ヒト子宮頸管ガンマ・デルタT細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

ここでは、上皮内γデルタT細胞の分析のためのヒト子宮頸管内上皮内リンパ球を得るための単離方法について説明します。このプロトコルは、磁気ビーズまたは細胞選別による子宮頸管内γデルタT細胞の精製に拡張できます。

この手順の全体的な目標は、型破りな上皮内細胞であるγδT細胞集団をヒト子宮頸部ブラシサンプルから分離し、特徴付けることです。この方法は、子宮頸管上皮内コンパートメント内の免疫イベントを理解する上で重要な質問に答えるのに役立ち、感染を予防するための効果的な戦略の設計を支援します。この技術の主な利点は、in vitroで子宮頸管内上皮内γデルタTリンパ球を研究するための強力で効率的なツールを提供することです。

その手順を実演するのは、私の研究室の上級研究員であるローラ・ロメロです。採取後すぐに、サイトブラシの入ったチューブを氷の上に置きます。収集から1時間以内に、サイトブラシを含むチューブを10秒間4パルスボルテックスします。

次に、チューブを遠心分離し、パレットを乱さないようにブラシを慎重に取り外します。次に、1ミリリットルのIMDM培地を細胞に加え、チューブを氷の上に置きます。サイトブラシを50ミリリットルの円錐管の100ミリメートルセルストレーナーの上に置き、20ミリリットルの新鮮なIMDMでブラシを洗います。

洗浄液を遠心分離します。パレットを1ミリリットルの新鮮なIMDMに再懸濁し、元のサイトブラシ収集チューブ内の細胞と洗浄してプールします。フローサイトメトリーにより子宮頸部内細胞を解析するには、5ミリリットルのチューブあたり100マイクロリットルのファックス緩衝液中に1〜3回10〜5番目の細胞を分注し、目的の抗体および生存率色素で細胞を標識し、暗所で摂氏4度で30分間

インキュベーションの終わりに、キットバッファーの1ミリリットルで細胞を洗浄します。細胞をスピンダウンした後、上清を完全にデカントします。ビーズと適切なIgGコントロール抗体を使用して、コンペンセーションコントロールを設定します。

次に、最初のチューブをロードし、前方散布図で全子宮頸部細胞集団にゲートを設定し、続いて細胞ダブレットを除外します。死細胞を生存率色素の発現に応じて除外し、生細胞CD45陽性細胞およびCD3陽性細胞をゲーティングします。ガンマデルタ1およびガンマデルタ2陽性細胞は、ガンマデルタTCRを発現するCD3陽性細胞の亜集団として定義されます。

磁気ビーズ分離によりγδT細胞を単離するには、40マイクロリットルのTCRγδMicroBeadキットバッファーに、新たに採取した子宮頸部細胞の10倍から7倍まで再懸濁します。2段階染色プロトコルの製造元の指示に従って、抗TCRγδハプテン抗体で細胞を標識し、続いて抗ハプテンFITC標識MicroBeadsを摂氏4〜8度で15分間標識します。インキュベーションの終わりに、キットバッファーの1ミリリットルで細胞を洗浄し、上清を完全にデカントします。

500マイクロリットルのキットバッファーに細胞を再懸濁し、適切なセパレーター磁石にセットされた磁気ビーズカラムに細胞懸濁液を直接塗布し、新しいチューブにフロースルーを収集します。すべての細胞がカラムを通過したら、500 μリットルの新鮮なバッファーでカラムを3回洗浄し、収集した細胞と洗浄液をプールします。γデルタT細胞を回収するには、カラムを円錐管に移し、カラムプランジャーを使用してカラムからT細胞を1ミリリットルの新鮮なバッファーで洗い流します。

蛍光活性化細胞ソーティングによりγδT細胞を単離するには、先ほど示したように抗体パネルで細胞を生存率色素で標識します。次に、細胞を生存色素、およびCD45、CD3、およびガンマデルタ陽性に従って選別します。T細胞を発現するγδV1のユニークな集団は、ヒト子宮頸管内細胞サンプルで容易に検出できます。

ゲート型CD3陽性γデルタ1陽性細胞の詳細な表現型解析により、これらの細胞の大部分がCD4およびCD8陰性であることが明らかになりました。子宮頸管内細胞の磁気ビーズ分離は、ちょうど示したように、これらのTCRガンマデルタ細胞のほぼ98%の純粋な集団の精製をもたらす。このレベルの純度は、蛍光活性化細胞ソーティングによっても達成でき、子宮頸管内γδT細胞の単離にどちらの技術も使用することが検証されます。

興味深いことに、女性のHIV感染患者と健康なドナーコントロールから採取された子宮頸管内上皮細胞であるγデルタT細胞の分析は、HIV感染者におけるこれらの重要な細胞の数と生存率がわずかに減少することを示しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2〜3時間で完了できます。この手順を試みる際には、サンプルを迅速に処理し、手順全体を通じて細胞を氷上に保持して、良好な細胞生存率を維持することを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、高感度スループットマルチプレックスPCRと組み合わせたシングルセルソーティングなどの他の方法を実行して、子宮頸管上皮内コンパートメント内の炎症経路およびシグナル伝達経路に関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、HIVおよび感染症の分野の研究者が粘膜の脆弱性の新規細胞マーカーを探求する道を開きました。このビデオを見た後、ヒト子宮頸部ブラシサンプルから上皮内リンパ球を調製する方法を十分に理解しているはずです。