の栽培線虫（Caenorhabditis elegans）ラボにおける三次元で

この手順の全体的な目標は、自然条件をよりよくシミュレートできる線虫の3次元培養システムを製造することです。この方法は、Cエレガンスの発生、生理学、行動の分野における重要な質問に答えることができます。この手法のアイデアを最初に思いついたのは、3D環境である腐った果実における自然の線虫の行動を研究していたときでした。

この技術は、線虫が自然界の3D生息地に存在するため、標準的な2次元培養技術と比較して有利です。この方法はCエレガンスの栽培で開発されましたが、他の線虫にも適用できます。この手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるTong Young Leeです。

この手順を開始するには、オットークラーベで調製した溶液を摂氏121度で15分間クラーベします。次に、5ミリリットルあたり5ミリグラムで50ミリリットルの滅菌コレステロール溶液を調製します。50ミリリットルの円錐管に、0.25グラムのコレステロールと50ミリリットルの99.99%エタノールを加えてよく混ぜます。

次に、50ミリリットルのシリンジと0.45ベントシリンジフィルターを使用してコレステロール溶液を滅菌し、未発達のコレステロールを取り除きます。次に、10ミリリットルのリゾジェニーブロスにバクテリアを接種します。37°Cで接種した細菌を、振盪器で一晩培養します。

段階希釈の準備として、9ミリリットルの塩化ナトリウム溶液を7本の滅菌15ミリリットルの円錐管に割り当てます。Opi 50株Eコリの7倍希釈のテントを作る。その後、1ミリリットルの細菌培養物または希釈した細菌培養物を、9ミリリットルの塩化ナトリウム溶液を含む新しいチューブに取り出します。

そして、混合物をよく渦巻きにします。細菌培養物を調製した後、500ミリリットルのフラスコに0.6グラムの塩化ナトリウム、1グラムの粒状オーガー、0.5グラムのペプトンを加えます。マグネチックスターバーをフラスコに入れます。

次に、195ミリリットルの蒸留水を加え、フラスコをアルミホイルで覆います。次に、オットーはサンプルを摂氏121度で15分間クレーブします。その後、熱いオットークレーブフラスコを攪拌板に入れ、摂氏40度に達するまで少なくとも2時間適度な速度で攪拌します。

あるいは、フラスコを40°Cの水浴に15分間入れてから、攪拌板に移すことで、フラスコを40°Cに冷却することもできます。ここから続けるように、十分に冷ましてください。高温は完成したオーガーの曇りにつながる可能性がありますが、温度が低すぎるとオーガーが早期に硬化する可能性があります。

オーガー媒体の温度が摂氏40度に達したら、塩化カルシウム、コレステロール溶液、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム緩衝液を加え、溶液を攪拌し続けます。NGT-3D寿命アッセイでは、80マイクロリットルの150mmFUDRを培地に加えると、最終濃度は120マイクロモルになります。次に、6ミリリットルのオーガーメディアを滅菌円錐形チューブに移し、インキュベーターで保温します。

この培地は、無菌最上層に使用されます。次に、希釈した細菌培養物6ミリリットルを滅菌ベンチの上で直接フラスコに加えます。NGT-3Dの場合、6.5ミリリットルのメディアを8ミリリットルの透明なプラスチック試験管に注ぎ、バクテリアオーガー層を形成します。

そして、セミハード3Dメディアの上に200マイクロリットルのバクテリアフリーメディアを慎重に分配して、上に薄いバクテリアフリー層を作ります。次に、チャンバーのカバーをしっかりと閉じます。NGB-3Dの場合、25cm四方の透明なプラスチック細胞培養ボトルに65ミリリットルの培地を注ぎます。

次に、チャンバーを室温で1週間垂直に配置して、細菌のコロニーが少なくとも直径1ミリメートルのかなりのサイズに成長できるようにします。この手順では、L 4ステージワームを選別し、バクテリアフリーのNGMプレートに移します。次に、ワームが体からバクテリアを取り除くために、ワームが数分間自由に動き回るのを待ちます。

そして、手順をさらに2回繰り返します。その後、きれいなワームを3Dメディアの表面に慎重に置きます。ワームは実際にオーガーを3Dオーガーマトリックスに入力するはずでした。

その後、カバーをゆるく閉め、摂氏20度で96時間インキュベートします。4日後、蓋をしっかりと閉め、NGT-3D培養チャンバーを摂氏88度の水浴に入れてオーガーを溶かします。ガラスピペットを使用して、溶かした媒体を9cmのプラスチック製ペトリ皿に移します。

その後、透過型実体解剖顕微鏡を用いて、L3、L4、成虫の段階で線虫の数を数えます。ここに示すように、NGT-3Dの構造はシンプルでわかりやすいプロトコルであり、オーガー全体に小さな細菌コロニーが間隔を空けたオーガー充填試験管が得られます。NGT-3DでCエレガンスが減少して正常に成長できるかどうかを確認するために、生殖能力と幼虫の発育を3Dで標準の2D NGMプレートと比較します。

相対雛サイズアッセイでは、NGT-3Dの成虫Cエレガンス雌雄同体は、細菌コロニーが少なくとも60コロニーで豊富にある場合、標準的な2D MGMプレートの雌雄同体と同様に再現されました。さらに、NGT-3Dでの幼虫の発育は、細菌のコロニーがたくさんある場合も正常に進行し、96時間後には成虫の状態になります。ただし、3Dマトリックスに細菌のコロニーがまばらな場合、相対的な雛のサイズと幼虫の発育の両方に悪影響を及ぼします。

これは、NGT-3DまたはNGMプレートにおける野生型Cエレガンスの生存曲線です。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば3時間で完了できます。この手順に続いて、寿命アッセイや行動分析などの他の方法を実行して、老化と行動に関する質問に3Dで答えることができます。

この技術の開発後、この技術は、遺伝学の分野の研究者がCエレガンスの生態学と進化についての問題を探求する道を開く可能性があります。このビデオを見れば、3D実験室環境で線虫を培養する方法を十分に理解できるはずです。