Name: 成人および高齢人間の骨格筋から筋原性前駆細胞/一次筋芽細胞の調製と文化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶ成人および高齢者の骨格筋から一次筋芽細胞を分離培養する方法。ラミニン被覆と酵素処理を用いて細胞の自然な挙動を維持し、長期培養と筋管分化が可能です。筋再生と加齢研究に有用です。

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この作業は、バイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会（BBSRC;BB/L021668/1)、MRC - Arthritis Research UK Centre for Integrated Research into Musculoskeletal Ageing(CIMA)およびWellcome Trust Institutional Strategic Support Fund(097826/Z/11/A)の一部として、MRCおよびArthritis Research UKが設立しました。著者らは、筋前駆細胞の単離に関する専門知識とアドバイスを提供してくださったDada Pisconti博士(リバプール大学)に感謝します。

本明細書に記載されたヒト組織を含むすべての実験は、リバプールの大学、大学病院エイントリー病院と南西ウェールズ研究倫理委員会によって事前に承認されなかった（承認番号：13 / WA / 0374）及び実験はグッドプラクティスガイダンスに従って実施しました。倫理は、この研究のためにスポンサーとしてリバプール大学は行動しました。すべてのドナーは、この研究の登録のためのインフォームドコンセントを与えています。筋肉が人から単離した（BMI &lt;25）：大人：30±2.8歳と高齢者：69±5歳。 文化1.準備<ol><li> ラミニンで培養表面のコーティング <ol><li> 1×DPBS（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）中のラミニンを10μg/ mLのの作業溶液を調製します。 </li><li>細胞はメッキしようとしているその上に表面を完全に覆うようにラミニン溶液の最小量（ 表1）をピペット。トンをインキュベート細胞をプレーティングする前に、加湿した37°Cでの彼の培養皿に少なくとも30分間、5％CO 2インキュベーター。渦の使用を回避すること、慎重にラミニンを扱います。 DPBS中で希釈は10μg/ mLのラミニンの作業溶液を数回、4℃で保存し、再利用することができます。 </li><li> 6ウェルプレート中で60ミリ（20 cm 2）をペトリ皿または2つのウェルを使用して（2×10センチメートル2）〜18ごと-骨格筋の19 mgの細胞（合計5.50×10 4細胞）をプレートに。機能的研究のための細胞をプレーティングするときに、すべての回で細胞計数を行います。 注：サンプルは、もともと女性患者（30±2.8歳、高齢者：69±5歳、BMI &lt;25成人）の足の手術（指伸筋・ブレビス、前脛骨または外転halluces筋）から得ました。 </li></ol></li><li> 酵素溶液の調製 <ol><li> 10 mLの1×DPBSの株式のCaCl 2の277 mgを250 mMの塩化カルシウム2作業溶液を準備します。そうフィルター4℃で0.2μmのフィルター膜とストアとリューション。 </li><li>コラゲナーゼDの1.5 U / mLで、ディスパーゼIIの2.4 U / mLおよび無血清DMEM中の2.5mMのCaCl 2（ダルベッコ改変イーグル培地）（ 表2）の作業溶液を調製します。 </li><li>よく混ぜ、滅菌用0.2μmのフィルター膜を介して酵素液をフィルタリングします。事前に酵素液を調製し、ダウン凍結（-20°C）将来の使用のためにアリコートインチ</li></ol></li></ol> 2.組織消化：機械および酵素的解離<ol><li>サンプル収集に続いて、消化するまでDPBSで4℃で筋肉を維持します。 18あたりのコラゲナーゼディスパーゼ-のCaCl 2溶液2mLの最小体積準備-筋肉組織の19 mgのと組織解離の前に37℃に温めます。 </li><li> 70％エタノールで簡単に筋生検を浸し、新鮮なDPBSで洗浄し、酵素の1 mLで新しいペトリ皿に組織を置きます溶液。 </li><li>できるだけ多くの線維化および脂肪組織を捨て、滅菌はさみまたは外科用メス（ブレード番号10）で（約&gt; 0.5ミリメートル2）小さいが識別可能なピースに素早くしかし穏やかに筋肉を引き裂きます。 </li><li>コラゲナーゼディスパーゼ-のCaCl 2の残りの1 mLで50 mLチューブに試料を移します。 </li><li> 40分 - 30まで37℃で組織をインキュベートします。 10分 - 優しくチューブごと5を攪拌することにより、筋肉組織を移動します。 </li><li>コートメディアでピペットがピペットのプラスチック壁に放出された細胞の付着を回避します。消化を停止するために、例えば 、滅菌増殖培地2容量、DMEM、20％FBS（ウシ胎児血清）、1％L-グルタミンおよび1％P / S（ペニシリン-ストレプトマイシン）を4mLを加えます。 </li><li>筋線維からの細胞の放出を助けるために5 mLのピペットで上下にピペットで数回。 注：サンプルは、通常、完全に、その小さなサイズに解離されます。 However、筋肉の断片がまだ残っている場合、筋肉の残りの部分で、新鮮な酵素溶液と第二のインキュベーションを使用します。 </li><li> 50 mLのコニカルチューブの上に70μmのセルストレーナーを介して筋肉のソリューションをフィルタリングします。ストレーナーを通して多くのメディアやフィルタを持つ残りの細胞を洗浄。 </li><li>細胞をペレットに室温で5分間、443×gで遠心分離します。慎重に上清を捨てます。 </li><li> F-12培地（HamのF-12栄養素混合）、20％FBS、10％HS（ウマ血清）、1％P / S、1％のα-グルタミン及び2.5 ngのFGF-B / mLの（にペレットを溶解します組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子）。ここでは、60ミリメートルのペトリ皿当たり培地4mLのを使用しています。 </li></ol>細胞の3播種<ol><li>以前インキュベーター（セクション1.1）からの10μg/ mLのラミニンでコーティングされた培養容器を収集します。 </li><li>慎重に培養皿からラミニンの過剰分を除去し、表面には触れないでください（または、それは、タンパク質の構造を妨害します）。ウォッシュ（オプション）DPBSで培養皿。 </li><li>ラミニンコートした容器に直接細胞をプレートし、加湿した37℃、5％CO 2インキュベーター中で24時間インキュベートします。 </li><li>明視野顕微鏡（100X総合倍率）次の日の下で細胞を可視化。丸小細胞が表面に付着し、残りの破片は、培養培地中に見ることができます。 </li><li> 20％FBS、10％HS、1％P / S、1％のα-グルタミンおよび2.5 ngのFGF-B / mLの補完新鮮なF-12培地にメディアを変更します。 </li></ol> 4.文化や細胞の継代<ol><li> 3 dおよび自発的な回避するために、細胞のグループが（7日後に、100X総合倍率、 図2の例では、高齢者からの細胞を、継代0）顕微鏡下で可視になるとすぐに細胞を分割-メディアごとに2を変更分化。 </li><li>第一通路（P1）で、20％FBS、10％HSで補完高グルコースDMEM、1％の培地を変更P / S、1％のα-グルタミン。 FGFは、培養開始時強力なマイトジェンおよび重要な要因であるとして、この点から、FGF-Bを使用しないでください、しかし、文化の中で長く使用されている場合には、線維芽細胞の異常増殖を促進することができます。 </li><li>細胞継代の場合： <ol><li>メディアを取り外し、DPBSで細胞を2回洗浄します。 </li><li>細胞の表面を覆うように0.25％EDTA-トリプシンの最小容積を追加します。室温で10秒間インキュベートし、全ての細胞が剥離液で覆われていることを確認するために優しくロ​​ックし、それを削除します。 </li><li> 5分-加湿37°C、3、5％CO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートします。優しくタップすると、細胞が丸みを帯びたが、表面から完全に切り離されていないことを明るい光顕微鏡（100X総合倍率）の下で確認してください。変化は、細胞中で観察されていない場合は、さらに5分間インキュベートします。 </li><li>ミックス、細胞を収集するために、成長培地5mLの（20％FBSで補完高グルコースDMEM、10％HS、1％P / S、1％のα-グルタミン）を追加ウェルおよびT75フラスコに新しいメディアで細胞を移します。残りの細胞は増殖培地の別の5mLの（1 T75フラスコの合計で10 mL）で、このステップを繰り返し洗います。 </li><li> （第一通路で望ましい）preplateするには、加湿37℃、40分間、5％CO 2インキュベーターで細胞をインキュベートします。新しいT75フラスコにそれらを添付して、インキュベートしなかった細胞と上清を収集します。線維芽細胞のほとんどは最初のフラスコに取り付けられているはずですので、これは、筋芽細胞に文化を豊かにする必要があります。 </li></ol></li><li> 3 dおよびそれらが最大収率70％コンフルエントに達するとすぐ4にセル1を分割する - メディアごとに2を変更します。 </li><li>細胞が70に達したら分化のために、 - 80％の密集度を、分化培地（DM）に培地を変更し、2％HS、1％P / S、1％のα-グルタミンで補完高グルコースDMEM。筋芽細胞cの品質と純度に応じて7日 - 細胞が5以内に区別されるべきですulture。 </li></ol> 5.トランスフェクションプロトコル<ol><li>シード50,000細胞/ウェルでMF 20、老化および生存度アッセイのために12ウェルプレート。カバースリップ上またはラミニンでコーティングしたシャーレで培養細胞。 Ki67染色のために、12ウェルプレート中/ウェル25,000細胞を播種します。 </li><li>トランスフェクションのために、トランスフェクション試薬の5μLを使用して、製造元の手順に従って、制御マイクロRNAの100 nMのは、1 mLの総容量で、ウェル当たり阻害剤を模倣するマイクロRNAまたはマイクロRNAの100nmの、100 nMのを模倣または阻害剤。 </li><li>トランスフェクション後の分化中6時間に変更します（高グルコースDMEMは2％HS、1％P / S、1％のα-グルタミンで補完します）。増殖実験のために、細胞をトランスフェクション後2日を染色します。老化のために、トランスフェクション後7日。そして、MF20染色のため、トランスフェクション後7日。 </li></ol>細胞の6.免疫染色<ol><li> Ki67を、のMyoDおよびMF 20免疫染色<ol><li>ブロック1（10を準備します％HS、0.1％PBS中のTriton-X）とPBS）溶液中の2（10％HSおよび0.05％のTriton-Xを遮断します。 12ウェルプレートのためにウェルあたり試薬500μLを使用してください。 注：インキュベーション工程のためにシェーカーを用いて、以下の手順を実行します。 </li><li>細胞から培地を除去。 </li><li> PBSで細胞を洗浄します。 </li><li>ロッカー上で10分間、冷メタノールで細胞を固定してください。 </li><li>細胞からメタノールを除去し、5分毎の時間のためにPBSで3回すすいでください。 </li><li>ブロック1溶液を加え、1時間室温でロッカー上で細胞を培養します。 </li><li>一次抗体溶液を追加します。Ki67染色のために、Ki67のにウサギモノクローナル抗体を使用して（1：ブロック2 1,000希釈）。 MyoDのために、MYOD1（D8G3）XPのウサギモノクローナル抗体を使用して（1：ブロックで100希釈2）。 MF 20染色のために、MYH1E（MF 20）の一次抗体（1：ブロック2 1,000希釈DSHB、1）を使用します。 </li><li>ロッカー上O / N（4℃）に1時間（RT）のための一次抗体で細胞をインキュベートします。 </li><li> STO場合、それは数回再使用することができる（一次抗体を集めます4℃で赤）。 </li><li>細胞はPBS、5分ずつで3倍すすいでください。 </li><li>適切な二次抗体を追加したKi67またはMyoDの染色を、ヤギ抗ウサギIgG（H + L）二次抗体のためアレクサフルオロ488コンジュゲート（1：PBS 1,000希釈）。 MF 20染色を、ヤギ抗マウスIgG（H + L）二次抗体、アレクサフルオロ488コンジュゲート（：PBS 1,000希釈1）のために。 </li><li>細胞を含有するプレートをラップし、RTでロッカーに暗所で2時間、二次抗体をインキュベートします。 </li><li>細胞を5分間PBSで各回3倍すすぎます。 </li><li>細胞にと5 RTでロッカーにインキュベート - 10分：DAPI溶液（PBS 1,000希釈1）を追加します。 </li><li>細胞を5分間PBSで各回3倍すすぎます。 </li><li>新鮮なPBSの1 mLを加え。 </li><li>マウントソリューションでカバースリップ上の細胞をマウントまたは蒸発を避けるために、パラフィルムでPBSで細胞を含むプレートをシール。 </li><li> 4℃で保存。 </li><li>で細胞を可視化蛍光顕微鏡できるだけ早く（遅くとも2週間）。 </li></ol></li><li> 生死判別試験 <ol><li>細胞から培地を除去。 </li><li> PBSで細胞を洗浄します。 </li><li>千エチジウムブロマイドと1：PBSで希釈した千アクリジンオレンジ1を追加します。 注意：注意してくださいし、健康と安全規制の範囲内で動作 - エチジウムブロマイドは発癌物質です。 </li><li>染色溶液中の細胞を含むプレートをラップし、5分間ロッカー上、室温でインキュベートします。 </li><li>蛍光顕微鏡で細胞の画像を撮影：アクリジンオレンジのためのグリーンチャンネル。臭化エチジウムのための赤チャンネル。 </li></ol></li></ol>

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開示することは何もありません。

ここでは、伸筋digitorium・ブレビス、前脛骨筋または外転halluces筋肉から成人および高齢のヒトから筋前駆細胞/一次筋芽細胞を単離する、シンプルな堅牢、安価で、再現性と効率的な方法を提示します。このプロトコルは、FACS-またはMACSソーティングなど、より洗練された方法は、実用可能かどうかではない場合は特に、成人および高齢のヒトからヒト一次筋芽細胞を用いた研究を可能にすることを目指しています。 この原稿で提示分離法は、約2時間かかります。筋肉の分離の間、筋肉は、汚染を避けるために70％エタノールで洗浄しました。筋肉の解離を酵素的に先立って、小さいが、可視片に筋肉を切断し、あまりにも多くのミンチからの細胞の損傷を避けることが重要です。筋線維の解離および衛星細胞および筋原性前駆細胞のリリースで消化結果。骨格筋の〜20ミリグラム、1 60ミリメートルのための私達の場合には（20 cm 2）をペトリ皿に細胞を回収するための最も適切な表面積でした。小さい表面上に播種した細胞は、細胞死の増加および凝集を示したのに対し、より大きな表面上に播種した細胞は、増殖が減少を示しました。 分離の際に、細胞を培養し、ラミニン被覆されたプレート上で増殖させました。非被覆表面を使用することは、分離の成功を減少させる傾向がありました。この理由のために、細胞は、好ましくは直接分離した後、予めコーティングされた表面上に収穫することができます。細胞を直接単離後、非被覆表面に収穫された場合の線維芽細胞富化培養物は、筋芽細胞由来の細胞ではなく、優勢になります。別にラミニンから、例えばマトリゲルおよびコラーゲンベースの試薬のような他の細胞接着溶液の使用を使用することができます。コーティング溶液は、細胞増殖を促進する成長因子および他の化合物を挙げることができるが、これらは、細胞の挙動、したがって、実験結果を変化させることができます。にそれは、任意の成長因子または他の相補体を欠いているように私たちの経験、を10μg/ mLのラミニンは、衛星細胞および筋芽細胞の付着および増殖のための最適な濃度および適切なコーティング試薬です。また、ラミニンは、直接骨格筋線維を介して衛星細胞の付着および遊走に重要な機能を果たしている筋細胞膜に結合された、基底膜中に天然に存在しています。 培養培地のサプリメントは、一次筋芽細胞の挙動に有害な影響を与える可能性があります。このようなのFGFまたはIGF類として、例えば成長因子群については、FGF-2は、分裂促進およびプログラム細胞死応答31の両方を制御することで、一次筋芽細胞培養物に対する多面的効果を有します。大人と高齢者の筋肉から単離した初代筋芽細胞の挙動の違いが原因で純度Oになる可能性が非常に高い、特にので、厳密に培養条件を制御することが必要です文化や長期培養35時の培養液中の筋芽細胞をオーバーラン線維芽細胞の可能性F。私たちは、線維芽細胞と培養液の汚染を低減するために、非コーティングされた表面上に第1分離の間に細胞の1時間前メッキを使用しています。 私たちが説明する方法は、成人および高齢者ヒトの両方の筋肉から筋原性前駆細胞を単離するための適切です。筋原細胞の高い割合によって示される（ 図1においてMF20免疫染色によって可視化のMyoD発現および筋形成特性および2）およびプロセスの機能的研究のためのin vitroモデルとして使用することができる単離された細胞は、細胞の代表的な筋原集団で構成され筋肉の恒常性に関連付けられています。 これまでの研究では、ヒト一次筋芽細胞の単離および特性の違い、またはその欠如、からを特徴としています成人および高齢者6、20、27、28、29、30、31、35、3 6、37、38。高齢者および/または非機能的なヒトのMPCの存在は、6、20、22に示されています。しかし、新たに単離されたヒトのMPCの挙動の差も27が示されていません。私たちのプロトコルは、高齢者の筋肉から単離した初代筋芽細胞の減少増殖能や老化などに少なくとも部分的にそれらの表現型を維持し、一次筋芽細胞の単離を可能にし、これらを使用することが可能になります22を老化時の筋肉の恒常性の分子機構の機能研究のための細胞。 ここに記載した方法を用いて単離された初代筋芽細胞は、筋原性分化研究のためのみならず、使用することができるだけでなく、老化の間のヒト筋原性前駆細胞に存在する遺伝子発現の変化のような細胞内の変化を調査します。しかし、長期のex vivoで培養中の細胞に生じる変化は、老化の間に生じる表現型と遺伝子型の変化を分析する際に考慮される必要があります。私たちは、この目的のために新たに単離した細胞を使用することをお勧めします。 また、ここで説明した一次筋芽細胞培養法は、堅牢なin vitroでの機能研究を可能にし、拡張およびヒト一次筋芽細胞の比較的長期培養を可能にします。我々は、以前に我々の方法を用いて単離した筋原性前駆細胞が発現プロファイリングおよびFUの両方に使用することができることを示しています筋肉の老化22に関連するプロセスのnctional研究。この方法はまた、成体の筋肉や古いげっ歯類に適用可能であり、高齢化と機能研究22の間に遺伝的およびエピジェネティックな変化をプロファイリングするために使用することができる筋芽細胞の濃縮された文化を単離することができます。この方法の制限は、細胞のある程度、混合集団ではなく、より洗練された公開された方法6、28、29、39、40、41、42を用いて得ることができる衛星細胞の純粋な集団の使用を含みます43。 私たちは、大人と高齢者からの一次筋芽細胞の細胞の単離のために、簡略化された手頃な価格で、かつ再現性のあるプロトコルを提示します人間。我々の経験では、（そのようなMACS-またはFACSソート衛星細胞など）ヒト一次筋芽細胞の単離および文化の利用可能な、より洗練された方法は、細胞中のトランスクリプトームやプロテオーム変化をプロファイリングなどの研究、いくつかの種類に最適です。しかし、これらの方法は、高価であり、専門知識の少なくともいくつかのレベルを必要とし、かつによる筋芽細胞を過剰成長純粋な一次筋芽細胞培養および線維芽細胞の低増殖率に難しいかもしれません。 私たちは、機能的研究で使用するためのヒト一次筋芽細胞の簡単な単離および培養を可能に再現可能なプロトコルを提示します。さらに、当社は、ラミニン42の使用と成功の文化44のための鍵となる要因としてbFGFの限られた使用を提案しています。我々はまた、細胞を分割し、第一通路45に1つのプレめっき工程時に遠心分離することにより発生する応力を回避することを提案します。要約すると、我々が持っていますまた、げっ歯類の筋肉に適用可能であり、表情や筋肉の恒常性の機能研究を可能にし、成人と高齢者のヒトの筋肉からの一次筋芽細胞/のMPCの単離および培養のための効率的なプロトコルを最適化しました。

疾病や虚弱で、骨格筋量および機能結果の年齢に関連した進行性の喪失、高齢者の生活の質の強度及び減少の減少。骨格筋は、約40％の体重1を占めます。脂肪及び線維症の浸潤に、個々の筋線維と筋品質の低下の進行性萎縮老化および疾患中1、2、3、4、5、6を生じます。 最近では、特にげっ歯類で発生すること筋繊維損失は、人間7で発生しないことがあり、骨格筋の老化における種特異的な違いが発生することが提案されています。それにもかかわらず、高齢者の哺乳動物の残りの筋繊維が損傷し、障害のある再生に感受性の増加によって特徴づけられます<supクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 8。 大人の筋肉の修復とメンテナンスが衛星細胞9、10によって媒介されます。筋損傷およびその他の関連する手がかりすると、衛星細胞が活性化し、増殖になります。細胞のサブセットは、静止状態に戻り、残りは筋芽細胞（筋原性前駆細胞 - のMPC）に進行します。これらは、既存の筋線維11の修復に貢献します。衛星細胞の機能は、筋肉再生の成功を決定し、加齢に伴う衛星細胞の利用可能性の変化は12、13、14、15に示されています。また、古いヒトおよび齧歯類の筋肉からの衛星細胞は、転写プロファイルスイッチを示し、再生能16,17を 低減 </sup&gt; 18、19。老齢マウスおよびヒトの筋肉衛星細胞は、それらの還元機能20をもたらす老化を受けることが示されています。 筋恒常性の研究を可能にする最も確立された細胞株は、マウスC2C12細胞ライン21です。研究のかなりの量はまた、マウスの一次筋芽細胞22を使用しています。これらの培養物は、マウスと脊椎動物の筋形成だけでなく、筋肉再生、筋管/筋線維の萎縮、および筋肉疾患の間に発生し、23、24、25、26を老化肥大プロセスの重要な理解につながっています。さらに最近では、いくつかのグループが筋形成と筋肉の老化を研究するためにヒト一次筋芽細胞を用いて説明しています。しかし、レガールとのコンセンサスが欠如しています成人および高齢のヒト27、28、29、30、31の筋肉から単離された一次筋芽細胞との間の差にDS。全身および局所環境は、老化や病気6、32、33、34、開発中に発生する特徴の違いにもかかわらず、in vitroでの筋芽細胞および筋管培養物は、筋肉の発達、成長および萎縮に関連する分子メカニズムを研究するための最もアクセスしやすいツールが残ります。さらに、これらの研究だけでなく、堅牢を提供するだけでなく、 インビトロツールは比較的、迅速、安価で高スループット。さらに、ヒトの筋肉の研究に関連した倫理的含意が機能的実験のために、遺伝子発現の操作を伴うことを意味します<em&gt;、in vitroでのヒト筋芽細胞および筋管培養物は、脊椎動物のモデル生物が利用可能な唯一の代替残ります。 ここでは、成人および高齢者の筋肉からの一次筋芽細胞、またはのMPCの、堅牢で安価、かつ再現性の分離のための簡単な実験プロトコルを、示し、in vitro培養（ 図1）の標準化された条件を説明します。筋肉からの初代培養物は、通常、筋芽細胞に加えて、線維芽細胞が含まれているように、我々は、一次筋芽細胞の純度が向上し、品質を目指しプレプレーティングステップをお勧めします。要約すると、我々は、効率的かつ再現性の分離、文化、大人や高齢者の骨格筋からの富化および機能のMPC /一次筋芽細胞の機能研究を可能にするプロトコルを確立しました。

<table><tbody><tr><td>60 mm シャー</td>レ <td>Greiner Bio One</td><td>628160</td><td>Cellstar 細胞培養ディッシュ、PS、60/15 MM、通気口。</td></tr><tr><td>細胞培養プレート(6ウェル)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3516</td><td>Corning Costar 細胞培養プレート 6ウェル平底(個別包装) .&nbsp;</td></tr><tr><td>細胞培養プレート(12ウェル)</td><td>Greiner bio-one</td><td>657 160</td><td>Cell culture Multiwell Plates.&nbsp;</td></tr><tr><td>培養フラスコ</td><td>Greiner Bio One</td><td>&nbsp;690175(25 cm2);658175(75cm2)。</td><td>Cellstarフィルターキャップ細胞培養フラスコ。</td></tr><tr><td>標準的な使い捨てメス</td><td>Granton</td><td>91310</td><td>滅菌ステンレス鋼の刃、パターン:10.&nbsp;</td></tr><tr><td>ピペット</td><td>Greiner bio-one</td><td>606 180 (5 mL); 607 180 (10 mL); 760 180 (25 mL)</td><td>Cellstar Serological Pipettes.&nbsp;</td></tr><tr><td>パスツールプラスチックピペット</td><td>Starlab</td><td>E1414-0311</td><td>3.0 mL 目盛り付きパスツールピペット(滅菌)、インディアナ州包装済み。</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD</td><td>300613</td><td>20 mL BD偏心チップシリンジ&nbsp;</td></tr><tr><td>0.2 &マイクロ;mフィルター</td><td>ギルソン</td><td></td><td>ALG422A滅菌シリンジフィルター CA 0.2 &micro;メートル33ミリメートルPk50。</td></tr><tr><td>細胞ストレーナー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11597522</td><td>細胞培養ストレーナー 無菌 個包装 70 & マイクロ;mポリプロピレン。</td></tr><tr><td>コラゲナーゼD</td>、<td>ロシュ</td><td>11088882001</td><td>コラゲナーゼD;アクティビティ: &ge;0.15 U/mg&nbsp;</td></tr><tr><td>ディスパーゼII</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D4693</td>バ<td>チルスpolymyxからのディスパーゼIIプロテアーゼ。アクティビティ: &ge;0.5 U/mgの固体。</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td>塩化カルシウム、無水、ビーズ、マイナス;10メッシュ、&ge;99.9%微量金属ベース&nbsp;</td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>114956-81-9&nbsp;</td><td>Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫基底膜由来のラミニン。</td></tr><tr><td>DMEM-高グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>ダルベッコ'のモディファイドイーグル」s中-高グルコース。4,500 mg / Lグルコースと重炭酸ナトリウムを使用し、L-グルタミンとピルビン酸ナトリウムは含まれていません。</td></tr><tr><td>F-12 media</td><td>Gibco</td><td>21765029</td><td>Ham's F-12 Nutrient Mix. 1x + L-グルタミン。</td></tr><tr><td>FGF-b</td><td>ペトロテック</td><td>100-18B&nbsp;</td><td>組換えヒト基本線維芽細胞成長因子。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>ウシ胎児血清。</td></tr><tr><td>馬用美容液 (HS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1270</td><td>馬用美容液ドナーの群れ、米国原産、滅菌ろ過済み。</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>ペニシリン-ストレプトマイシンと 10,000 ユニットのペニシリンと 10 mg ストレプトマイシン/mL の 0.9% NaCl を滅菌ろ過。</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>L-グルタミン溶液 200 mM、溶液、滅菌ろ過済み。</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td>トリプシン-EDTA溶液.0.25%、滅菌ろ過済み。</td></tr><tr><td>TrypLEエクスプレス&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12604-013</td><td>TrypLE Express Enzyme (1x)、フェノールレッドなし。</td></tr><tr><td>DPBS(細胞培養)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水。塩化カルシウム、塩化マグネシウムを含まない変性。</td></tr><tr><td>PBS(免疫染色)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td>リン酸緩衝生理食塩水錠剤。脱イオン水(0.01 Mリン酸緩衝液、0.0027 M塩化カリウム、0.137 M塩化ナトリウム、pH 7.4)200 mLあたり1錠</td></tr>。<tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーM</td><td>/ 4000 / PC17</td>メタ<td>ノール分析試薬グレード</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100分子生物学用。</td></tr><tr><td>抗MF 20抗体</td><td>DSHB</td><td>MF20-c 2ea 211 & micro;g / mlです。</td><td>MYH1E (MF 20) マウス mAb.</td></tr><tr><td>抗MyoD抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>13812P</td><td>MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb.</td></tr><tr><td>抗Ki67抗体</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td>Rabbit mAbをKi67 [SP6]に投与。</td></tr><tr><td>抗マウス488二次抗体&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td>ヤギ抗マウスIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor 488コンジュゲート。</td></tr><tr><td>抗ウサギ488二次抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11034</td><td>ヤギ抗ウサギIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor 488コンジュゲート。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)</td></tr><tr><td>老化 &β;-ガラクトシダーゼ染色キット</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>9860</td><td>老化 &β;-ガラクトシダーゼ染色キット。</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41639</td><td>ジメチルスルホキシド。BioUltra、分子生物学用、&ge;99.5%(GC).&nbsp;</td></tr><tr><td>アクリジンオレンジ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8097</td><td>アクリジンオレンジ塩酸塩溶液、10 mg/mL 含有 H2O。</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>臭化エチジウム溶液。BioReagent、分子生物学用、10 mg/mL、H2O中</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td></tr><tr><td>Scramble control for transfection</td><td>Qiagen</td><td>1027271</td><td>miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol)</td></tr><tr><td>Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay</td><td>Qiagen</td><td>218300</td><td>Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (成熟 miRNA: has-miR-378a-3p を標的とする)。MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC</td></tr><tr><td>Anti-has-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor</td><td>Qiagen</td><td>219300</td><td>Anti-has-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: has-miR-378a-3p).MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC</td></tr><tr><td>Megafuge 2.0 R 遠心分離機</td><td>ヘレウス</td><td>75003085</td><td>該当なし 遠心</td></tr><tr><td>分離機ローター</td><td>ヘレウス</td><td>3360</td><td>ヘレウス セパテック メガフュージ 遠心分離機ローター BS4402/A. 最大半径: 15.5 cm.</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E 倒立顕微鏡システム</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>接眼レンズ: CFI 10X/22;総倍率:100倍(MF20、ライブ/デッド、Ki67)。</td></tr><tr><td>Axiovert 200倒立顕微鏡</td><td>Carl Zeiss</td><td>n/a</td><td>接眼レンズ: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10X/25;総倍率:100倍(老化&β;-ガラクトシダーゼ染色)。</td></tr><tr><td>Axiovert 25倒立顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td>n/a</td><td>接眼レンズ: E-PL 10X/20.総倍率:100倍(明視野)。</td></tr><tr><td>Diaphot倒立組織培養顕微鏡</td>ニ<td>コン</td><td>n/a</td><td>接眼レンズ: CFWN 10X/20.総倍率:100倍(明視野)。</td></tr><tr><td>ハイドロマウント</td><td>ナショナルダイアグノスティック</td>ス<td>HS-106</td><td>ハイドロマウント</td></tr></tbody></table>

成人および高齢人間の骨格筋から筋原性前駆細胞/一次筋芽細胞の調製と文化

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

骨格筋の恒常性は、筋肉の成長（肥大）、萎縮と再生に依存します。老化の間、およびいくつかの疾患で、筋肉の消耗が発生します。筋肉量及び機能の喪失は、筋線維型萎縮、繊維型スイッチング、衛星細胞、筋肉幹細胞、および他の病態生理学的プロセスの機能不全に関連する欠陥筋再生に関連付けられています。これらの変化は、細胞内の変化だけでなく、局所的および全身のニッチと関連しています。倫理的な意味に筋肉の老化の最も一般的に使用されるげっ歯類モデルに加えて、筋肉のホメオスタシスおよびヒトモデルを使用して無駄を検討する必要があり、これは、主としてインビトロ培養物から成ります。人間の筋原性前駆細胞（MPCは）および筋形成における一次筋芽細胞の広範な使用にもかかわらず、加齢に関連したMUSの異なる側面を制御する分子メカニズムを研究するために、ヒト初代筋芽細胞および筋管培養を用いて上の限られたデータがあります老化のメカニズムの検証を助けるCLE消耗は、齧歯類の筋肉で提案されています。成人および高齢者から単離されたヒトのMPC、一次筋芽細胞および筋管の使用は、筋肉の成長、萎縮および再生に関連するプロセスの分子機構の生理学的に関連するモデルを提供します。ここでは詳細に人間のMPCとその子孫の単離および維持のため、堅牢で安価で、再現性と効率的なプロトコルを記述 - 酵素消化を用いて、ヒトの筋肉サンプルから筋芽細胞および筋管。さらに、我々は、成人および高齢者からの一次筋芽細胞は、 インビトロ培養で老化を起こすれる通過数を決定しました。最後に、我々はこれらの筋芽細胞およびそれらの増殖および分化能力を特徴付け、筋形成し、in vitroでの筋萎縮の分子機構の機能研究を行うための適性を提案する能力をトランスフェクトする能力を示します。 </p&gt;

MPC /一次筋芽細胞は、ラミニンでコーティングされた表面上に見える24時間後播種（ 図2）でなければなりません。細胞は紡錘状の形状を採用すべきであると通路4（ 図1A、B）にまだあるMyoDを表現しなければなりません。線維芽細胞は、それらの星状形態とのMyoD（ 図1B、C）の発現の欠如によって区別することができます。細胞は翌日に添付されると、メディアが新鮮なbFGFのメディアに置き換える必要があります。培地は48時間毎に交換する必要があります。 代表的な結果は、ここに示されていると私たちの分離と文化プロトコルをサポートし、ヒト一次筋芽細胞の機能的研究のために使用することができます異なる技術を実証するために、我々の研究室22目的のデータを公表しました。筋芽細胞の増殖はstaininを使用したKi67免疫染色と生存能力を使用して研究することができます細胞生存率アッセイのためにG（ 図3）。分化のために、培地を分化培地に変更されるべきです。筋管は5に形成すべきである- 7 dおよび（ 図3）重鎖正ミオシンします。筋芽細胞は、高齢者（ 図3）の筋肉から単離されたときに筋管形成はあまり効率的であることに注意してください。老化（SA-βガラクトシダーゼ）染色はまた、培養物中の老化細胞のパーセンテージを確立するために（ 図3）で行うことができます。私たちは、長い培養（ 図3、通路4）で、高齢者の筋肉から分離された複数の筋芽細胞が老化を示すことを観察しました。 機能的研究のために、遺伝子およびマイクロRNA発現は、発現ベクター、siRNAは、マイクロRNA模倣とantimiRs（ 図4）の親油性トランスフェクション試薬媒介送達を使用して操作することができます。これは、40を可能にします -遺伝子/マイクロRNAのレベルがアップされると、70％のトランスフェクション効率または生理学的範囲（ 図4; 22）内でダウンレギュレート。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 培養容器 </td><td> 約エリア（ウェルあたり） </td><td> 10μg/ mLのラミニンの巻 </td></tr><tr><td> 35mm皿</td><td> 10cm 2の</td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> 60ミリメートル皿</td><td> 20センチメートル2 </td><td> 2 mLの</td></tr><tr><td> 100ミリメートルディッシュ</td><td> 60センチメートル2 </td><td> 4 mLの</td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td> 2 cm 2の</td><td> 200μL/ウェル</td></tr><tr><td> 12ウェルプレート</td><td> 4センチメートル2 </td><td> 500μL/ウェル</td></tr><tr><td> 6ウェルプレート</td><td> 10cm 2の</td><td> 1 mLの/ウェル</td></tr><tr><td> T25 </td><td> 25cm 2の</td><td> 3 mLの</td></tr><tr><td> T75 </td><td> 75cm 2の</td><td> 5 mLの</td></tr></tbody></table> 表1。 コーティング培養表面のためのラミニンDPBSソリューション（10μg/ mL）の推奨最小容量。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 具体的な活動/モル質量 </td><td> 最終濃度 </td><td> 10 mL溶液に必要な質量または体積 </td></tr><tr><td> コラゲナーゼD </td><td> 0.15 U / mgで</td><td> 10mg / mL（1.5 U / mL）を</td><td> 100 mgの</td></tr><tr><td> ディスパーゼII </td><td> 0.5 U / mgで</td><td> 4.8 mg / mlで（2.4 U / mL）を</td><td> 48 mgの</td></tr><tr><td> 250 mMのCaCl 2を </td><td> 1100.98グラム/モル</td><td> 2.5 mMの</td><td> 100μL </td></tr></tbody></table> 表マッスル消化2.酵素製剤。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig1.jpg" /> 議定書の手順をまとめると図1.グラフィカルアブストラクト。ハサミでまたは外科用メス（I）を有するヒト筋生検の解離。 40分（II） - 30、37℃で酵素液とのインキュベーション。増殖培地を添加し、遠心分離管（III）に70μmのメンブランフィルターを通して溶液を濾過を通じて消化の終了。 5分（IV）の場合は443×gで遠心分離します。上清を廃棄し、2.5 ngの/ mLのFGF（V）を含有する増殖培地中で再懸濁します。 10で被覆されたディッシュ上に細胞をプレーティング81;ラミニンのグラム/ mLおよび24時間（VI）の後にメディアを変更します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig2.jpg" /> 別の通路で成人と高齢人間の筋肉から分離され、図2筋芽細胞。 。 （69±5歳、BMI &lt;25大人：30±2.8歳、高齢者）イメージは女性患者の指伸筋・ブレビスから単離された筋芽細胞、前脛骨筋または外転halluces筋肉を表します。継代0時とめっきされるの5日後、細胞はまだラウンドと小さいが、明るい光顕微鏡（A）の下に見えます。継代2（A）に示すように、筋芽細胞は、次に、細長い形状を採用します。 MyoDのは、線維芽細胞に筋芽細胞で発現していないが、<html> （B）。 MyoD陽性細胞の定量化を示します。エラーバーは標準偏差を示します。 n = 3の（B）。筋芽細胞および線維芽細胞の形態（C）との違いを実証する代表画像。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig3.jpg" /> 図3.ヒト一次筋芽細胞は、様々な染色技術を使用して特徴づけることができます。細胞の生存能力は、細胞生存率アッセイのために染色を用いて可視化することができ、増殖のKi67免疫染色を用いて評価することができ、分化は、MF20（ミオシン重鎖）免疫染色および老化を用いて評価することができる老化関連ベータガラクトシダーゼ（SA-βガラクトシダーゼを用いて可視化することができます）染色。<html> ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig3large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig4.jpg" /> 図4.ヒト一次筋芽細胞は、in vitroでの筋恒常性の機能的研究のために使用することができます。 A. MF20（ミオシン重鎖）筋管サイズと数にのmiR-378の過剰発現または抑制の効果を示す成人からの差別化の一次筋管の免疫染色。ヒト初代筋芽細胞におけるmiR-378の過剰発現または阻害後のmiR-378およびIGF1R、検証済みのmiR-378標的遺伝子の相対的発現を示すB.定量PCR。 RNU-6およびβ-2ミクログロブリンに対する発現は、それぞれ、示されています。エラーバーはSEMを示します。 N = 3、* - P &lt;0.05、スチューデントT検定。JPG &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

このプロトコルは、成人および高齢者の骨格筋からの単離および筋芽細胞の前駆細胞の培養の、堅牢で再現性と簡単な方法について説明します。ここで使用される筋肉は足と脚の筋肉を含みます。このアプローチは、機能的研究のための一次筋芽細胞の濃縮集団の単離を可能にします。

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

本プロトコルの全体的な目的は、成人および高齢のヒトから初代筋芽細胞を単離するための、堅牢で再現性が高く、簡便な手順を提供することです。本プロトコルでは、加齢に伴う筋肉の恒常性に関連するプロセスの機能研究のためのin vitroモデルとして、初代ヒト筋芽細胞を単離するための最適化されたワークフローを提案します。本プロトコルは、遠心分離などのストレス要因を避けることで細胞の自然な挙動を維持し、表現型を保持したままでの初代筋芽細胞の単離および長期培養を可能にします。まず、60 mLのペトリ皿または6ウェルプレートの2ウェルを用意します。次に、皿の表面を完全に覆う最小限の量のラミニン溶液をピペットで分注します。その後、細胞を播種する前に、培養皿を37 °Cの加湿インキュベーター内で少なくとも30分間インキュベートします。次に、無血清DMEMを用いて酵素溶液を調製します。よく混合し、滅菌のために0.2 µmのフィルターメンブレンで酵素溶液をろ過します。サンプル採取後、消化させるまで筋肉をDPBS中で4 °Cに保存します。18〜20 mgの筋肉組織に対し、2 mL以上の酵素溶液を調製し、組織解離前に37 °Cまで温めておきます。次に、筋生検サンプルを70%エタノールに短時間浸します。新鮮なDPBSで洗浄した後、再び70%エタノールで洗浄し、組織を新しいペトリ皿に移し、サンプルが完全に浸かる十分な量の酵素溶液を加えます。線維組織および脂肪組織を可能な限り取り除き、筋肉を小さく、かつ識別可能な大きさにまで慎重にちぎります。その後、サンプルを1 mL以上の酵素溶液が入った50 mLチューブに移します。組織を37 °Cで最大30分から40分間インキュベートし、5分から10分ごとにチューブを静かに撹拌して筋肉組織を動かします。次に、遊離した細胞がピペットのプラスチック壁に付着するのを防ぐため、ピペットを培地でコーティングします。その後、消化を停止させるために、4 mLの滅菌成長培地を加えます。ピペッティングを数回繰り返し、細胞が筋線維から遊離しやすくします。続いて、筋肉溶液を70 µmのセルストレーナーでろ過し、50 mLコニカルチューブに回収します。残った細胞をさらに培地で洗浄し、再びストレーナーでろ過します。次に、室温で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。5分後、上清を注意深く取り除きます。その後、ペレットをF12増殖培地で溶解させます。このステップでは、あらかじめラミニンでコーティングしインキュベーターに入れておいた培養容器を取り出します。培養皿から余分なラミニンを慎重に取り除き、表面に触れないように注意してください。その後、DPBSで培養皿を穏やかに洗浄します。次に、ラミニンでコーティングした容器に細胞を直接播種します。そして、37°Cの加湿インキュベーター内で24時間培養します。翌日、明視野顕微鏡下で細胞を観察します。小型の円形細胞が表面に接着し、残りのデブリは培養液中に観察されるはずです。その後、培養液を新鮮なF12培地に交換します。この手順では、2〜3日ごとに培地を交換し、自発的な分化を避けるため、顕微鏡下で細胞の集団が確認でき次第、細胞を継代してください。細胞の継代には、培地を除去し、DPBSで細胞を2回洗浄します。細胞表面を覆うのに十分な最小量の0.25% EDTAトリプシンを添加します。細胞がすべて剥離液で覆われるように静かに揺らし、室温で10秒間インキュベートした後、液を除去します。その後、細胞を37°Cの加湿インキュベーターで3〜5分間インキュベートします。軽くタッピングし、明視野顕微鏡下で細胞が丸まっているが、表面から完全に剥離していないことを確認します。次に、細胞を回収するために5 mLの増殖培地を加え、よく混ぜてから、新しい培地とともに細胞をT75フラスコに移します。続いて、残りの細胞をさらに5 millilitersの増殖培地で洗浄します。初回継代でプレプレートを行うには、細胞を37 degrees Celsiusで40分から1時間インキュベートします。その後、未接着細胞を含む上清を回収し、新しいT75フラスコでインキュベートします。ほとんどの線維芽細胞は最初のフラスコに接着しているはずであるため、これにより培養液と筋芽細胞が濃縮されます。2〜3日ごとに培地を交換してください。また、コンフルエンスが70%に達した時点で速やかに細胞を継代してください。分化させるため、細胞が70～80%のコンフルエンシーに達した時点で、培養液を分化培地に交換します。筋芽細胞培養の質と純度に応じて、細胞は5～7日以内に分化します。継代0回目で、播種から5日後、細胞はまだ小さく円形ですが、明視野顕微鏡下で観察可能です。その後、筋芽細胞は継代時と同様に伸長した形態になります。ここで示されているように、MyoDは筋芽細胞で発現していますが、線維芽細胞では発現していません。ヒト初代筋芽細胞は、細胞生存率の染色、増殖能を評価するKi67免疫染色、分化を評価するMF20免疫染色、および老化アッセイのための老化関連β-ガラクトシダーゼ染色を用いて特性評価が可能です。初代筋芽細胞は機能的に解析に利用可能です。この図では、成人ヒト由来の分化した初代筋管におけるMF20免疫染色により、miR-378の過剰発現または抑制が筋管のサイズと数に及ぼす影響を示しています。QPCR解析の結果、miR-378ミミックおよびアンチmiRの導入が成功し、ヒト初代筋芽細胞においてmiR-378の過剰発現または抑制が行われた後、miR-378およびその検証済み標的遺伝子であるLGF 1Rの相対的な発現量に変化が生じたことが示されています。この手法を習得すれば、2時間以内に完了させることができます。この堅牢で再現性の高いプロトコルは、セルソーティングのような、より高度で高価な手法が不可能または不実用的である場合に特に有用です。この簡略化された手法は、筋研究分野の研究者がヒトのin vitroモデルシステムを用いて加齢現象を探索する際に役立ちます。要約すると、本提案手法により、成人だけでなく高齢者の筋肉からも筋原細胞を単離することが可能となり、動物モデルにも適用可能なin vitroでの機能研究に活用できます。

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Developmental Biology

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