血清やフィーダーフリーのマウス胚のコレクションは、無細胞アプローチのための細胞馴化培地を幹

このプロトコルの全体的な目標は、血清およびフィーダーフリー培養条件下でマウス胚性幹細胞から馴化培地を収集し、この培地の生物学的機能を特徴付けることです。この手順は、マウス胚性幹細胞から分泌される可溶性因子の抗老化活性に関する洞察を提供し、加齢性疾患に対する安全で無細胞の治療アプローチの開発に役立てます。この手順を実演するのは、私の研究室の研究教授であるYun-Ui Bae博士です。

生物学的安全性フードで、マウス胚性線維芽細胞またはMEF細胞培養物を、15センチメートルの細胞培養皿でマイトマイシンCを添加した20ミリリットルのMEF培地で、摂氏37度、二酸化炭素5%で2時間処理します。インキュベーションの終わりに、細胞をPBSで3回洗浄し、3ミリリットルのトリプシンEDTAで摂氏37度で3分間それらを剥離します。細胞がプレートの底から持ち上げられたときに、6ミリリットルの新鮮なMEF培地でトリプシンを中和します。

遠心分離により細胞を回収した後、ペレットを5ミリリットルのMEF培地に再懸濁し、新鮮なMEF培地で10cmの培養皿ごとに10〜6回目の不活化MEFを2回プレート化する。フィーダー細胞を24時間培養します。次に、MEF培地をマウス胚性幹細胞培地と交換し、6回目のマウス胚性幹細胞をフィーダーに2回10回播種し、少なくとも48時間の共培養を行います。

生物学的安全性フードで、マウス胚性幹細胞のプレートを5ミリリットルのPBSですすぎ、先ほど示したようにトリプシンとEDTAで細胞を剥離します。遠心分離により細胞を採取した後、幹細胞ペレットを5ミリリットルの新鮮幹細胞培地に再懸濁し、新鮮胚性幹細胞培地中の皿1ミリリットルの細胞をゼラチンでコーティングした5つの細胞培養皿に播種します。培養物が80〜85%のコンフルエント度に達するまで、細胞をインキュベーターに戻します。

次に、プレートあたり少なくとも8ミリリットルのPBSで細胞をすすぎ、10分間の洗浄を3回行い、続いて減量血清培地で24時間のインキュベーションを行います。24時間以内に、上清を50ミリリットルの円錐管に移し、遠心分離します。続いて、0.2マイクロメートルのボトルトップストレーナーによるろ過が行われます。

老化関連ベータガラクトシダーゼアッセイによる胚性幹細胞馴化培地の効果をテストするには、ヒト真皮線維芽細胞培地の6ウェルプレートにヒト真皮線維芽細胞を播種します。摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートした後、培地の半分を新鮮なマウス胚性幹細胞馴染培地と交換し、さらに72時間培養します。培養の3日目に、ウェルあたり2ミリリットルのPBSで細胞をすすぎ、30秒の洗浄を2回行います。

次に、細胞を3.7%パラホルムアルデヒドに室温で5分間、ドラフトで固定します。固定後、先ほど示したように、細胞を2ミリリットルのPBSで2回洗浄し、1〜2ミリリットルのSAベータガロン溶液で細胞を1〜2ミリリットルで17時間半、二酸化炭素なしで摂氏37度で標識します。染色期間の終わりに、先ほど示したように細胞をPBSで2回洗浄します。

その後、Eosenで室温で5分間対比染色します。PBS洗浄をもう1セット行った後、光学顕微鏡で細胞を100倍の倍率で画像化します。細胞周期解析では、新鮮なヒト真皮線維芽細胞培地中の6cmの細胞培養皿に、ウェルあたり10〜4番目のヒト真皮線維芽細胞を8回播種し、摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベーションします。

翌朝、培地の半分をマウス胚性幹細胞馴染培地と交換し、細胞をインキュベーターに戻します。24時間後、トリプシンEDTA解離により細胞を回収し、続いて1ミリリットルのPBS溶液で2回洗浄します。2回目の洗浄後、ペレットを100マイクロリットルの冷たいPBS溶液に再懸濁します。

次に、ボルテックスしながら、200マイクロリットルの冷たいエタノールにドロップワイズアプリケーションで細胞を固定します。細胞を摂氏4度で少なくとも1時間保存します。次に、新鮮なPBS溶液で洗います。

2回目の遠心分離後、ペレットを250マイクロリットルのクエン酸ナトリウム緩衝液にRNaseを添加したもので、二酸化炭素を含まない摂氏37度で30分間処理します。インキュベーションの終了時に、ヨウ化プロピジウムを含むクエン酸ナトリウム緩衝液250マイクロリットルで細胞を標識し、20分間保存します。次に、フローサイトメトリーにより各サンプルの細胞周期のステージを評価します。

定量的逆転写酵素PCR解析では、RNA抽出キットを使用して、メーカーのプロトコルに従ってマウス胚性幹細胞馴化培地で処理したヒト真皮線維芽細胞から全RNAを単離します。分光光度計を使用して、抽出された総RNAを定量します。次に、オリゴデオキシチミジンプライマーとM-MLV逆転写酵素を含む反応混合物をメーカーのプロトコルに従って調製します。

次に、反応混合物を含むPCRチューブに全RNAの1マイクログラムを加えます。最後に、グリーンPCRマスターミックスと適切な遺伝子プライマーを使用して、リアルタイムPCRマシンでCDNAの増幅を測定します。MEFフィーダー細胞層上の正常なマウス胚性幹細胞培養条件下で増殖したマウス胚性幹細胞は、楕円形と光沢のある外観を示します。

一方、無血清およびフィーダーフリー培養条件下で増殖したマウス胚性幹細胞は、平坦で不規則な形態を示します。マウス胚性幹細胞馴化培地による老化ヒト真皮線維芽細胞の治療は、老化関連ベガラクトシダーゼ陽性細胞の数を減少させます。さらに、これらの細胞の細胞周期解析により、マウス胚性幹細胞馴化培地処理は、S期およびG2/M期の細胞数を劇的に増加させ、G0/G1期の細胞数を減少させることを明らかにしました。

さらに、マウス胚性幹細胞馴化培地処理は、老化関連遺伝子および老化表現型に関連する分泌性サイトカインの発現を減少させます。この手順を試みる際には、長時間のインキュベーションにより細胞の自己消化または飢餓によるアポトーシスの可能性が高まるため、24時間後に血清とフィーダーフリー培地を収集することを覚えておくことが非常に重要です。このビデオを見れば、セルフリーアプローチのための血清およびフィーダーフリーマウス胚性幹細胞馴化培地の収集方法について十分に理解できるはずです。

パラホルムアルデヒドなどの試薬の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、この試薬をドラフトで取り扱うなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。