ヒト子宮頸管ガンマ・デルタT細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

本手順の全体的な目的は、ヒトの子宮頸管ブラシ検体から、非典型的な上皮内細胞であるγδ T細胞集団を単離し、特性解析することです。この手法は、子宮頸管上皮内コンパートメントにおける免疫イベントを理解するための重要な疑問に答えるのに役立ち、感染症を予防するための効果的な戦略の設計を支援します。本手法の主な利点は、子宮頸管上皮内γδ Tリンパ球をin vitroで研究するための、強力かつ効率的なツールを提供することです。

手順の実演は、私の研究室のシニアリサーチアソシエイトであるLaura Romeroが行います。採取後すぐに、サイトブラシが入ったチューブを氷上に置いてください。採取から1時間以内に、サイトブラシが入ったチューブを10秒間のボルテックスで4回処理します。

次に、チューブを遠心分離し、パレットを乱さないように注意してブラシを取り除きます。続いて、細胞に1 mLのIMDM培地を加え、チューブを氷上に置きます。50 mLコニカルチューブに入れた100 mmセルストレーナーの上にサイトブラシを載せ、20 mLの新鮮なIMDMでブラシを洗浄します。

洗浄液を遠心分離します。ペレットを1 mLの新鮮なIMDMで再懸濁し、元のサイトブラシ採取チューブ内の細胞とともに洗浄液と合わせてプールします。フローサイトメトリーで子宮頸管細胞を解析するために、5 mLチューブ1本につき1～3 × 10⁵個の細胞を100 µLのfaxバッファーに分注し、目的の抗体および生存率染料で、4 °Cの暗所にて30分間ラベルします。

インキュベーション終了後、キットバッファー1 mLで細胞を洗浄します。細胞を遠心分離した後、上清を完全に除きます。ビーズと適切なIgGコントロール抗体を使用して、補正コントロールを設定します。

次に、最初のチューブをロードし、前方散乱光（FSC）対側散乱光（SSC）プロットを用いて全子宮頸管細胞集団にゲートを設定し、続いて細胞のダブレットを除去します。生存率染色の発現に基づいて死細胞を除外した後、生存しているCD45陽性かつCD3陽性の細胞にゲートを設定します。γδ1陽性細胞およびγδ2陽性細胞は、γδ TCRを発現するCD3陽性細胞のサブポピュレーションとして定義されます。

磁気ビーズ法を用いてγδ T細胞を単離するために、採取したばかりの1 × 10⁷個までの子宮頸管内細胞を40 µLのTCR gamma delta MicroBeadキットバッファーで再懸濁します。メーカーが推奨する2段階染色プロトコルに従い、細胞を抗TCR γδハプテン抗体で標識し、続いて抗ハプテンFITC結合MicroBeadsを用いて4～8 °Cで15分間反応させます。インキュベーション終了後、細胞を1 mLのキットバッファーで洗浄し、上清を完全に除きます。

細胞を500 µLのキットバッファーで再懸濁し、その細胞懸濁液を適切なセパレーターマグネットにセットした磁気ビーズカラムに直接適用し、通り抜けた液を新しいチューブに回収します。すべての細胞がカラムを通過したら、500 µLの新鮮なバッファーでカラムを3回洗浄し、その洗浄液を回収した細胞と合わせてまとめます。γδ T細胞を回収するために、カラムをコニカルチューブに移し、カラムプランジャーを使用して1 mLの新鮮なバッファーでT細胞をカラムから洗い出します。

蛍光活性化細胞分級法（FACS）を用いてガンマデルタT細胞を単離するには、先に示した抗体パネルに従って、生存率染料で細胞を標識します。次に、生存率染料、およびCD45、CD3、ガンマデルタの陽性に基づいて細胞を分級します。ヒトの子宮頸管細胞サンプルでは、ガンマデルタV1を発現する特有のT細胞集団を容易に検出できます。

ゲートしたCD3陽性γδ1陽性細胞の詳細な表現型解析により、これらの細胞の大部分がCD4およびCD8陰性であることが明らかになります。先に示した通り、子宮頸管細胞を磁気ビーズ法で分離すると、これらTCR γδ細胞がほぼ98%という高純度で精製されます。このレベルの純度はフローサイトメトリー（FACS）によっても達成可能であり、子宮頸管γδ T細胞の単離において、どちらの手法も有効であることが検証されています。

興味深いことに、HIV感染女性患者および健康なドナー対照群から採取した子宮頸管内上皮細胞中のγδ T細胞の解析では、HIV感染者のにおいて、これらの重要な細胞の数と生存率がわずかに低下していることが示されています。この手法に習熟すれば、適切に実施することで2〜3時間で完了させることができます。本手順を行う際は、良好な細胞生存率を維持するために、サンプルを迅速に処理し、全工程を通じて細胞を氷上で保持することが重要です。

この手順に続き、高感度スループットマルチプレックスPCRを組み合わせたシングルセルソートなどの他の手法を用いることで、子宮頸管上皮内コンパートメントにおける炎症およびシグナル伝達経路に関するさらなる疑問を解消することが可能です。この技術の開発により、HIVおよび感染症分野の研究者が粘膜脆弱性の新規細胞マーカーを探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、ヒト子宮頸管ブラシ検体から上皮内リンパ球を調製する方法について深く理解することができたはずです。