Name: 尿サンプル中の無細胞DNAインテグリティ解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学ぶ尿サンプル中の無細胞DNAインテグリティ解析法。膀胱がんや前立腺がんの早期非侵襲的診断に応用でき、簡便な操作で特定のオンコジェン配列を評価します。尿や血清などの検体に対応可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、編集協力をしてくれたGráinne TierneyとSilvia Bellissimoに感謝します。

プロトコルは、IRSTヒューマン研究倫理委員会のガイドラインに従います。 注：この手順では、UCF DNAの完全性の分析を実行するために尿試料からDNAを単離しました。 LNCaPおよびMRC細胞株は、標準を構築するために使用しました。このような特定の癌遺伝子のためのDNAの抽出、DNAの定量（コントロール遺伝子について分光光度計、リアルタイムPCR、STOX1）、及びリアルタイムPCRのような技術は、（ 図1）を行いました。 1.尿収集および処理<ol><li>清潔で乾燥し、プラスチックカップでクリーンキャッチ最初の朝の尿サンプルを入手します。尿サンプルの少なくとも50ミリリットルを収集します。 </li><li> 3時間の最大4℃で尿を維持し、同じ温度で実験室に送信します。 </li><li> 2つの50 mLコニカル底ポリプロピレンチューブに研究室や転送に到着するとすぐにそれを2回反転させることにより、各サンプルを混ぜます。 </li><li>チューブを遠心4℃または室温で10分間、850×gで。 </li><li>慎重に細胞ペレットの上の上清のうちの少なくとも2ミリリットルを残して、2つの5 mLのチューブに、尿上清の上部10ミリリットルを転送します。 注：上清の上部を転送するには、細胞または細胞破片による汚染のリスクを低減します。上部と下部との間には明確な描写はありません。 </li><li>ペレットを捨て、すぐに使用するまで-80℃上清を凍結します。 </li></ol>尿上清および細胞株から2 DNA単離注：市販のキットを用い、製造業者の指示に従って細胞系（膀胱癌のための前立腺癌またはMRCために、例えば、LNCAP）からDNAを単離します。尿上清からのDNAの単離は、以下のように修正された、商業的プロトコルを使用して行われるべきです。 <ol><li>室温で尿上清の1つのアリコートを解凍します。&lt;/李&gt; <li>明確な5-mLのチューブに尿サンプルと転送尿上清1mLのを渦と混ぜます。 -80℃で残尿をフリーズします。 </li><li>サンプルに直接プロテイナーゼkの100μLを加えます。 </li><li>サンプルにAL緩衝液の1 mLを加え、ピペッティングによりよく混ぜます。 </li><li>チューブを閉じ、15分間56℃でサンプルをインキュベートします。 </li><li>インキュベーションの間、各サンプルごとに1カラムを作製し、製造業者の説明書（100％エタノールの指示された量を加える）に従って、洗浄バッファー、AW1およびAW2を準備します。 </li><li>室温に戻し、サンプルを持参し、無水エタノール1mLを追加。ピペッティングにより完全に混和します。 </li><li>列にステップ2.7で得られた混合物の650μLを加え、1分間6000×gでそれを遠心します。 </li><li>フロースルーを含むチューブを捨て、新しい、クリーンなコレクションチューブにカラムを配置します。サンプル混合物のすべてが（5回）に使用されるまで繰り返し、2.8と2.9の手順。 </li><li> 500＆を追加＃181;カラムの縁を濡らさないようにバッファAW1のL。 1分間6000×gでそれを遠心。 </li><li>フロースルーを含むチューブを捨て、新しい、クリーンなコレクションチューブと交換してください。 </li><li>カラムの縁を濡らさないようにバッファAW2の500μLを追加します。 3分間フルスピード（2万XG）でそれを遠心。 </li><li>フロースルーを含むチューブを捨て、新しい、クリーンなコレクションチューブと交換してください。 </li><li>任意の残留洗浄バッファーを除去するための手順を繰り返し2.12。 </li><li>きれいな1.5 mLチューブにカラムを置きます。溶出バッファーAEの50μLを加え、カラムを濡らすバッファことを確認するために、7分を待ちます。 </li><li> 1分間8000×gでそれを遠心。 </li><li>ミニカラムにステップ2.15から溶離液をピペットとDNAの最大の回収率を確保するために、1分間最大速度でそれを遠心します。 </li></ol> 3. DNA定量化および希釈<ol><li>分光光度計を使用して、ボットからのDNAの定量化を行いますH細胞株および尿上清試料。製造元の指示に従って、ベンチトップ分析計で試料を2μLを使用してください。 </li><li> 1ng /μLの濃度を取得し、DNAの完全性の分析まで-20℃でDNAを保存するためにUCF DNAサンプルを希釈します。 注：DNA量をリアルタイムPCR（少なくとも100 ngの）を続行するのに十分でない場合、新たなDNAの単離処理を行います。 </li><li> 0.001 0.01、0.1、1、0.5、2 NG /μL、100μL（ST1、ST2、ST3、ST4、ST5の体積でそれぞれ、および：異なる濃度の6水準を得るために、細胞株サンプルからDNAを希釈ST6）。 DNAの完全性の分析まで-20℃で細胞株DNA標準を保管してください。 </li></ol> 4. DNA完全性試験 - PCR <ol><li>プライマー（濃度はアッセイの種類によって異なります）、グリーンスーパーミックス、細胞株のDNA標準、および氷上でUCF DNA希釈した試料を解凍します。 </li><li>プレートFのストリップチューブを準備または72ウェルロータディスク。小分けした各標準および希釈サンプルおよび陰性対照のためのRNaseフリー水10μLの重複で10μL。 </li><li>各サンプルについて、各プライマーの1μL（濃度は表1に示されている）、グリーンスーパーミックスの12.5μL、およびRNaseフリー水6.5μLのミックスを調製します。 2複製のための6の標準、2反復のサンプル数、2複製、および2エキストラサンプルの陰性対照：ミックスを調製する場合、サンプルの次の番号を使用します。 </li><li>各ウェルにミックスのアリコート15μL。ピペット又はチューブをスピンしないでください。 </li><li> 表1に示したPCR条件でプロトコルを起動します。 注：29×2サンプル+ 6×2標準+ネガティブコントロール×2 = 72（UCF DNA値）：UCF DNA値の場合、29のDNAサンプルを72ウェルのロータディスクを使用して、各リアルタイム実験のために処理しました。 注：UCF DNAインテグリティ解析のためのプロトコルもすることができます（他のデバイスを使用する場合、ROX色素を添加する必要があるかもしれない）他のリアルタイムPCR装置を用いて行きました。 </li></ol> 5. DNA完全性試験 - データ分析と解釈注：以前に7-9（ 図2）に記載のように各サンプルのUCF DNA値は、各個々のPCR遺伝子の評価のための標準曲線の構築を用いて、標準曲線の補間を使用してリアルタイム機器検出システムソフトウェアによって得ました。 <ol><li>複製を評価します。サンプルはCtは破棄され、第二の実験で再評価されなければならない≥1違いで複製します。 </li><li>各試料についての中央値のCtを計算し、36≤Ct値とサンプルを検討してください。 </li><li>融解分析を使用して、PCR産物の特異性を評価します。 </li><li>標準曲線との補間によって各アンプリコンの濃度を評価します。各アンプリコンのための濃度値（ngの/μL）を得ました。</li>
</ol>

<ol><li>Francis, G., Stein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Cell-Free+Tumour+DNA+in+the+Management+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Mol.Sci%22%5BJournal%5D)">Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer.</a> Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).</li>
<li>Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Nucleic+Acids+in+Urine%3A+Sources%2C+Structure%2C+Diagnostic+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential.</a> Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).</li>
<li>Szarvas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+analysis+of+tumor+and+urinary+DNA+to+detect+bladder+cancer%3A+urine+supernatant+versus+urine+sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.Rep%22%5BJournal%5D)">Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment.</a> Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).</li>
<li>Togneri, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+complexity+of+urothelial+bladder+cancer+revealed+in+urinary+cfDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Hum.Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA.</a> Eur.J.Hum.Genet. , (2016).</li>
<li>Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+DNA+Integrity%2C+Applications+for+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Clin.Chem%22%5BJournal%5D)">Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research.</a> Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).</li>
<li>Hao, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+DNA+in+serum+as+a+biomarker+for+diagnosis+and+prognostic+prediction+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer.</a> Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+Cell-Free+DNA+Integrity+Analysis+for+Early+Detection+of+Prostate+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.Markers%22%5BJournal%5D)">Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients.</a> Dis.Markers. 2015, 574120(2015).</li>
<li>Casadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+cell-free+DNA+integrity+as+a+marker+for+early+prostate+cancer+diagnosis%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.Res.Int%22%5BJournal%5D)">Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study.</a> Biomed.Res.Int. 2013, 270457(2013).</li>
<li>Casadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+cell-free+DNA+integrity+as+a+marker+for+early+bladder+cancer+diagnosis%3A+preliminary+data%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.Oncol%22%5BJournal%5D)">Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data.</a> Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li>
<li>Ishkanian, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+array+CGH+identifies+novel+regions+of+genomic+alteration+in+intermediate-risk+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer.</a> Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).</li>
<li>Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Her-2%2Fneu+oncogene+amplification+in+clinically+localised+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Patho%22%5BJournal%5D)">Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer.</a> J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).</li>
<li>Nord, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+amplifications+are+associated+with+high+grade+and+recurrences+in+stage+Ta+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma.</a> Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).</li>
<li>Tabach, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+the+20q+chromosomal+arm+occurs+early+in+tumorigenic+transformation+and+may+initiate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer.</a> PLoS One. 6 (1), e14632(2011).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

UCF DNAの完全性の分析は、尿中のDNAの完全性を評価するための新しい、非侵襲的方法です。最近、膀胱9および前立腺癌7,8の早期診断のために提案されました。 UCF DNA完全性テストの利点と欠点の数は、一緒に将来の見通しで、ここで説明されています。 アプローチの主な利点は、それが安価で、非侵襲的な方法と分子生物学的手法の基本的な知識を必要とするバイオマーカーの潜在的な供給源として尿を研究するためのシンプルなプロトコルを提供することです。テストは、2作業日後に実行するために迅速、かつその結果、利用可能です （ 図1）は 、容易に医師の助けを借りずに解釈することができます。唯一のDNA単離プロセスおよび2リアルタイムPCRをからなる、アプローチはまた、良好な費用便益比を有します。精度の点では、UCF DNAの完全性を検出する高感度（73％）及び特異度（84％）を有します症状のある患者9における膀胱癌。最後に、この方法は柔軟性があり、提案の遺伝子...

無細胞DNAは、アポトーシスまたは壊死の機構によって、血液および細胞死に起因する尿中で検出することができます。血中の無細胞DNAは、広く様々な疾患における診断および予後目的、特に癌1のために研究されています。ただし、以下は、尿、無細胞（UCF）DNAの役割について知られています。 UCF DNAは、糸球体濾過システムを介して、または、この体液2（ 例えば、尿路上皮細胞または前立腺細胞）との接触に直接来て、細胞から通過する血液に由来し得ます。バイオマーカーの供給源としてUCF DNAの使用は、主に尿路細胞3,4から直接UCF DNAの割合が高いと、腎、膀胱、前立腺癌の早期診断のために検討されています。 リトルは、UCF DNA単離とそれを特徴付けるための最良の方法について知られています。腫瘍細胞は正常細胞よりも長いDNA断片を放出するという仮説評価与えられました無細胞DNAの完全性は、血液循環5にDNAの起源を解明する試みにおいて研究されてきました。いくつかの研究は、血液中の無細胞DNAの完全性は、癌6多くの種類のための良好な診断テストを表し、同じ仮説が尿7-9に関連して提案されていることを実証しました。 本稿では、膀胱および前立腺癌の検出への適用の可能性とともに、UCF DNAインテグリティ解析のための新しい方法を説明します。具体的には、UCF DNAの完全性は、より長い250bpのが前立腺癌および膀胱癌を含む固形腫瘍において増大したDNAコピー数を有することが知られている4つの領域において試験したよりフラグメント：C-MYC（8q24.21）、HER2を （17q12.1 ）、BCAS1（20q13.2）、およびAR（Xq12）10-14。特定の癌遺伝子ではなく、ランダムな配列は、癌患者の無細胞画分でそれらを発見する確率を高めるために選択しました。の主な利点の一つこの方法は、柔軟であり、他の領域は、腫瘍の種類や特性に基づいて選択することができるということです。

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNAミニキット &nbsp;</td><td>キアゲン</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&nbsp;グリーンスーパーミックス、100 x 50 & マイクロ;L rxns、2.5 mL (2 x 1.25 mL)</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>IDTカスタムDNAオリゴ&nbsp;</td><td>IDT&nbsp;</td><td></td><td>HPLC精製、100nMole DNAオリゴ</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>その他の分光光度法もDNAの定量に使用できました</td></tr><tr><td>Rotor-Gene 6000</td><td>Corbett</td><td></td><td>別のリアルタイムPCR装置は、</td></tr><tr><td>50mLチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td>用の1つの遠心分離機をマイクロ遠心分離<td></td><td></td><td></td></tr>機で使用することもできます<tr><td>インキュベーター-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>C冷凍庫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20°;C冷凍庫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &#956;Lピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &#956;Lピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &#956;Lピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &#956;L ピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ (10; 20; 200; 1,000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ローターディスク 72 ローター</td><td>コーベット</td><td>9018899</td><td></td></tr><tr><td>ストリップ チューブおよびキャップ、0.1 mL (250)</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td></td></tr><tr><td>コレクションチューブ(2 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer AL (264 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (10 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr></tbody></table>

尿サンプル中の無細胞dnaインテグリティ解析

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

血漿または血清中の無細胞循環DNAの存在は、広く多くの種類の癌のためのバイオマーカーの適切な供給源であることが示されているが、いくつかの研究は、尿、無細胞（UCF）DNAの潜在的な使用に焦点を当ててきました。正常なアポトーシス細胞が高度に細分化DNAを作製し、その癌細胞はより長いDNAを解放仮説から出発し、UCF DNAの完全性の潜在的な役割は、前立腺や膀胱癌および健康な個体の患者とを区別することが可能な早期診断マーカーとして評価しました。 C-MYC、BCAS1、HER2、およびAR：UCF DNAの完全性の分析は、250塩基対よりも長い4系統の4定量的リアルタイムPCRのもとに提案されています。しばしば、膀胱および前立腺癌において増加したDNAのコピー数を有する配列は、分析のために選択したが、この方法は柔軟性があり、そしてこれらの遺伝子は、INTEの他の遺伝子で置換することができ残り。バイオマーカーの供給源としてUCF DNAの潜在的な有用性は、すでにこのようにUCF DNAの特性化に関するさらなる研究のための道を開く、泌尿器科悪性腫瘍のために実証されています。 UCF DNAの完全性試験は、非侵襲的、迅速、かつ実行が容易で、分析を行うために必要な尿のわずか数ミリリットルであるという利点を有します。

全遊離DNA濃度は、1.51の間および138 ngの/μLの範囲を示す、分析したすべてのサンプルについて、分光光度法により定量可能でした。五対照試料は、データの再現性のために使用した二つの独立したリアルタイムの実験は、C-MYC、HER2、BCAS1、AR、及びSTOX1について実施しました。変動（CV）の係数は、2つの独立した実験間の再現性の良好度（ 表2）を用いて、各遺伝子（ 表2）を計算しました。 125-bpのSTOX1配列は、PCR阻害剤の存在を除外するために分析されました。サンプルはSTOX1の増幅が認められた場合は、UCF DNAの完全性試験を実施しました。増幅の欠如は、DNA量がTを繰り返す必要性を示し、UCF DNAの完全性...

尿サンプルの無細胞上清分画のDNA完全性を分析する方法が提案されています。この方法は、泌尿器科悪性腫瘍の早期発見に適しており、膀胱がんの早期診断に正確であることが証明されています。

尿サンプル中の無細胞DNAインテグリティ解析

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

この方法の全体的な目標は、特定のがん遺伝子配列における尿中無細胞DNAの完全性を評価することです。この方法は、膀胱がんや前立腺がんの早期非侵襲的診断など、泌尿器がん分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、実行と分析が簡単なことです。この技術の意味は、泌尿器科悪性腫瘍は通常、尿中の細胞と遊離核酸を放出するため、泌尿器科悪性腫瘍の診断にまで及びます。この方法は尿サンプルに関する洞察を得ることができますが、血清や血漿などの他のシステムにも適用できます。一般に、この方法に不慣れな人は、尿中の無細胞DNAの濃度が低いことが多いため、苦労するでしょう。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、膀胱がんの非侵襲的な早期発見のための簡単な方法を見つけようとしたときでした。手順を開始するには、摂氏4度で3時間以内保存された50ミリリットルのきれいなキャッチファーストモーニング尿サンプルを入手します。サンプルを2回反転させ、サンプルを2本の50ミリリットルの円錐形遠心チューブに分割します。サンプルをGの850倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、各チューブについて、上清の上部の10ミリリットルを2本の5ミリリットルのチューブに移し、ペレットの上に少なくとも2ミリリットルの上清を残します。ペレットを捨て、上清をマイナス80°Cで保存します。必要に応じて、追加の尿サンプルに対してこのプロセスを繰り返します。DNA精製を開始するには、各サンプルについて尿上清のアリコートを解凍します。解凍したサンプルをボルテックスし、チューブを2回反転させます。サンプルの1ミリリットルを5ミリリットルのチューブに入れ、残りを摂氏マイナス80度で保存します。尿サンプルに適したDNA精製キットをメーカーの指示に従って調製してください。100マイクロリットルのプロテイナーゼKと1ミリリットルの溶解バッファーをサンプルに加え、ピペットでよく混合します。サンプルを摂氏56度で15分間インキュベートします。インキュベーション中に、スピンカラムで洗浄バッファーを調製します。インキュベーション後、サンプルを室温まで冷ましてから、1ミリリットルの無水エタノールを加え、ピペッティングでよく混合します。サンプルの650マイクロリットルをカラムに移します。Gの6000倍で1分間遠心分離します。収集チューブを交換し、すべてのサンプルがカラムにロードされるまでこのプロセスを繰り返します。次に、500マイクロリットルの第1洗浄バッファーを加え、カラムを6000倍のGで1分間遠心分離します。収集チューブを交換し、500マイクロリットルの2番目の洗浄バッファーを追加し、カラムを最大速度で3分間遠心分離します。カラムを清潔な収集チューブに入れ、さらに3分間最高速度で遠心分離して、残留洗浄バッファーを除去します。カラムを清潔な1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。50 マイクロリットルの溶出バッファーをカラムにロードし、バッファーをカラムに 7 分間浸漬します。次に、カラムをGの6000倍で1分間遠心分離します。溶出液をピペットでカラムに戻し、カラムを最大速度で1分間遠心分離して、尿中の無細胞DNAを取得します。スタンダードの調製を開始するには、まず精製キットを使用して適切な細胞株からDNAを単離します。キットの製造元の指示に従って、細胞株内の精製された各尿サンプルから分光光度計を使用してDNAを定量します。UCF DNAを1マイクロリットルあたり1ナノグラムに希釈し、希釈したサンプルを完全性試験の準備が整うまで摂氏マイナス20度で保管します。細胞株DNAを希釈して、濃度の異なる6つの100マイクロリットル標準試料を作成します。標準は摂氏マイナス20度で保管してください。DNAインテグリティ試験を開始するには、UCF DNAサンプル、スタンダード、適切なPCRプライマー、およびグリーンスーパーミックスを氷上で解凍します。次に、72ウェルローターディスクプレートをストリップチューブでセットアップします。標準液の10マイクロリットルアリコートを2つ入れ、次に各サンプルをウェルに入れます。ネガティブコントロールとして、10マイクロリットルのRNaseフリー水のウェルを2つ用意します。充填したウェルごとに、各プライマー1マイクロリットル、12.5マイクロリットルのグリーンスーパーミックス、および6.5マイクロリットルのRNaseフリー水の混合物を調製します。15マイクロリットルの混合物を充填された各ウェルに移し、次にウェルを72ウェルローターディスクに移します。PCRは、メーカーの仕様に従ってリアルタイム装置で行ってください。装置ソフトウェアを使用して、サイクリング閾値に1つ以上の差がある反復があるかどうかを確認します。これらのサンプルを解析から破棄し、残りのサンプルのサイクリング閾値の中央値を評価します。サイクリング閾値の中央値が36以下の各サンプルで融解分析を行い、PCR産物の特異性を評価します。次に、標準曲線を使用して、各アプリケーションの濃度をナノグラム/マイクロリットルで決定します。尿中無細胞DNAを単離し、固形腫瘍でDNAコピー数の増加を示す4つの領域でDNAの完全性を評価しました。また、各サンプル中のDNA量が完全性試験に十分であることを確認するために、コントロール配列も評価しました。総遊離DNA濃度と変動係数は、各遺伝子について計算しました。この方法では、膀胱がんの検出に73%の感度と84%の特異度を示しますが、前立腺がんの感度と特異度は58%にとどまります。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば1営業日で行うことができます。この手順に続いて、デジタルPCRや次世代シーケンシングなどの他の方法を実行して、目的の遺伝子のコピー数誘導剤などの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、尿から無細胞DNAを非常に簡単な方法で単離する方法や、リアルタイムPCRアプローチを使用して特定の関心領域の完全性を研究する方法について、十分に理解できるはずです。

cell-free-dna-integrity-analysis-in-urine-samples

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

本稿では葉緑体 ER 以下の低頻度の変異を検出するための手法を説明しますこのメソッドは、2 方向エラー訂正、特別なバック グラウンド...

次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

ここでは、ドロップオフ ddPCR と加水分解プローブの一意のペアを使用して単一の反作用で対象地域の複数の遺伝子の変異を正確に定量化するためのプロトコルを提案する.

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

提示された診断FL-DNAキットは、大腸癌病変の存在の信頼性の高い確率を決定するための時間を節約し、ユーザーフレンドリーな方法です。...

便DNA完全性検出による大腸癌リスクと罹患率の評価

ここでは、患者の生体液(生体流体)に存在する循環DNAにおける腫瘍体細胞変異を検出するプロトコルを提示する。当社の液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)ベースの方法は、腫瘍変異アレーリン周波数(MAF)の定量化を可能にし、腫瘍応答の診断および時間的モニタリングに最小限に侵襲的な補体を促進する。...

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

ここでは、病変の高感度かつ正確な定量のための方法 8-オキソ-7, 8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-デオキシアデノシン (1,n6-茶道) および 1,n2-etheno-2'-デオキシグアノシン (1,N2-dGuo) DNA で.この方法は、曝露された A/J マウスの組織 (肺、肝臓および腎臓) における周囲微細粒子状物質 (PM2.5)...

質量分析による3つの DNA 病変の定量化と、周囲の微細粒子状物質に曝露したマウスの組織におけるそのレベルの評価

本論文では、非侵襲的な液体生検法の詳細なプロトコルを紹介し、血液採取、血漿およびバフィーコート分離、cfDNAおよび生殖系列DNA抽出、cfDNAまたは生殖系列DNAの定量、cfDNA断片濃縮分析を含む。...

がん患者の血漿サンプルにおける無細胞DNAの検出

ウラシル-DNAグリコシラーゼ活性をアッセイするための非標識、非放射性同位体法が、直接アプリン/アピリミジン部位含有生成物分析のためのMALDI-TOF質量分析法を用いて開発された。このアッセイは、DNAグリコシラーゼ測定に非常にシンプルで、特異的で、迅速で、使いやすいことが証明されました。...

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析分析によるウラシル-DNAグリコシラーゼアッセイ

コメットアッセイは、DNA損傷を検出するための一般的な手段です。この研究では、コメットアッセイの代表的なバリアントでスライドを実行するためのアプローチについて説明します。このアプローチにより、サンプル数が大幅に増加し、アッセイの実行時間、スライド操作の回数、およびゲルの損傷のリスクが軽減されました。...

細胞DNA損傷を評価するためのハイスループットコメットアッセイアプローチ

リキッドバイオプシーは、腫瘍学のトランスレーショナル研究へのアプローチに革命をもたらし、サンプルの収集、品質、および保管は、臨床応用を成功させるための重要なステップです。ここでは、ほとんどのトランスレーショナルリサーチラボで適用できる、下流の循環のないDNAアプリケーションのための標準化され検証されたプロトコルについて説明します。...

下流循環フリーDNAアプリケーションのための標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル

このプロトコルでは、CRISPR-Casを介した多検体合成尿バイオマーカー検査について説明しており、腫瘍関連プロテアーゼ活性のex...

携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

このプロトコルは、非小細胞肺がん(NSCLC)ホルマリン固定パラフィン包埋組織における標的化可能なゲノム変化を検出するための、自動化されたISO15189認定の次世代シーケンシングワークフローを記述しています。...

次世代シーケンシングを用いた非小細胞肺がんにおける標的変化の検出

学ぶ尿サンプル中の無細胞DNAインテグリティ解析法。膀胱がんや前立腺がんの早期非侵襲的診断に応用でき、簡便な操作で特定のオンコジェン配列を評価します。尿や血清などの検体に対応可能です。

尿サンプル中の無細胞DNAインテグリティ解析

さらに動画を探す