GFPタグTMEM184Aを使用すると、ヘパリン受容体のアイデンティティの確認のために構築します

GFPタグ付きコンストラクトを使用する全体的な目標は、GFPをハンドルとして使用して、これまで知られていなかったタンパク質の同一性を確認することです。この方法は、特定の酵素活性が確認できない場合のオーファン遺伝子の機能的同定に役立ちます。この手法の主な利点は、GPFタグを使用すると、同じコンストラクトをいくつかのタイプの実験に使用できることです。

一般に、この方法に不慣れな個人は、トランスフェクションが必ずしもストロングコンストラクトの発現をもたらすとは限らず、細胞が常に復活するとは限らないため、問題を抱える可能性があります。この手法のアイデアを思いついたのは、タンパク質に対して作られた抗体だけでタンパク質を特定することの難しさを認識し始めたときでした。まず、目的の細胞を1ミリリットルのHEPES緩衝生理食塩水エレクトロポレーションバッファーに再懸濁し、すぐに細胞を氷上に置きます。

十分な量のGFP-TMEM184Aタグ付き血漿を細胞に加えて、DNA1ミリリットルあたり20マイクログラムの最終濃度を達成し、約0.4ミリリットルの細胞を事前に冷却したエレクトロポレーションキュベットに移します。細胞をエレクトロポレーションします。次に、トランスフェクションした細胞を組織培養皿に観察し、皿を細胞培養インキュベーターに24〜72時間置きます。

トランスフェクションステップは、細胞が生存せず、GFPタグ付きコンストラクトの有意なレベルを発現していない場合、残りの実験作業の大部分を効果的に完了できないため、手順の最も重要なステップです。適切な実験時点で、GFPプラスミド発現細胞培養培地に1ミリリットルあたり100マイクログラムのローダミンヘパリンを添加し、蛍光顕微鏡で観察されるように所望の染色レベルに達するまで、光から保護された細胞をインキュベートします。次に、PBSで細胞をすすぎ、光から保護された数秒間の穏やかな振とうを行い、続いて4%パラホルムアルデヒドで室温で15分間穏やかに振とうします。

GFPタグ付きローダミンヘパリンの共局在を評価するには、適切なGFPおよびローダミン励起レーザーと減少レーザーを備えた共焦点顕微鏡を使用して、各ラベリング実験から少なくとも50個の細胞をイメージングします。適切な画像解析プログラムで画像を調べ、フリーハンドツールを使用して各蛍光画像内の細胞を丸で囲むことにより、各細胞における相対的なローダミンの所見と取り込みを決定します。測定ツールを使用して、各円で囲まれた空間内の強度を決定し、蛍光強度データをスプレッドシートにエクスポートして、強度を掛けた面積を計算し、各セルの同じ面積のバックグラウンドを差し引きます。

その後、細胞あたりの蛍光をすべての細胞について平均化して、統計的に有意なデータを取得できます。GFP TMEM184Aからローダミンヘパリンへの蛍光共鳴エネルギー移動を促進するために、まず、固定GFP TMEM184Aトランスフェクションされたローダミンヘパリン標識細胞をガラス顕微鏡スライドにマウントします。405ナノメートルで細胞を励起してローダミン放出をイメージングし、続いて488ナノメートルで励起してGFP発光をイメージングします。

次に、細胞を561ナノメートルで励起し、2回目のローダミン発光イメージングを行います。ローダミンヘパリン取り込みの生細胞イメージングでは、GFP TMEM184Aトランスフェクト細胞の100ミリリットルのコンフルエントディッシュ培養物を635ミリメートルの生細胞イメージングディッシュに播種して、コンフルエンスに近い細胞を取得します。48時間後、上清をフェノールレッドを含まない培地に交換し、細胞の皿を摂氏37度に設定された加温段階の共焦点顕微鏡に移します。

顕微鏡の焦点を合わせ、1ミリリットルあたり100マイクログラムのローダミンヘパリンを穏やかに混合しながら細胞に加えます。その後、すぐにライブ画像の録画を開始します。視野内でヘパリンの取り込みが起こらない場合は、ディッシュを少し動かして、ローダミンラベルを含む少なくとも1つの緑色の小胞を持つ細胞を特定します。

in vitroでのヘパリン結合評価では、黒色のアチバンコーティングされた96ウェルプレート1枚と黒色のノンコーティング96ウェルプレート1枚を200マイクロリットルの0.2%CHAPS PBS pro-wellで5分間の洗浄を3回、振とうしながらすすぎます。最後の洗浄後、ビオチン化抗GFPのウェルあたり100マイクロリットルの60ピコモルを、各GFP検出グループのアチバンコーティングプレートに三重に添加します。次に、コントロールウェルのみにバッファーを添加し、すべてのウェルをプレートカバーでシールし、室温で振とうしながら2時間インキュベーションします。

インキュベーションの最後に、先ほど示したように、すべてのウェルをCHAPS PBSで3回洗浄し、GFP TMEM184Aのウェルあたり5ナノモルの100マイクロリットル、またはGFPのみをアチバンコーティングプレートの適切なウェルに加えます。室温で振とうしながら1時間のインキュベーションを行った後、すべてのウェルを新鮮なCHAPS PBSで洗浄し、各実験用フルオレセイン-ヘパリン濃度の100マイクロリットルを、適切なテストウェルに三重に、アチバンコーティングプレートに加えます。アチバンコーティングされたプレートとコーティングされていないプレートの両方に濃縮標準を添加し、両方のプレートを室温で10分間インキュベートし、光から保護して振とうします。

次に、プレートリーダーを使用して、両方のプレートのコントロールウェルでの初期ヘパリン蛍光発光と、固定化されたGFPまたはアチバンコーティングプレート内のGFP TMEM184Aを持つウェルからの初期全蛍光発光を記録します。次に、固定化したGFP TMEM184AまたはGFPを備えたウェルから、非結合蛍光ヘパリンを非コーティングブラックプレートの対応するウェルに移します。コーティングされていない黒板の蛍光発光をすぐに読み取った後、フルオレセイン-ヘパリンを除去したウェルに100マイクロリットルの新鮮なCHAPS PBSを戻し、これらのウェルの蛍光発光を読み取り、コーティングされていないプレートで除去された未結合のサンプルから蛍光発光を取得します。

すべての非結合読み取り値が取得されたら、ヘパリン放出の合計値を使用して、値から平均バックグラウンド読み取り値を差し引くことにより、各ウェルに正しいレベルのヘパリンが追加されたことを確認します。次に、蛍光と添加された総フルオレセイン-ヘパリンのスペクトルのプロットを作成して、放出のスケールとヘパリンの量を決定し、GFPウェルとGFP TMEM184Aウェルの両方からのトリプリケートについて、修正された結合ヘパリンと追加されたヘパリンをプロットします。トランスフェクション後の時間の長さは、GFP TMEM184Aの分布に影響を及ぼし、少なくとも72時間にわたって蓄積すると考えられ、時間の経過とともに準核領域でより多くのGFPが明らかになります。

この代表的な血管細胞培養におけるGFPの染色パターンは、C末端ペプチドに対して産生された抗体の染色パターンに最も類似していると考えられ、GFPがタンパク質のC末端にあることを考えると、これは論理的な結果です。フルオレセイン-ローダミン-ヘパリンリガンドの使用は、リガンド受容体の共局在の経時的なリアルタイム評価にも使用できます。GFPではヘパリンの取り込みが増加しTMEM184Aトランスフェクションされた安定ノックダウン細胞が構築され、その結果、野生型細胞のレベル以上でローダミンヘパリンを内在化する能力を取り戻すことができる細胞が得られます。

実証されたプラスミドコードGFPタクトシステムを用いて、抗GFP抗体単離GFP TMEM184Aコンストラクトは特異的なサトリプルヘパリン結合を実証するが、対照GFPはヘパリンに結合しない。抗体による単純な免疫蛍光染色 GFPは、非透過化細胞における抗体アクセスに基づいて、GFPの位置に関する情報も提供することができ、原形質膜で発現するGFPが細胞外であることを示す予備的な証拠を提供します。この手法を習得すると、24時間から48時間の培養後に優れたGFPコンストラクトの発現が得られます。

ライブイメージングプロトコルを試行する際には、一部の細胞が共局在の取り込みを示さない可能性があるため、他の細胞を調べる必要があることが多いことを覚えておくことが重要です。GFPリガンドとの結合アッセイは、特にGFPタンパク質が界面活性剤ミセル中にある場合、GFPタンパク質の二量体または高次の凝集体によって複雑になる可能性があります。全体として、GFPタグ付きタンパク質の発現は、これまで知られていなかったタンパク質の同定を確認するためのさまざまな実験を容易にすることができます。