ゲルの表面上に成長する植物の根の光シート蛍光顕微鏡

この手順の全体的な目標は、ライトシート顕微鏡を使用して植物の根系の長期的な観察を取得することです。これを達成するためには、穏やかなサンプル調製方法、制御された生育条件、およびライトシート顕微鏡などの植物の発育を変えないイメージング技術が不可欠です。まず、植物は2ミリメートルの薄いゲル層の表面で成長します。

次に、アリズナの苗を含むゲルを切り取り、すくい上げて顕微鏡サンプルホルダーに移します。顕微鏡の中では、植物は自然な直立姿勢で成長します。根は液体媒体で成長し、葉は空気中に残ります。

照明システムは葉だけを照らします。根を暗く保つために水面を覆っています。ゲルの内部に根を埋め込むなど、既存の方法と比較した場合のこの技術の主な利点の1つは、ゲルの表面で植物を育てるために使用されることです。

したがって、以前とまったく同じ成長プロトコルに固執することができます。そして第二に、根は液体媒体と直接接触しており、例えば薬物治療と交換することができます。オートクレーブ処理したばかりの半強度MS培地30ミリリットルを、1.5%の植物性ゲルを含む正方形のシャーレに注ぎ、約2mmの層を作ります。

無菌の種子を、間に少なくとも1センチメートルのスペースを空けて並べて蒔きます。その後、プレートを微細孔テープで包みます。グロースインキュベーターでプレートを最大10日間垂直に培養します。

この実験では、生後6日の植物を用いて、側根の発達を観察します。サンプルホルダーを3Dプリントするためのモデルを提供します。さまざまな材料をテストしました。

透明樹脂は、剛性と耐水性の点で最適でした。固体材料からサンプルホルダーを加工するための寸法の詳細な説明は、原稿に記載されています。メスを使用して植物の周りのゲルを切り取ります。

次に、植物が成長しているゲルのブロックをすくい上げ、サンプルホルダーに慎重にスキャナーで移動します。1%のアグロを摂氏80度で溶かし、摂氏33度まで冷却します。ゲルのブロックをサンプルホルダーに接着し、植物をゲルに慎重に接着します。

実体顕微鏡を使用して植物の位置を確認し、関心領域がゲルで覆われていないことを確認します。植物が乾燥するのを防ぐために、サンプルホルダーを可能な限り1, 000マイクロリットルのピペットチップにスライドさせます。ホルダーをピペットボックスに入れ、必要に応じてさらにサンプルを準備します。

当社の顕微鏡は、大きな変更を加えていないクラシックなオープンスピンです。顕微鏡内で植物を培養するための照明システムを実装しました。赤と青のLEDがリング状に配置されています。

LEDのペアは、指向性照明のために個別にオンとオフを切り替えることができます。照明システムのスペクトルは、当社の成長チャンバーのスペクトルと一致しています。LEDからの照明のほとんどすべてがGFPの発光フィルターによって遮断されます。

カメラに到達する迷光は検出できませんでした。したがって、イメージング中もライトを点灯し続けることができます。光の強度は、毎秒30〜250マイクロモル/メートルの二乗の範囲で調整できます。

オープンスピンステージアームの下側にあるLEDリングをねじ込むか接着します。顕微鏡に取り付け直し、ワイヤーをつなぎます。プロフュージョンシステムを組み立てます。

チューブをサンプルチャンバーに一方向で接続します。速度を1分あたり1ミリリットルに調整します。滅菌した黒いプラスチックホイルを3ミリメートル四方追加し、水面に分散させます。

サンプルを顕微鏡に挿入します。サンプルホルダーにプラスチックシートがくっついていないことを確認します。黒いアルミホイルで作られた2つの蓋でチャンバーを閉じます。

ライトを点灯し、光の強度を調整します。部屋の照明を消して、録音を開始します。この方法では、数時間から数日間にわたって根の成長を記録することができ、ここでは側根の成長によって示されます。

1 つの時点の Z スタックの画像は、良好な光学断面特性を示しています。私たちは、側根形成の全過程を3Dで捉え、このプロセスのダイナミクスを研究することができました。この録音の1つのスライスを見ると、ルートの奥深くまで良好な解像度が見られます。

このビデオを見れば、ライトシート顕微鏡の植物サンプル調製方法について明確に理解できるはずです。このプロトコルに従って、私たちは現在、器官形成、植物親和性、または植物の適応中の細胞内タンパク質の局在または遺伝子発現パターンを調べることができます。これは、植物発生の時空間的制御を理解するのに役立ちます。