液を一方の端にピペッティングし、もう一方の端で組織を使用して溶液を吸い上げます。スライドを2〜5分間インキュベートした後、50マイクロリットルの0.1モル塩化ナトリウムで3〜5回のフラッシュを行います。次に、懸濁したSWNTとイメージングバッファーのストック溶液を1リットルあたり1〜10ミリグラムの濃度に希釈します。

この溶液の50マイクロリットルをチャネルに流し、5分間インキュベートします。50マイクロリットルのイメージングバッファーを使用して、余分なSWNTをやさしく洗い流します。ドーパミンに対するGT15 DNA-SWNTの可逆応答を測定するには、まずセンサーコーティングされたチャンネルを蛍光顕微鏡ステージに取り付けます。

100X Oil Objective とインジウムガリウムヒ素カメラを使用して、チャンネルにピントを合わせます。次に、リン酸緩衝生理食塩水に50マイクロリットルの100マイクロモルドーパミン溶液を流路に加え、蛍光強度の変化を記録します。リン酸緩衝生理食塩水を使用してドーパミン溶液を洗い流し、個々のSWNTセンサーの蛍光の変化を観察します。

生体模倣ポリマーSWNTの分析物応答のウェルプレートスクリーニングを行うには、懸濁したSWNTセンサーを等量ずつ各ウェルにピペットで入れます。井戸の底を均一に覆うのに十分な量を使用してください。次に、スクリーニングライブラリーから分析物をウェルプレートにピペットで移します。

各分析種を三重に調製して、井戸間の潜在的な変動や励起強度、または温度の変動を考慮します。分光器とインジウムガリウムヒ素アレイを使用して発光スペクトルを監視しながら対物レンズを上げます。対物レンズの最適な位置は、焦点面をウェル内のサンプルボリュームのほぼ中央に配置し、これは測定強度の最大値に対応する必要があります。

各サンプルウェルについて、1〜10秒の曝露を記録してスペクトルを収集します。各ウェルの発光スペクトルを、追加の分析種を含まないSWNTのみを含むコントロールと比較し、蛍光応答を定量化します。GT15 DNAナノチューブセンサーの吸光度スペクトルは、異なるキラリティーの十分に分散したカーボンナノチューブに対応する複数のピークを示しています。

GT15 DNAナノチューブセンサーの近赤外蛍光が示されています。興味深いことに、蛍光強度はドーパミンに応答して約2倍になります。この図では、近赤外蛍光顕微鏡により、ガラスカバースリップの表面に固定された単一のGT15 DNAナノチューブセンサーが明らかになります。

今後は、例えば、分子の競合物質を含むように分析種ライブラリを拡張したり、生物学的に関連性のある濃度領域での応答の直線性をテストしたり、可逆性をテストしたりするなど、センサーをin vivoで使用するためのテストを行うことが重要です。このアプローチを習得すると、既知の分子認識要素を持たない分子からさまざまな合成センサーのライブラリを作成するために使用できます。