頭頸部扁平上皮癌における神経周囲の浸潤のためのモデル

この実験プロトコルの全体的な目標は、頭頸部扁平上皮がんの神経周囲浸潤に影響を与える複数の治療条件を迅速に評価し、非常に高いアッセイ成功率と再現性を実現することです。この方法は、頭頸部がん細胞の神経周囲浸潤に影響を与える要因は何かなど、頭頸部腫瘍学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、1匹のマウスから多数のアッセイを比較的短時間で迅速かつ再現性よく実行できることです。

後根神経節(DRG)の解剖手順を開始する前に、V底96ウェルプレートの少なくとも40ウェルに新鮮な室温の培地を追加します。次に、細いハサミを使用して、尾の付け根からマウスの頭まで脊柱に沿って縦方向に切開します。そして、仙骨の背骨の下の組織を横方向に分割し、脊椎の両側を頭蓋骨の基部まで解剖します。

顕微鏡下で標本を移し、脊柱の頸部を低電力で観察します。白い脊髄は、さまざまな量の脊髄周囲筋と軟組織に囲まれた骨輪の中央に見られます。微細なスプリングハサミを使用して、最初の2〜3個の椎体の背側、または上側を分割します。

次に、ハサミのスプリングアクションを使用して、この最初の骨の切り傷を開き、椎体の解剖が正中線で発生することを確認します。仙骨の背骨に向かって少しずつ続け、椎体の腹側または下側の側面に同じ切り傷がある脊椎を二等分します。片方の半脊椎を脇に置き、脊椎の残りの半分を下向きにして、脊髄を所定の位置に設置した滅菌プレートに移します。

また、2本の18ゲージの針を使用して、半脊椎の両端をポリスチレン解剖プラットフォームに固定します。次に、狭い頸部の端から始めて、脊髄を約4つの椎骨レベルからそっと剥がします。感覚神経がDRGに挿入される領域で、顕微鏡の鉗子で周囲の筋膜を優しくつかみ、顕微鏡のスプリングハサミを使用してこの筋膜と他の神経組織をトリミングしてDRGを解放します。

倍率を上げて、スプリングハサミを使用して末梢神経をDRGにできるだけ近づけて切断し、組織を解放し、近位枝をトリミングします。次に、浮遊神経線維または筋膜付着物のDRGをトリミングし、分離された組織を96ウェルVボトムプレートの1つのウェルに配置します。半固体マトリックス液滴を調製するには、1つのガラス製ウェルボトムプレートを氷から手術顕微鏡下の氷ブロックに移します。

10マイクロリットル以下のピペットの先端を45度の角度でガラスに直接置き、1.5マイクロリットルのマトリックス液滴をガラスに慎重に分注します。マトリックスがプレートにかみ合うように、ピペットの先端をゆっくりとガラスから離します。プレートの四隅にマトリックスの液滴を1滴ずつ堆積させ、プレートを室温面に約1分間移します。

マトリックスがわずかに硬くなったら、プレートを氷のブロックに戻し、閉じた顕微鏡の鉗子を使用して左手でDRGをそっとすくい取ります。右手を使って、神経組織を21ゲージの針の先端に慎重に移し、針を使用してDRGをマトリックス液滴の中央に穏やかに挿入します。DRGは、針で中央に配置するためにマトリックスに簡単に解放する必要があります。

DRGピースを4つの液滴のそれぞれに挿入した後、プレートを摂氏37度のインキュベーターに3分間入れます。すべてのDRGが埋め込まれたら、プレートを一度に1つずつ少し角度で保持し、10%FBSを添加した4ミリリットルのDMEMをプレートにゆっくりと追加します。プレートをさらに48〜72時間インキュベーターに戻します。

神経突起がマトリックスの端までの道のりの少なくとも75%に達したら、マトリックスDRGユニットを取り外すことなく、ウェルから培地を吸引します。次に、200マイクロリットルのピペットを使用して、滑らかなトリガーを使用して、培地1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞の3倍の2滴を各マトリックスDRGアッセイ上に置きます。そしてプレートをインキュベーターに戻します。

1時間後、ガラス底プレートの側壁に沿って10%FBSを含む4ミリリットルのDMEMを静かに加え、プレートを次の顕微鏡評価までインキュベーターに戻します。それらを解剖し、マトリックス液滴内に配置した後、アッセイの外観は、ここに示すマトリックス埋め込みDRGのようになるはずです。DRGは完全な円形ではなく、マトリックス液滴の中央にあるため、神経突起が360度で成長する可能性があることに注意してください。

めっき直後、頭頸部扁平上皮がん細胞はマトリックスの周りに円周リングを形成し、次の2〜3日で神経突起に沿って拡大します。マトリックスのみを含むブランクコントロール液滴に播種された細胞は、マトリックスの周りで活発に分裂しますが、上部に侵入したり伸びたりすることはありません。がん細胞の神経周囲浸潤を定量化するために、アッセイの画像は、1本の垂直線と1本の水平線を介して4つの象限に分割されます。

次に、各象限で観察された神経周囲浸潤拡張ごとに一連のポイントが採点され、異なるがん細胞株間の神経突起に沿ったがん細胞の内部成長を比較できます。習得すると、後根神経節分離技術は、適切に実行されれば2時間以内に完了することができます。この手順を試みる際には、挫傷がアッセイの失敗の最も一般的な理由であるため、後根神経節の過度の取り扱いを最小限に抑えることが重要です。

この手順に続いて、神経周囲浸潤のメカニズムを研究することができ、このタイプの軟部組織浸潤に対する標的療法の開発につながる可能性があります。このビデオを見た後、マウスから後根神経節を解剖する方法と、神経周囲浸潤を調べるためのアッセイを設定する方法について十分に理解しているはずです。