Name: 頭頸部扁平上皮癌における神経周囲の浸潤のためのモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぶ 頭頸部扁平上皮癌における神経周囲浸潤の評価法。マウス背根神経節を用いて、高い再現性と成功率で複数の処置条件を迅速に検証できる。この手法はがん細胞の神経浸潤メカニズム解明と治療戦略開発に貢献する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、R21助成金「頭頸部癌における神経周囲浸潤のメカニズム」およびNCI T32トレーニング助成金「頭頸部腫瘍学のポスドク研究研修(2T32CA060397-21)」を通じてNIHからの資金提供によって全体的に支援されました。Richard Steiman医学博士および研究室スタッフに感謝します。

1.培養培地の調製と料理（10分） <ol><li> 100μLを96ウェルV底プレートのウェルに、10％ウシ胎児血清（FBS）を有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を加えます。 </li><li> 20℃の冷凍庫から半固体マトリックスの約100μLの前等分し、バイアルを取り外し、氷の上に直接配置します。 注：半固体マトリックスは、その後の工程のために必要である、氷の上に液体状態に達するのに約30分かかりますので、この前後根神経節に（DRG）の収穫を行います。すべての回で、氷上で半固体マトリックスを維持するために失敗すると、低品質のマトリックス液滴を発生します。 </li><li>ラベルグラスボトム永久インクでの培養プレート、プレートの下面に四隅のそれぞれに一意の識別子を作成します。プレート表面を冷却するために氷の上にプレートが右サイドを置きます。 注：各マウス利回り32から40 DRGので、1から40にラベルを付けそれはプレチルパイする必要はありませんチルドのヒントは、潜在的に、マトリックス液滴を配置する行列の一貫性の違いを導入するコースを渡って温めますよう、ヒントをペット。 </li></ol>マウスDRGの2解剖（45分） <ol><li>例えばCO 2室と開胸の使用を通じてなど、特定の研究室プロトコル、あたりなどの無胸腺ヌードマウスを安楽死させます。 </li><li>解剖エリアと顕微鏡を設定します。 15-または50-mLコニカルチューブ用ポリスチレン容器の、きれいな滅菌し、平らな底面を使用してください。 注：また、彼らは、使い捨て、安価であるため、解剖面として使用するのに適しており、ピンまたは針を使用して脊柱の固定を可能にします。唯一の滅菌機器や針を使用しています。 </li><li>自然なビジョンの下では、直線状または曲線状の微細なハサミを持つマウスの頭に尾の付け根から背骨に沿って縦切開を行います。 </li><li> SACRの下に横方向に分割する同じハサミを使用してくださいアル背骨。背骨の両側にハサミを使用して頭蓋底までのすべての方法を分析。この時点で、頸椎が頭蓋できるだけハサミで横に切開されていることを確認してください。 </li><li>低電力で手術用顕微鏡下で脊柱の子宮頸終了を確認します。白い脊髄は傍脊柱筋群および軟組織の可変量に囲まれている骨リングの真ん中には明らかです。 </li><li>微視的な春のはさみで3椎体 - 背側または第2の優れた面を分割します。ハサミのバネ作用を使用して、椎体の解剖は正中線で発生したことを確実にするために、この初期の骨のカットを開きます。仙骨に向かって少しずつ続行し、次に椎体の腹側または下面に同一のカットを完了することによって、背骨を二分します。 注：下のDRG収率をもたらす骨脊柱の正中切開を確保するために失敗しました。 </li><li> THIでS点は、脊柱を二等分に分割されています。代わりに脊髄で、脇1ヘミ背骨を置き、滅菌プレートに下向きに。 注：DRGを脊髄に深いような場所に脊髄を残して、乾燥からのDRGを防ぐことができます。 </li><li>ポリスチレン解剖プラットフォーム上の2つの18ゲージの針を他のヘミ背骨の両端を固定します。子宮頸終わりに出発し、穏やか約4椎レベルから脊髄をバック剥離、（背骨が狭いので明らかである、DRGは互いに接近している、とリブ挿入があります）。 </li><li> DRGを接続する感覚神経（通常は2）を確認します。神経がDRGに挿入する領域で、静かに微細な鉗子で周囲の筋膜を把握します。 DRGを解放するために微細な春のはさみでこの筋膜およびその他の神経組織を解剖し、トリム。穏やかな後退は、骨、脊椎内のその位置からDRGをもたらすでしょう。 注：増加この段階で、顕微鏡力が有益です。 DRGへの圧挫損傷は大幅に神経突起の成長を制限します。これは、直接DRGを把握することはありませんすることにより、むしろ周囲の筋膜を把握することにより回避されます。 </li><li> DRGを解放するために微細な春のはさみで（DRGは一般的に解剖ビューに深い相対的なものである1末梢神経を持っている）、末梢神経をカット。 注：それは神経が終了し、DRGはので、この時点でのDRGのできるだけ近くに、このカットを作り、緊張にしながら、始まりが理想的である把握するのが最も簡単です。この遠位枝が切断されると、近位の枝も同様にトリミングされています。 </li><li>微視的な春のハサミでの浮遊神経線維や筋膜の添付ファイルのDRGをトリミング。適切な単離後、96ウェルV底プレート内の室温の培地にDRGを配置します。 注：プレートの下に暗い背景を配置すると、簡単にサブミリメートルホワイトのDRGを可視化することができます。唯一のEAC内の1つのDRGを置きます時間だけでなく、このように、それらは後の工程でより容易に説明することができます。 </li><li>すべての方法1ヘミ背筋がこのプロセスを繰り返し、その後、他の。 40から32を合計20のDRG、 - それぞれの側は、16が得られます。 注：これより少ないたDRGがある場合、脊椎の解剖は、さらに頭または尾を行う必要があります。 DRGを1が尾側に進行するよう、ますますあまり明確になります。 </li></ol>半固体マトリックス液滴の調製（プレートあたり&lt;1分） <ol><li>氷から一方のガラスだけでなく、底板を外し、手術用顕微鏡下に氷のブロックの上に置きます。マトリックスのアリコートは、すべての回で氷の上に残っていることを確認します。 </li><li>よくガラスの端からの液滴自体と少なくとも同じ偉大な距離を残して、2-μLまたは10μLのマイクロピペッターでガラス底板の四隅に行列の1.5-μLの液滴を配置します。 <ol><li>上に直接ピペットの先端を置き45度の角度でガラス。ゆっくりと行列をピペット。行列が板に従事した後、ゆっくりとガラス底部から離れます。 注：行列とガラスとの間の表面張力が完璧な半球を毎回作成する必要があります。 </li><li>行列の液滴への空気の不慮の注入は、行列の液滴の直径がはるかに大きくなり、除去するのが困難であるためである。先端が、空になる直前にピペッティングを停止 注：ピペッティング手を安定させるために秒針を使用して、より正確な配置を容易にします。 </li></ol></li></ol>半固体マトリックス液滴にDRGの4挿入（&lt;プレートあたり2分） <ol><li>簡単に、室温（〜1分）でマトリックス滴でプレートを残します。これはわずかにDRGを正確に配置するのにそれが容易になり、マトリックスを補強します。 </li><li>スクープ（把握していない）DRGそっと左手に閉じられた微細なピンセットで。ここでも、小さなに対して暗い背景、白DRGは、可視化を容易にします。右手に21ゲージの針の先端にDRGを転送します。この転送は鉗子上の残留メディアを残します。 </li><li>静かに21ゲージの針（ 図1）を使用して、マトリックス液滴の中央にDRGを挿入します。ほとんどの時間、DRGを容易にマトリックスに放出され、その後針を中央に配置することができます。 <ol><li> DRGが針に付着した場合、針のオフとマトリックス液滴にDRGをプッシュするために微細な鉗子を使用しています。ラボでの微視的鉗子から余分なメディアをワイプ吸い取ります。 注：行列への紹介メディアは、アッセイの直径、体積、および一貫性が変更されます。色や色の書き込みと氷のブロックは、この繊細なプロセスの可視化を容易に背景のコントラストを、提供します。 </li></ol></li><li>プレートはすべて4のDRGを持っていた後、DRGは、行列滴の中心にあることを確実にするために、最終的な検査を行います。調整を行います21ゲージの針を用いて、必要に応じて。 </li><li> 37℃のインキュベーターに完成したプレートを転送します。これは、半固体マトリックスを固化した位置にDRGを修正します。 </li><li> DRGのすべてについて、この手順を繰り返します。陰性対照としてDRGずにブランクマトリックス液滴を配置します。 </li><li>すべてのプレートを完了し、少なくとも3分間37℃のインキュベーターにそれらを露出させた後、各ガラス底プレートに10％FBS培地を含むDMEMの4 mLを加え。わずかな角度でプレートを置き、ゆっくりと、それは徐々にマトリックス-DRGユニットと接触するように、メディアを追加します。 注：媒体が速すぎるか、積極的に追加された場合、マトリックスおよび/またはDRGは追い出さになることができます。 </li><li> 72時間 - 次の48を37℃のインキュベーター中でアッセイを保管してください。 注：アッセイの定期検査では、行列のエッジ（ 図2）に向けて神経突起の周方向の伸長が表示されます。神経突起は、マトリックスへの道の4分の3よりも大きい場合には、それを細胞をプレーすることが適切です。 </li></ol>頭頸部癌細胞の5準備注：頭頸部扁平上皮癌細胞以外の細胞株は、この実験の設計に使用することができます。 <ol><li> 37℃のインキュベーター中で好ましいフラスコまたは培養皿に10％FBSを含むDMEM中に扁平上皮癌細胞株を維持します。すべての培地培養フラスコまたはディッシュから実験、吸引用の細胞を調製し、PBSで2回それを洗浄します。 10％FBSを含むDMEMに続いて、5分間、0.025％トリプシンを適量添加することにより細胞を懸濁。 6 mLの培養皿への細胞および培地混合物のピペット4ミリリットル。 注：6 mLの培養プレートは十分な細胞でも、50％未満コンフルエント以上のものを提供します。 </li><li>染色およびDRGアッセイにメッキの24時間前に異なる条件にHNSCC細胞株を公開します。再線量細胞は一貫environmeを維持するためにメッキされた後の状態をNT。 注： - マトリックスへのDRGのマウスを解剖し、移植後2日目の細胞培養皿に1抗体、成長因子、サイトカイン、または他の分子を加えます。 </li><li> （ - 3日マトリックスへのDRGの収穫と移植後2）細胞をプレーティングする前に、蛍光細胞の汚れを1時間を追加します。 注：ここで使用される特定の汚れは、細胞膜を自由に通過。しかしながら、細胞内のチオール基と反応した後、染色は、細胞内に留まると娘細胞に受け継がれます。染色は大幅アッセイ内の可視化を容易にします。これらの実験の時間枠である3日、 - 蛍光は2のために存在しているので、これらの一時的な汚れは、これらのアッセイのために理想的です。また、多くの異なる色の使用を可能にし、蛍光タンパク質、トランスフェクトされた細胞株を作成する必要がなくなります。 <ol><li>無血清DMEMの2mLに2μLの10mMストック細胞の汚れを混合することにより、色素溶液の10μMの準備すべてのセルの状態のため。細胞に添加する前に37℃にこれを暖めます。 </li><li>プレートに付着HNSCC細胞を残し、6 mLのプレート内の培地を除去します。 DMEMを各プレートに添加し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の2 mLを加え、10μM細胞染色/無血清2mLのを削除</li><li> 40分間37℃のインキュベーターに細胞染色で6 mLの培養プレートを返します。 </li><li> 40分後、培地を吸引除去します。 PBSの2ミリリットルを追加し、それを吸引除去します。各プレートに0.025％トリプシンの1 mLを加え、37℃のインキュベーターでそれらを交換してください。 </li><li> 3の後に10％FBSを含むDMEMの2mLのを追加 - 5分および15-mLコニカルチューブに懸濁した細胞を移します。細胞をスピンし、10％FBSを含むDMEMを1mLで再懸濁しました。 </li><li>血球計又は自動化細胞カウンターで細胞をカウントし、その後mLの30万の細胞の最終細胞濃度を作成するために、10％FBSを含むDMEMを加えます。 </li></ol></li></ol> 6.メッキヘッドとNECK癌細胞<ol><li>インキュベーターから行列-DRGアッセイとガラス底プレートを取り外します。 注： - 3日神経突起は、一般的に2の後に起こるマトリックスのエッジへの道の少なくとも75％である場合もやはり、それらが適切です。これは最高の、少なくとも10倍の対物レンズを用いて見られています。 </li><li>ガラス底プレート内の培地を吸引除去します。完全によくマトリックス-DRGユニットを取り外すことなく、ガラス内の培地を吸引除去します。 </li><li> 200-μLのピペットを用いて30万細胞/ mL培地の200μLを描画します。各マトリックス-DRGアッセイを介して細胞の2滴を置きます。一方のプレート上の各セルの状態の4反復を作成し、各マトリックス滴に対してこの手順を実行します。 注：行列の半球形状は、細胞が、アッセイ（ 図3a、図3b）の外周に沿ってリングに定住することができます。滑らかなトリガーとピペットを見つけることは、均一の配置ははるかに簡単に低下させます。 </li><li>同様の細胞数およびジを確認します4X顕微鏡下での様々な細胞条件のstribution。 </li><li>約60分間、37℃のインキュベーターにガラス底プレートを置きます。注：細胞および培地（〜150μL）のわずかなボリュームがありますがインキュベータ時間の数時間が経過するまで、アッセイが乾燥しないでください。 </li><li> 60分後、そっとガラス底板の側壁に沿って10％FBSを含むDMEMの4 mLを加え。 注：時間の期間にわたり、細胞が部分的にプレート底部に付着し、そして培地を添加する方法は、細胞に影響を与えません。異なる細胞型は、ガラス底プレートに付着し始めるために、多かれ少なかれ時間がかかるします。 </li><li>前の濃度レベルを維持するために、この時点で、任意の外因性薬剤または成長因子を交換してください。 </li><li>彼らは顕微鏡で検査されている場合を除いて、37℃のインキュベーターにアッセイを返します。顕微鏡イメージングによってこのアッセイの結果を定量化します。簡単に言うと、神経周囲浸潤の鎖を数えます4X顕微鏡画像を使用して、4つの象限インチ 注：4X目的と蛍光機能を備えた顕微鏡は、光文書化アッセイのために適切です。アッセイの大きさは、神経周囲浸潤の個々の領域をキャプチャするのに十分な詳細である4X対物レンズの視野内にうまく収まります。神経周囲の浸潤は、24時間以内に明らかになったが、48時間を超えて、アッセイの整合性は、腫瘍細胞がマトリックスの周囲に沿って分割して侵入するように、弱体化し始めます。 48時間を超えて、明視野顕微鏡を用いて可視化を不明瞭DRG、からの線維芽細胞の実質的な流出もあります。したがって、このウィンドウの間に少なくとも2回のフォトドキュメント4X顕微鏡での結果と得策である（ 例えば、腫瘍細胞をプレーティング後24および48時間で）。これらは、3次元のアッセイであり、それは完全に画像全体を分析することは困難であることを留意します。ほとんどの神経周囲の浸潤は、プレートの底、トンから飛行機で発生します彼細胞はわずかにプレートの底の上にマトリックス中に埋め込まれています。この平面が水平に近いため、腫瘍細胞と神経突起の大半は4Xでの単一レベルの画像に取り込まれます。 </li></ol>

<ol><li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2006%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2006.</a> CA Cancer J Clin. 56 (2), 106-130 (2006).</li>
<li>Hinerman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+irradiation+for+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+cavity%3A+35-year+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity: 35-year experience.</a> Head Neck. 26 (11), 984-994 (2004).</li>
<li>Rahima, B., Shingaki, S., Nagata, M., Saito, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+perineural+invasion+in+oral+and+oropharyngeal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surg+Oral+Med+Oral+Pathol+Oral+Radiol+Endod%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of perineural invasion in oral and oropharyngeal carcinoma.</a> Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 97 (4), 423-431 (2004).</li>
<li>Woolgar, J. A., Scott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+cervical+lymph+node+metastasis+in+squamous+cell+carcinoma+of+the+tongue%2Ffloor+of+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Prediction of cervical lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the tongue/floor of mouth.</a> Head Neck. 17 (6), 463-472 (1995).</li>
<li>Tai, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+for+T1-2+oral+squamous+cell+carcinoma+with+or+without+perineural+invasion%3A+neck+dissection+and+postoperative+adjuvant+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Treatment for T1-2 oral squamous cell carcinoma with or without perineural invasion: neck dissection and postoperative adjuvant therapy.</a> Ann Surg Oncol. 19 (6), 1995-2002 (2012).</li>
<li>George, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+sinusitis+in+patients+in+the+medical+intensive+care+unit%3A+a+prospective+epidemiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial sinusitis in patients in the medical intensive care unit: a prospective epidemiological study.</a> Clin Infect Dis. 27 (3), 463-470 (1998).</li>
<li>Fagan, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perineural+invasion+in+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Perineural invasion in squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124 (6), 637-640 (1998).</li>
<li>Soo, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+implications+of+perineural+spread+in+squamous+carcinomas+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Prognostic implications of perineural spread in squamous carcinomas of the head and neck.</a> Laryngoscope. 96 (10), 1145-1148 (1986).</li>
<li>Parsons, J. T., Mendenhall, W. M., Stringer, S. P., Cassisi, N. J., Million, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+factors+influencing+the+outcome+of+postoperative+irradiation+for+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">An analysis of factors influencing the outcome of postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 39 (1), 137-148 (1997).</li>
<li>Liao, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+adjuvant+radiation+therapy+improve+outcomes+in+pT1-3N0+oral+cavity+cancer+with+tumor-free+margins+and+perineural+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Does adjuvant radiation therapy improve outcomes in pT1-3N0 oral cavity cancer with tumor-free margins and perineural invasion.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 71 (2), 371-376 (2008).</li>
<li>Fan, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+results+of+postoperative+radiotherapy+on+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+cavity%3A+coexistence+of+multiple+minor+risk+factors+results+in+higher+recurrence+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Treatment results of postoperative radiotherapy on squamous cell carcinoma of the oral cavity: coexistence of multiple minor risk factors results in higher recurrence rates.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 77 (4), 1024-1029 (2010).</li>
<li>Dai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+survival+in+perineural+invasion+of+pancreatic+cancer%3A+an+in+vitro+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer: an in vitro approach.</a> Hum Pathol. 38 (2), 299-307 (2007).</li>
<li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+invasion+in+pancreatic+cancer%3A+a+mutual+tropism+between+neurons+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Neural invasion in pancreatic cancer: a mutual tropism between neurons and cancer cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 374 (3), 442-447 (2008).</li>
<li>Gil, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+pancreatic+cancer+cell+invasion+by+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves.</a> J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFRalpha1+released+by+nerves+enhances+cancer+cell+perineural+invasion+through+GDNF-RET+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GFRalpha1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (19), 2008-2017 (2014).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+%28CCL2-CCR2%29+signaling+axis+mediates+perineural+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion.</a> Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).</li>
<li>Bakst, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+impairs+perineural+invasion+by+modulating+the+nerve+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Radiation impairs perineural invasion by modulating the nerve microenvironment.</a> PLoS One. 7 (6), 39925(2012).</li>
<li>Ayala, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+dorsal+root+ganglia+and+human+prostate+cell+line+interaction%3A+redefining+perineural+invasion+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer.</a> Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).</li>
<li>Na'ara, S., Gil, Z., Amit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Modeling+of+Cancerous+Neural+Invasion%3A+The+Dorsal+Root+Ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion.</a> J Vis Exp. (110), (2016).</li>
</ol>

著者には競合する金銭的利益はありません。

プロトコル内の重要なステップ このプロトコル内の最も重要なステップは、後根神経節の正確な解剖と抽出されています。 2半棘に脊柱と正中線縦部門の適切離断は、DRGを大量に得るために重要です。個々のDRGの解剖時には、神経節は、直接処理するべきではありませんが、むしろ周囲の筋膜は、微細な鉗子で把持する必要があります。これを行うに失敗する可能性が神経突起伸長のための失敗の主な原因であるDRGの挫傷になります。これは、オーバー取り扱いDRGを、アッセイには神経突起の成長を取得しないリスクよりも、解剖時に周囲の神経組織をトリムの下で、はるかに優れています。 修正およびトラブルシューティング 上記のように実験プロトコルを満たす最適に反映します数年かけて作られた手続きの調整の多数から確立hodology。プロトコルセクションで対応するステップの直下に記載されているこの方法を使用するときに、著者の経験から得られたノー...

頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)は、米国で6番目に多い癌であり、全国で年間10,000人が死亡し、世界中で年間300,000人が死亡しています1。HNSCCの全体的な予後は、過去数十年間50%で変化していません。神経周囲浸潤 (PNI) は、HNSCC 患者の予後不良の前兆となる最も顕著な病理学的特徴の 1 つです。残念ながら、PNIはHNSCCで頻繁に発生し、HNSCC患者の最大40%に見られます2,3。
PNIは、悪性細胞が神経に沿って隣接する組織まで追跡するプロセスであり、局所的および遠隔的な広がりの割合を高めることができます。したがって、PNI陽性のHNSCC腫瘍は、局所領域の再発率と遠隔転移の割合が高く、PNI4-8のないHNSCC患者と比較して全生存期間が低くなります。
PNI患者の治療は通常、手術、放射線療法、化学療法によって最大化されますが、これらの患者の全生存率は、PNI9-11のない患者と比較して最大40%減少します。したがって、HNSCCの現在の治療法は、PNIに関連する予後不良の改善に効果がないことは明らかです。HNSCCでPNIに対する標的療法を開発するアプローチは、このプロセスを調節する要因の理解が不十分であるために妨げられてきました。これは、部分的には、HNSCCにおけるPNIの研究のための一貫したin vitroモデルの欠如の結果です。
近年、いくつかのグループが主に膵臓がんと前立腺がんのPNIを研究するためにin vitroモデルを利用しています12-19。このモデルは、マウスやラットから分離された後根神経節から生成された神経突起を大神経浸潤の代理として使用します。後根神経節は、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞によって分泌される可溶化された基底膜タンパク質混合物である因子枯渇した半固体マトリックスに固定されています。このマトリックスは、神経突起の伸長と、これらの神経突起に沿った単一の癌細胞の追跡を可能にします。ここで説明するのは、HNSCCでのPNIの検査のためのこのモデルの適応です。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12 50/50 L-グルタミンと 15 mM HEPES</td><td>の混合 Corning Cellgro</td><td>10-090-CV</td><td>マナッサス、バージニア州</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>アトランタの生物学的製剤</td><td>S11150</td><td>フラワリー ブランチ、ジョージア</td></tr>州 <tr><td>0.25% トリプシン-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>25200056</td><td>グランドアイランド、ニューヨーク</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝塩水 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td>バージニア州マナッサス</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-Qualif Mouse</td><td>Corning Incorporated</td><td>354277</td><td>Bedford, MA</td></tr><tr><td>ガンマ線照射 35 mm ガラス底培養皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Ashland, MA</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8 手術顕微鏡</td><td>Carl Zeiss Microimaging</td><td>495015-0021-000&nbsp;</td><td>ソーンウッド、ニューヨーク州</td></tr><tr><td>Schott ACE I光源</td><td>Schott</td><td>A20500</td><td>Germany</td></tr><tr><td>CellTracker&nbsp;</td><td>ライフ・テクノロジーズ・コーポレーション</td><td>C2925</td><td>カリフォルニア州カールスバッド</td></tr><tr><td>BD プレシジョングライド ニードル 18 G および 21 G</td><td>BD</td><td>305195</td><td>ニュージャージー州フランクリン レイクス ニュージャージー州フランクリン レイク</td></tr>ス <tr><td></td><td>60-3851</td><td>マサチューセッツ州ホリストン マサチューセッツ州ホリストン</td><td></td></tr> プレミアム <tr><td>ファイン オペレーティング・スタンダード ハサミ</td><td>ハーバード・デバイス</td><td>52-2789</td><td>マサチューセッツ州ホリストン</td></tr><tr><td>プレミアム・スプリング・シザーズ</td> ハーバー<td>ド装置</td><td>60-3923</td><td>マサチューセッツ州ホリストン</td></tr><tr><td>ドレッシング鉗子</td><td>ハーバード 装置</td><td>72-8949</td><td>マサチューセッツ州ホリストン</td></tr><tr><td>アチミックヌードマウス (002019)</td><td>ジャクソン研究所</td><td>002019</td><td>バーハーバー、メイン</td></tr></tbody></table>州

頭頸部扁平上皮癌における神経周囲の浸潤のためのモデル

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

神経周囲浸潤(PNI)は、頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)の約40%に見られます。手術、放射線療法、化学療法による集学的治療にもかかわらず、局所領域再発と遠隔転移の発生率が高く、PNIを併用しないHNSCCと比較して全生存期間が40%減少します。HNSCC PNIに関与する経路のin vitro研究は、一貫性のある再現性のあるアッセイがないため、歴史的に困難でした。ここで説明するのは、HNSCCにおけるPNIの検査のための後根神経節(DRG)アッセイの適応です。このモデルでは、DRGは犠牲にされたヌードマウスの脊柱から採取され、半固体マトリックス内に配置されます。その後の数日間で、神経突起が生成され、DRGの細胞体から放射状に成長します。次に、HNSCC細胞株をマトリックスの周囲に周辺に配置し、神経突起に沿ってDRGに向かって優先的に侵入します。この方法により、複数の処理条件を迅速に評価でき、非常に高いアッセイ成功率と再現性が得られます。

DRGの解剖とマトリックス液滴内で配置した後、アッセイの外観は、DRGが完全な円ではなく、それをマトリックス液滴内の中心に位置していることを、図1（注）のようになります。これは、部分的に、図2に示す360度における神経突起の伸長を可能にします。 DRGの特定の部分は、典型的には、遠心性と求心性神経の枝が入力され、それぞれ、DRGを出たところに対応し、他のものより速く、より大きな数字で神経突起を送り出すことに注意してください。我々は、このために無作為に4のグループでのDRGをメッキした後、ランダムに各セルの状態に与えられたプレートを割り当てることでのDRG間のサイズの違いを占めています。 前述したように神経突起は、典型的にはオンになっている行列のエッジへの道の少なくとも3/4、拡張した後、我々はHSNCC細胞株をめっき3日目添加した細胞は、行列（ 図3a）</stron...

神経周囲浸潤(PNI)は、頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)の一般的な特徴であり、生存率を低下させます。そのメカニズムはよく理解されていません。半固体マトリックスに閉じ込められたマウスの後根神経節から生成された神経突起を利用して、HNSCC細胞株のPNIに関与する経路を調べることができます。

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

この実験プロトコルの全体的な目標は、頭頸部扁平上皮がんの神経周囲浸潤に影響を与える複数の治療条件を迅速に評価し、非常に高いアッセイ成功率と再現性を実現することです。この方法は、頭頸部がん細胞の神経周囲浸潤に影響を与える要因は何かなど、頭頸部腫瘍学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、1匹のマウスから多数のアッセイを比較的短時間で迅速かつ再現性よく実行できることです。後根神経節(DRG)の解剖手順を開始する前に、V底96ウェルプレートの少なくとも40ウェルに新鮮な室温の培地を追加します。次に、細いハサミを使用して、尾の付け根からマウスの頭まで脊柱に沿って縦方向に切開します。そして、仙骨の背骨の下の組織を横方向に分割し、脊椎の両側を頭蓋骨の基部まで解剖します。顕微鏡下で標本を移し、脊柱の頸部を低電力で観察します。白い脊髄は、さまざまな量の脊髄周囲筋と軟組織に囲まれた骨輪の中央に見られます。微細なスプリングハサミを使用して、最初の2〜3個の椎体の背側、または上側を分割します。次に、ハサミのスプリングアクションを使用して、この最初の骨の切り傷を開き、椎体の解剖が正中線で発生することを確認します。仙骨の背骨に向かって少しずつ続け、椎体の腹側または下側の側面に同じ切り傷がある脊椎を二等分します。片方の半脊椎を脇に置き、脊椎の残りの半分を下向きにして、脊髄を所定の位置に設置した滅菌プレートに移します。また、2本の18ゲージの針を使用して、半脊椎の両端をポリスチレン解剖プラットフォームに固定します。次に、狭い頸部の端から始めて、脊髄を約4つの椎骨レベルからそっと剥がします。感覚神経がDRGに挿入される領域で、顕微鏡の鉗子で周囲の筋膜を優しくつかみ、顕微鏡のスプリングハサミを使用してこの筋膜と他の神経組織をトリミングしてDRGを解放します。倍率を上げて、スプリングハサミを使用して末梢神経をDRGにできるだけ近づけて切断し、組織を解放し、近位枝をトリミングします。次に、浮遊神経線維または筋膜付着物のDRGをトリミングし、分離された組織を96ウェルVボトムプレートの1つのウェルに配置します。半固体マトリックス液滴を調製するには、1つのガラス製ウェルボトムプレートを氷から手術顕微鏡下の氷ブロックに移します。10マイクロリットル以下のピペットの先端を45度の角度でガラスに直接置き、1.5マイクロリットルのマトリックス液滴をガラスに慎重に分注します。マトリックスがプレートにかみ合うように、ピペットの先端をゆっくりとガラスから離します。プレートの四隅にマトリックスの液滴を1滴ずつ堆積させ、プレートを室温面に約1分間移します。マトリックスがわずかに硬くなったら、プレートを氷のブロックに戻し、閉じた顕微鏡の鉗子を使用して左手でDRGをそっとすくい取ります。右手を使って、神経組織を21ゲージの針の先端に慎重に移し、針を使用してDRGをマトリックス液滴の中央に穏やかに挿入します。DRGは、針で中央に配置するためにマトリックスに簡単に解放する必要があります。DRGピースを4つの液滴のそれぞれに挿入した後、プレートを摂氏37度のインキュベーターに3分間入れます。すべてのDRGが埋め込まれたら、プレートを一度に1つずつ少し角度で保持し、10%FBSを添加した4ミリリットルのDMEMをプレートにゆっくりと追加します。プレートをさらに48〜72時間インキュベーターに戻します。神経突起がマトリックスの端までの道のりの少なくとも75%に達したら、マトリックスDRGユニットを取り外すことなく、ウェルから培地を吸引します。次に、200マイクロリットルのピペットを使用して、滑らかなトリガーを使用して、培地1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞の3倍の2滴を各マトリックスDRGアッセイ上に置きます。そしてプレートをインキュベーターに戻します。1時間後、ガラス底プレートの側壁に沿って10%FBSを含む4ミリリットルのDMEMを静かに加え、プレートを次の顕微鏡評価までインキュベーターに戻します。それらを解剖し、マトリックス液滴内に配置した後、アッセイの外観は、ここに示すマトリックス埋め込みDRGのようになるはずです。DRGは完全な円形ではなく、マトリックス液滴の中央にあるため、神経突起が360度で成長する可能性があることに注意してください。めっき直後、頭頸部扁平上皮がん細胞はマトリックスの周りに円周リングを形成し、次の2〜3日で神経突起に沿って拡大します。マトリックスのみを含むブランクコントロール液滴に播種された細胞は、マトリックスの周りで活発に分裂しますが、上部に侵入したり伸びたりすることはありません。がん細胞の神経周囲浸潤を定量化するために、アッセイの画像は、1本の垂直線と1本の水平線を介して4つの象限に分割されます。次に、各象限で観察された神経周囲浸潤拡張ごとに一連のポイントが採点され、異なるがん細胞株間の神経突起に沿ったがん細胞の内部成長を比較できます。習得すると、後根神経節分離技術は、適切に実行されれば2時間以内に完了することができます。この手順を試みる際には、挫傷がアッセイの失敗の最も一般的な理由であるため、後根神経節の過度の取り扱いを最小限に抑えることが重要です。この手順に続いて、神経周囲浸潤のメカニズムを研究することができ、このタイプの軟部組織浸潤に対する標的療法の開発につながる可能性があります。このビデオを見た後、マウスから後根神経節を解剖する方法と、神経周囲浸潤を調べるためのアッセイを設定する方法について十分に理解しているはずです。

a-model-for-perineural-invasion-head-neck-squamous-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

標識された細胞の多光子顕微鏡を通して舌内に口腔癌と腫瘍浸潤の定量的なモニタリングのマウスモデルの生成に関わる技術の包括的な概要が表示されます。このシステムは、抗浸潤化合物の分子の評価と薬効のための有用なプラットフォームとして機能することができます。...

口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

このビデオでは、ヒヨコ絨毛膜またはCAMで後根神経節と癌細胞を共培養して神経周囲浸潤を研究する方法について説明します。...

ひよこ絨毛尿膜またはCAM腫瘍モデル:腫瘍細胞の神経周囲浸潤をシミュレートするためのInOvo法

この動画では、マウスの後根神経節と神経向性がん細胞を共培養することで、in...

マウス背根神経節とがん細胞の三次元共培養モデルの確立:神経周囲がん細胞の浸潤を研究するためのインビトロモデル

この動画では、膵臓がん細胞を坐骨神経に注入することで、神経周囲浸潤のin...

マウス神経周囲浸潤モデル:マウス坐骨神経における神経周囲浸潤をシミュレートするためのIn vivoモデルの生成

この動画では、がん細胞を坐骨神経に注入して神経周囲浸潤のマウスモデルを確立する手順を説明します。このモデルは、その後の抗がん剤の評価のために神経浸潤の大きさを理解するのに役立ちます。...

神経周囲浸潤またはPNIのマウス坐骨神経モデル:がん細胞による浸潤を理解するための坐骨神経の抽出と処理

周囲の正常組織への浸潤は、悪性腫瘍の決定的な特徴です。ここでは、進行したヒトがんの多くのモデルで例示されている天然の3Dバイオマトリックスへの浸潤のシンプルな半自動マイクロプレートアッセイを提供します。...

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

このビデオ記事は、膵管腺癌における後根神経節(DRG)/癌細胞モデルの使用を示しています。...

後根神経節モデル：癌性神経浸潤のin vitroモデルでは

坐骨神経に同系膵癌細胞を注入することによって浸潤の体内マウス...

神経周囲浸潤のIn Vivoマウスの坐骨神経モデル

療法の評価を目指して私たち頭頸部扁平上皮癌細胞株に対する実験的治療レジメンの現在の規格をテストすることができる回転楕円体に基づく、三次元の in...

治療の頭頸部扁平上皮癌に対する回転楕円体に基づく 3 D 細胞培養モデルのテスト

頭頸部扁平上皮癌同所性同種モデルマウスを開発するための再現可能な方法をご紹介します。腫瘍免疫の浸潤、リンパ節転移、貧しい分化壊死を含む病気の臨床的病理組織学的機能について示します。担癌マウスでは、嚥下障害、顎の変位、減量など臨床的に関連する症状を起こします。...

腫瘍免疫プロファイル用のマウスおよび治療応答評価における扁平上皮癌細胞の粘膜接種

ペリニューラル侵来は、頭頸部扁平上皮癌および他の腫瘍に対する積極的な表現型である。ひよこ絨毛膜モデルは、血管新生、癌の侵入、転移の研究に使用されています。ここでは、このモデルを生体内のペリニューラル侵入を評価するためにどのように利用できるかを示します。...

頭頸部癌のペリオラル侵食を評価する生体内モデルにおけるひよこチョリオアラントIC膜

学ぶ 頭頸部扁平上皮癌における神経周囲浸潤の評価法。マウス背根神経節を用いて、高い再現性と成功率で複数の処置条件を迅速に検証できる。この手法はがん細胞の神経浸潤メカニズム解明と治療戦略開発に貢献する。

頭頸部扁平上皮癌における神経周囲の浸潤のためのモデル

さらに動画を探す