誘導結合プラズマ - - レーザーアブレーションによる脳組織におけるイメージング金属質量分析法（LA-ICP-MS）

本手法の全体的な目的は、レーザーアブレーション誘導結合プラズマ質量分析法を用いて、組織切片における金属の空間分布を定量化することです。この手法は、特に金属生化学が疾患の病理に関与している状態において、基礎生物学および疾患研究の両方における重要な疑問に答えることができます。この技術の主な利点は、従来のバルク金属分析手法では失われていた金属の空間情報を保持できる点にあります。

この手法の意義は、細胞死が見られる脳領域における金属の変化をモニタリングできるため、神経変性疾患の治療および診断へと展開されます。一般的に、この手法に不慣れな人は、長期にわたる複雑な実験のセットアップに苦心することがあります。各ステップを特定の順序で実行する必要があるため、実験の設計とデータ解析は困難を伴いやすく、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。

まず、脳組織サンプルおよびすべてのマトリックスマッチした組織標準試料をレーザーアブレーションチャンバー内に配置します。サンプルがLACCDカメラの被写界深度内にあることを確認してください。チャンバーのドアを閉め、ネジを手で締め付けます。

次に、ICPMSソフトウェアでキャリアガスのバルブを開き、流量を1.2 liters per minuteに設定します。LAソフトウェアで、キャリアガスを用いてアブレーションセルのパージを30分間行います。2ボリュームのアブレーションセルの場合、セル内の残留空気量を減らすため、10分ごとにサンプルステージをチャンバーの各コーナーに移動させてください。

ICPMSの電源を入れ、2時間ウォームアップさせます。装置のウォームアップ中に、レーザーアブレーションソフトウェアを用いて、1つ目の組織標準物質の表面に約3 mmの長さのアブレーションラインを描きます。アブレーションラインをクリックし、デフォルトのビーム径、スキャン速度、および放射フルエンスを設定します。

このラインを6回複製し、ビーム径に相当する間隔を空けて配置します。各標準試料に対してもこの操作を繰り返します。次に、ラインツールを使用して、標準試料と同じパラメータを用い、サンプルの左上隅から最も幅の広い箇所にかけて、サンプルの上にアブレーション領域を描画します。

標準試料で使用したときと同じ間隔で、サンプル全体を完全にカバーするように必要に応じてラインを複製します。次に、サンプルのスキャン後20時間以内、または各サンプルの間に、標準試料の間欠スキャン用のラインセットを引きます。実験の最後に標準試料のスキャンを追加してください。

ラインの長さとスキャン速度に基づき、試料および標準ラインの分析時間を決定します。次に、ICPMSソフトウェアで新しいバッチを作成し、「時間分解分析（time resolved analysis）」を選択します。目的の質量電荷比の値を選択し、1サイクルの合計積分時間が0.25秒になるように、各比率の積分時間を設定します。

バッチを保存します。標準的なバッチの場合、レーザーのウォームアップおよび洗浄時間を考慮し、各ラインの分析時間に15秒のバッファを追加して入力してください。各標準ラインの取得設定を含むサンプルランリストを作成します。

サンプルバッチについては、標準バッチを複製し、サンプルのアブレーションパターンに合わせて時間および取得回数を適宜調整します。ICPMSのウォームアップが完了したら、最初のバッチをキューに追加し、ソフトウェアがLA装置からのトリガー待機状態にあることを確認してください。その後、LAソフトウェアでレーザー電源をオンにし、レーザーのウォームアップ時間とウォッシュアウト時間を設定します。

レーザーシーケンスを開始し、アブレーション後にICPMSが正しくデータ収集を開始することを確認します。データが収集されたら、CSVファイルから標準試料のデータを抽出します。トラクションのベースライン補正を行い、バックグラウンド信号を除外してください。

組織標準試料にある穴によって生じた信号の低下を特定します。これらの低信号領域をマスクし、その後、データをスプレッドシートとしてエクスポートします。特定された各元素について、CPSからPPMへの変換係数を算出します。

この工程を各標準試料について繰り返します。次に、定量的画像構築ソフトウェアを開き、CSVファイルからサンプルデータをインポートします。背景補正を適用するために、背景のいくつかの領域を選択します。

グラフ編集ツールを選択し、画像を右クリックして「画像の外観を変更（modify image appearance）」を選択します。Zの最初の色を大きな負の値に変更し、「完了（done）」をクリックして背景信号を強調します。次に、標準物質（standards）タブで、各標準物質のCPS PPM補正係数を入力し、「実行（go）」をクリックします。

データタブでデータブラウザを開き、補正済み画像ファイルを右クリックして「new image」をクリックします。「modify image appearance」ウィンドウを開き、カラーテーブルとスケールを設定します。「add annotation」ユーティリティを使用して、画像にカラースケールを配置します。

カラースケールウィンドウでカラースケールを調整します。画像の着色と注釈付けが完了したら、画像を別のプログラムにコピー＆ペーストするか、画像構成ソフトウェアから画像をエクスポートします。ROIツールを有効にするには、解析パッケージから画像処理を選択し、画像を選んでください。

「Image」タブで「ROI」をクリックし、「Start ROI Draw」を開始します。関心領域を選択した後、「Finish ROI」をクリックします。「Image」タブで「Stats」をクリックし、ROIデータを取得します。

データをスプレッドシートにコピーして貼り付け、ROIが追加されるたびに必ず保存してください。必要に応じてこのプロセスを繰り返します。この手法を用いて、野生型マウス脳の金属含有量および分布を調査しました。

ここでは、炭素、マグネシウム、およびリンの分布を、1秒あたりのカウント数で示しています。マンガン、銅、鉄、および亜鉛については定量画像を示しています。炭素の分布を内部標準として使用しました。

鉄は中脳と歯状回に最も多く分布していました。亜鉛は皮質領域に最も多く分布していました。これらの画像から得られた情報は、金属結合タンパク質の発現と機能の追跡に利用できます。習得すれば、適切に準備することで、数日間にわたる実験を1時間以内にセットアップすることが可能です。

この手順を実施する際は、アブレーションラインとICPMSのデータファイルを同期させることが重要です。本手順の後、隣接切片を用いた組織学的染色などの追加手法を行うことで、特定のタンパク質と金属の共局在といった追加情報を得ることが可能です。私たちは当初、パーキンソン病の実験モデルにおいて金属レベルがどのように変化するかを検討したいと考え、この手法を考案しました。

この手法は、神経変性に関する知見を得るために使用できるだけでなく、ヒト組織やさまざまな生物学的マトリックスを含む、異なる組織タイプや疾患状態にも適用可能です。この技術の開発により、神経科学分野の研究者が、ヒト検体および疾患の動物モデルの両方において、金属レベルがどのように変化するかを調べる道が開かれました。このビデオを視聴することで、レーザーアブレーションICPMS実験のセットアップ方法について十分な理解を得られるはずです。

生物学的材料の取り扱いは極めて危険な場合があるため、本手順の実施中は、適切な個人用保護具の着用などの予防措置を必ず講じてください。