January 4th, 2017
細胞外マトリックスは、細胞の微小環境を定義し、細胞の挙動と表現型を調節する上で主要な役割を果たします。細胞由来の細胞外マトリックスを迅速に単離する方法について説明し、顕微鏡、生化学的、プロテオミクス、または機能的な研究のさまざまなスケールに適応できます。
この手順の全体的な目標は、さまざまな下流実験のために培養細胞から細胞外マトリックスを分離し、正常組織および疾患プロセスにおける細胞外マトリックスの機能と特性を理解することです。この方法は、細胞外マトリックスの組織化、分子組成、タンパク質相互作用、機能特性など、細胞外マトリックス分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。また、細胞外マトリックスは、任意の接着細胞型から調製することができます。
この技術の主な利点は、細胞を効率的に除去し、細胞外マトリックスタンパク質を保持するために、さまざまなスケールで実行できることです。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるSilvia Rosiniと、ポスドク研究員のAndrew Hellewellです。まず、カバー上のプレート細胞スリップを使用して、生細胞と細胞外マトリックスまたはECMのイメージングを行います。
蛍光顕微鏡研究の場合、固定ECM。または、小規模な機能研究のための細胞由来ECMの調製に。細胞を適切な温度と湿度で、細胞がECMを沈着させるのに適した時間インキュベートします。
通常は 16 時間以上かかります。抽出フードで、脱イオン水を使用してストック溶液を1〜14に希釈することにより、適切な容器に20ミリモルの水酸化アンモニウムを準備します。インキュベーターから細胞を取り出し、培地を静かに取り出します。
次に、カルシウムやマグネシウムを含まないPBSを皿の壁にそっと注ぎます。皿を2回揺らし、液体を注ぎます。次に、洗濯をさらに2回繰り返します。
抽出フードで、最後のPBS洗浄液を取り外し、60ミリメートル皿あたり1.5ミリリットルの水酸化アンモニウムを追加し、プレートを室温で5分間インキュベートします。すべての細胞が溶解するように、毎分皿を穏やかに攪拌します。次に、各皿に大量の脱イオン水を加え、プレートを揺らします。
次に、水酸化アンモニウム、溶解細胞、脱イオン水で構成される水酸化アンモニウム可溶化材料を注ぎます。不溶性ECM層を大量の脱イオン水でさらに4回洗浄し、水酸化アンモニウム可溶化物がすべて完全に除去されるようにします。細胞は、脱イオン水で大量に洗浄して完全に除去することが不可欠です。
これらのステップが適切に行われないと、細胞物質がディッシュに残り、下流の分析を汚染する可能性があります。免疫蛍光法によるECMの試験では、残りの脱イオン水を除去し、2%パラホルムアルデヒド(略してPFA)を添加してECMを固定し、室温で10分間ディッシュをインキュベートします。PBSを使用して各固定サンプルを2回洗浄し、溶液を廃液容器に廃棄してから、テキストプロトコルに従って蛍光顕微鏡検査を実施します。
層流フードでは、カルシウムとマグネシウムを含まないPBS、20ミリモルの水酸化アンモニウム、および脱イオン水の滅菌溶液を、滅菌済みの0.2マイクロメートルフィルターを通過して適切な滅菌容器に調製します。滅菌技術を維持しながら、滅菌PBSを使用して、カバースリップ上のマトリックス産生細胞を3回優しく洗浄します。最終的なPBS洗浄液を取り出した後、1.5ミリリットルの滅菌水酸化アンモニウムを60ミリメートル皿に加え、室温で5分間インキュベートし、断続的に揺さぶる。
ロッキングしながら大量の滅菌脱イオン水を皿に加え、細胞溶解物を適切な廃液容器に注ぎます。この洗浄をさらに4回繰り返して、可溶化した物質が完全に除去されるようにします。テキストプロトコルに従って細胞をトリプシン化し、ペレット化した後、試験細胞を新鮮な滅菌培地に再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
次に、適切な数の試験細胞と培養培地を無菌分離ECMのカバースリップにプレートし、2〜3時間または必要な時間インキュベートします。アクチン細胞骨格の組織化を調べるには、試験細胞を2%PFAに固定し、FITC-Phalloidinで染色してF-アクチンを可視化し、DAPIで核を可視化します。多数の細胞を培養した後、ビデオの前半で示したように細胞を取り出してECMを洗浄した後、各プレートを斜めに傾けて皿の底に残った水分を排出し、P200ピペットを使用してプレートが完全に乾くまで残った水分を慎重に取り除きます。
同時に、100ミリモルDDTを含むSDS-PAGEサンプルバッファーを摂氏95度に2分間加熱し、イムノブロットで検査する各100ミリメートルプレートに200マイクロリットルを追加します。セルスクレーパーを使用してサンプルを皿の片側に集め、200マイクロリットルのピペットチップを使用してチューブに移します。ECMを質量分析法で分析するには、ディッシュからSDS-PAGEサンプルバッファーを採取し、摂氏95度に再加熱し、同じアリコートを2〜3枚のプレートに追加して使用して、より濃縮されたサンプルを調製します。
セルスクレーパーの先端に残っているSDS-PAGEサンプルバッファー抽出物をチューブに移し、ECM材料の損失を最小限に抑えます。単離されたECMをSDS-PAGEサンプルバッファーに効果的に抽出するには、サンプルバッファーを95度に加熱し、還元剤を含有させ、プレートを広範囲に掻き取ることが不可欠です。ここに示されているのは、ガラスカバースリップ上に増殖したCOS-7細胞です。
水酸化アンモニウム処理は、細胞核およびアクチン細胞骨格の喪失によって確立されたように、細胞を効果的に除去した。この図では、COS-7細胞にRFPタグトロンボスポンジン-1をトランスフェクションしています。そして、ECMは水酸化アンモニウム処理の前後で視覚化されました。
両方の画像で同定された蛍光点は、ECMに関連していると推測されます。この実験では、ヒトの真皮線維芽細胞を水酸化アンモニウムで除去し、ECMを抗コラーゲン1抗体でプローブしたところ、特徴的な腓骨および網目染色パターンが示されました。ここに示すように、水酸化アンモニウム抽出ラット軟骨肉腫細胞からECM上でフィブロネクチン染色を行った。
この例では、RCS細胞で産生した無菌ECMに試験COS-7細胞を2時間播種し、FITC-ファロイジン染色によりF-アクチン組織について分析しました。COS-7細胞が独自のECMを産生するのと比較すると、この実験では、ラット軟骨肉腫細胞からECMを単離し、ECM由来タンパク質をSDS-PAGEで分離しました。
そして、4つの主要なバンドを分離し、質量分析法で分析しました。フィブロネクチン、トロンボスポンジン-1および5、およびマトリリン-1が同定されました。最後に、ヒト真皮線維芽細胞の内因性ECMをイムノブロッティングによって分析しました。
フィブロネクチンとトロンボスポンディン-1は検出されましたが、細胞内タンパク質のα-チューブリンとベータアクチンは検出されませんでした。水酸化アンモニウムによる細胞の除去と、3つの100mm皿からの高温SDS-PAGEサンプルバッファーによるECMの抽出は、適切に実行されれば1時間で完了します。この手順を試みるときは、細胞を除去するために毎回新鮮な水酸化アンモニウム作業溶液を作成することを忘れないでください。
また、脱イオン水で大量の洗浄液を使用して、すべての細胞を確実に除去することも非常に重要です。この手順に続いて、抽出されたECMのプロテオミクス分析などの方法を実行して、異なる細胞タイプによって生成されるECMタンパク質の相対的な存在量などの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、細胞培養皿から細胞を効率的に除去する方法とECMを抽出する方法について十分に理解できるはずです。
パラホルムアルデヒドの取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、抽出フードでの作業や個人用保護具の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
この記事では、培養細胞から細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)を分離する迅速な方法を提示し、様々な実験規模に適応させることができます。この技術は、細胞挙動におけるECMの役割と正常および疾患状態におけるその意味を研究するために重要です。
Rapid, scalable isolation of cell-derived extracellular matrix (ECM) enables high-confidence functional studies and biochemical analyses critical for early discovery and target validation. This method addresses a key bottleneck in ECM research by providing reproducible, contamination-minimized ECM preparations suitable for diverse downstream workflows. Its adaptability across adherent cell types supports portfolio-wide translational research and mechanistic de-risking.
This ECM isolation method integrates seamlessly from early discovery through lead identification and preclinical research, enabling robust hypothesis testing and downstream analytics.