尿サンプル中の無細胞DNAインテグリティ解析

この方法の全体的な目標は、特定のがん遺伝子配列における尿中無細胞DNAの完全性を評価することです。この方法は、膀胱がんや前立腺がんの早期非侵襲的診断など、泌尿器がん分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、実行と分析が簡単なことです。

この技術の意味は、泌尿器科悪性腫瘍は通常、尿中の細胞と遊離核酸を放出するため、泌尿器科悪性腫瘍の診断にまで及びます。この方法は尿サンプルに関する洞察を得ることができますが、血清や血漿などの他のシステムにも適用できます。一般に、この方法に不慣れな人は、尿中の無細胞DNAの濃度が低いことが多いため、苦労するでしょう。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、膀胱がんの非侵襲的な早期発見のための簡単な方法を見つけようとしたときでした。手順を開始するには、摂氏4度で3時間以内保存された50ミリリットルのきれいなキャッチファーストモーニング尿サンプルを入手します。サンプルを2回反転させ、サンプルを2本の50ミリリットルの円錐形遠心チューブに分割します。

サンプルをGの850倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、各チューブについて、上清の上部の10ミリリットルを2本の5ミリリットルのチューブに移し、ペレットの上に少なくとも2ミリリットルの上清を残します。ペレットを捨て、上清をマイナス80°Cで保存します。

必要に応じて、追加の尿サンプルに対してこのプロセスを繰り返します。DNA精製を開始するには、各サンプルについて尿上清のアリコートを解凍します。解凍したサンプルをボルテックスし、チューブを2回反転させます。

サンプルの1ミリリットルを5ミリリットルのチューブに入れ、残りを摂氏マイナス80度で保存します。尿サンプルに適したDNA精製キットをメーカーの指示に従って調製してください。100マイクロリットルのプロテイナーゼKと1ミリリットルの溶解バッファーをサンプルに加え、ピペットでよく混合します。

サンプルを摂氏56度で15分間インキュベートします。インキュベーション中に、スピンカラムで洗浄バッファーを調製します。インキュベーション後、サンプルを室温まで冷ましてから、1ミリリットルの無水エタノールを加え、ピペッティングでよく混合します。

サンプルの650マイクロリットルをカラムに移します。Gの6000倍で1分間遠心分離します。収集チューブを交換し、すべてのサンプルがカラムにロードされるまでこのプロセスを繰り返します。

次に、500マイクロリットルの第1洗浄バッファーを加え、カラムを6000倍のGで1分間遠心分離します。収集チューブを交換し、500マイクロリットルの2番目の洗浄バッファーを追加し、カラムを最大速度で3分間遠心分離します。カラムを清潔な収集チューブに入れ、さらに3分間最高速度で遠心分離して、残留洗浄バッファーを除去します。

カラムを清潔な1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。50 マイクロリットルの溶出バッファーをカラムにロードし、バッファーをカラムに 7 分間浸漬します。次に、カラムをGの6000倍で1分間遠心分離します。

溶出液をピペットでカラムに戻し、カラムを最大速度で1分間遠心分離して、尿中の無細胞DNAを取得します。スタンダードの調製を開始するには、まず精製キットを使用して適切な細胞株からDNAを単離します。キットの製造元の指示に従って、細胞株内の精製された各尿サンプルから分光光度計を使用してDNAを定量します。

UCF DNAを1マイクロリットルあたり1ナノグラムに希釈し、希釈したサンプルを完全性試験の準備が整うまで摂氏マイナス20度で保管します。細胞株DNAを希釈して、濃度の異なる6つの100マイクロリットル標準試料を作成します。標準は摂氏マイナス20度で保管してください。

DNAインテグリティ試験を開始するには、UCF DNAサンプル、スタンダード、適切なPCRプライマー、およびグリーンスーパーミックスを氷上で解凍します。次に、72ウェルローターディスクプレートをストリップチューブでセットアップします。標準液の10マイクロリットルアリコートを2つ入れ、次に各サンプルをウェルに入れます。

ネガティブコントロールとして、10マイクロリットルのRNaseフリー水のウェルを2つ用意します。充填したウェルごとに、各プライマー1マイクロリットル、12.5マイクロリットルのグリーンスーパーミックス、および6.5マイクロリットルのRNaseフリー水の混合物を調製します。15マイクロリットルの混合物を充填された各ウェルに移し、次にウェルを72ウェルローターディスクに移します。

PCRは、メーカーの仕様に従ってリアルタイム装置で行ってください。装置ソフトウェアを使用して、サイクリング閾値に1つ以上の差がある反復があるかどうかを確認します。これらのサンプルを解析から破棄し、残りのサンプルのサイクリング閾値の中央値を評価します。

サイクリング閾値の中央値が36以下の各サンプルで融解分析を行い、PCR産物の特異性を評価します。次に、標準曲線を使用して、各アプリケーションの濃度をナノグラム/マイクロリットルで決定します。尿中無細胞DNAを単離し、固形腫瘍でDNAコピー数の増加を示す4つの領域でDNAの完全性を評価しました。

また、各サンプル中のDNA量が完全性試験に十分であることを確認するために、コントロール配列も評価しました。総遊離DNA濃度と変動係数は、各遺伝子について計算しました。この方法では、膀胱がんの検出に73%の感度と84%の特異度を示しますが、前立腺がんの感度と特異度は58%にとどまります。

一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば1営業日で行うことができます。この手順に続いて、デジタルPCRや次世代シーケンシングなどの他の方法を実行して、目的の遺伝子のコピー数誘導剤などの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、尿から無細胞DNAを非常に簡単な方法で単離する方法や、リアルタイムPCRアプローチを使用して特定の関心領域の完全性を研究する方法について、十分に理解できるはずです。