Name: GFPタグTMEM184Aを使用すると、ヘパリン受容体のアイデンティティの確認のために構築します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学ぶGFPタグTMEM184A構築によるヘパリン受容体の同定法。電気穿孔と蛍光顕微鏡を用いて血管細胞でタンパク質機能を解析し、オーファン遺伝子の機能的同定に有用な手法を示します。

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>jove_content<Lowe-Krentz研究室での研究は、国立衛生研究所からLLKへの研究助成金HL54269によってサポートされています。

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここで報告されたプロトコルは、血管細胞1におけるヘパリン受容体としてTMEM184Aの同定のための確証的な証拠を提供するように設計されました。ノックダウン技術は、日常的に、新規なタンパク質の同定を確認するための1つのメカニズムとして使用されます。しかし、ノックダウン後のいくつかの機能の損失は、典型的には、候補タンパク質が実際に正しい受容体（または他の機能性タンパク質）であることを十分な証拠はありません。候補タンパク質が実際に機能を発揮するという証拠を持っていることも重要です。 GFPでタグ付けされた新規遺伝子ための構築物を採用することにより機能実験の利得を可能にし、GFPの親和性に基づいて、タグ付けされたタンパク質の単離を容易にします。このプロトコルに用いられるエレクトロポレーションは、（細胞の80％以上は、構築物を発現）構築物の非常に高いトランスフェクション効率を促進しました。エレクトロポレーションが使用可能かどうか、所望でない場合は、他のトランスフェクション機構を使用することができます。新規タンパク質の機能を確認するためにGFPタグ付き構築物を選択するいくつかの利点があります。まず、G...

新規な機能のための候補タンパク質の同定は、多くの場合、部分配列決意が続く親和性に基づく分離プロトコルに依存します。新たに同定されたタンパク質の最近の例は、膜貫通タンパク質184A（TMEM184A）、ヘパリン親和性相互作用1後に同定ヘパリン受容体、およびTgPH1、ホスホイノシチドPI（3,5）P 2 2を特異的に結合するプレクストリン相同ドメインタンパク質が含まれます。その他の新規タンパク質の同定は、このような、 らビタミンによって、そのようなペプチドの直接配列分析を必要とします。人は、以前に特徴付けられていない遺伝子3からタンパク質産物を識別するために、膜貫通ペプチドを使用していました。同様に、新規のタンパク質配列の同定は、このような新しい4TMタンパク質4の識別として以前に特徴付けられるタンパク質ファミリーの探索バイオインフォマティクスを用いて達成することができます。アクアポリンファミリー遺伝子配列の検査は、Alを有しますそのように新しい機能5と新メンバーの同定をもたらしました。識別後、タンパク質機能の解析は、しばしば、このようなアクアポリンの場合のように、タンパク質機能の特異的なアッセイを用いて試験することができる次のステップは、典型的には。 可能な場合は、新たに同定されたタンパク質の機能は、特定の酵素または類似のインビトロ機能アッセイを用いて調べることができます。新規タンパク質の多くの機能が唯一無傷の細胞または生物で発生する複雑な相互作用に依存しているため、in vitroアッセイは、必ずしも有効ではありません。しかし、 インビボアッセイは、それらが遺伝子配列に依存するように設計されなければなりません。細胞培養、および/または単純なモデル生物では、ノックダウンは、タンパク質/機能同定6のための証拠を提供することができます。上記のように同定された新規のタンパク質と、単に機能を確認するために、タンパク質をノックダウンすることがしばしば不十分です、D遺伝子配列に依存してin vivoでの機能アッセイの設計は、新規タンパク質の特徴付けのために重要になります。 ノックダウンは、識別と一致する結果が得られた後、ヘパリンレセプターとしてTMEM184Aの最近の同定は、アフィニティークロマトグラフィーおよびMALDI MS 1を使用して（すなわち、血管平滑筋および内皮細胞における炎症応答において増殖を調節する）、7は、アッセイのコレクションを開発する機会を提供し。最近のレビューは、ヘパリンは、多くの増殖因子、それらの受容体、細胞外マトリックス成分、細胞接着受容体、および他のタンパク質8と特異的に相互作用することが確認されました。血管系では、ヘパリンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカン（ヘパリンと同様の構造でヘパラン硫酸鎖を含む）は、数百のタンパク質9と相互作用します。機能的に股関節を確認するために、トンTMEM184Aはヘパリンの取り込みと結合に関与していた、TMEM184Aための遺伝子構築物を使用される技術が開発されました。本レポートでは、GFP-TMEM184Aに基づくアッセイのコレクションはヘパリン受容体としてTMEM184Aの身元を確認するのに使用するための構築物が含まれます。

<table><tbody><tr><td>GFP-TMEM184A コンストラクト</td><td>OriGene</td><td>RG213192</td><td></td></tr><tr><td>ローダミン-ヘパリン</td><td>クリエイティブ PEGWorks</td><td>HP-204</td><td>感光</td></tr>性フル<tr><td>オレセイン-ヘパリン</td><td>クリエイティブ PEGWorks</td><td>HP-201</td><td>感光</td></tr>性 <tr><td>Mowiol</td><td>EMD Millipore</td><td>475904-100GM</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA, メタノールフリー)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech,フィッシャーのフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>のPI28908</td>を通じて入手可能 <td>ヒュームフード</td></tr>の<tr><td>反応結合ニュートラアビジンプレート(アビジンコーティングされた黒96ウェル皿)</td>のフィ<td>ッシャーサイエンティ</td>フィックPI15510を通じて、<td>フィッシャー</td>のフィッシャーサイエンティフィックを通じて、<td>保存性に注意してください</td></tr><tr><td>黒96ウェルプレート</td>コーニングライフサイエンスプラスチック、フィ<td></td>ッシャーA7r5<td></td>血管平滑筋細胞の<td>フィッシャーサイエンティフィック064432を通じて購入</td></tr><tr><td>ライン</td><td>ATCC</td><td>CRL 1444</td><td>MEM培地1</td></tr><tr><td>BAOECウシ大動脈内皮細胞</td>に交換可能 <td>Cell Applications, Inc.</td><td>B304-05</td><td>最初に推奨される培養は、継続培養のためのMEM培地に交換することができます1,7</td></tr><tr><td>BAOSMCウシ大動脈平滑筋細胞</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>B354-05</td><td>最初に推奨される培養は、継続培養のためにMEM培地に交換することができます1</sup</td></tr><tr><td>>RAOECラット大動脈内皮細胞</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>R304-05a</td> 培養は、最初に推奨されているように、Fisher Scientific MA5-15256-BTIN ストレプトアビジンコーティングビーズ Sigma S1638 HeBS Bio-Radから入手可能な、Fisher Scientific MA5-15256-BTIN Streptavidinコーティングビーズ Sigma S1638 <td>HeBS を通じて、MEM培地に交換して継続培養することができます7</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>Bio-Radから入手可能 ラボで調製することができます。<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>pHは、</td></tr><tr><td>N末端</td>に対する6.8 TMEM184A抗体です <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc292006</td><td>N末端領域に対する唯一の既知のTMEM184A抗体です。</td></tr><tr><td>C末端に対するTMEM184A抗体</td><td>ProSci Inc, Poway, CA&nbsp;</td><td>Pro Sci 5681</td><td>ProSci Figure 1</td></tr><tr><td>GFP抗体</td>で使用 <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc9996</td><td>Figure 5</strong</td></tr><tr><td>>二次抗体で使用され、TRITCまたはCy3で標識</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA</td><td>711 025 152 (ロバ抗ウサギ、TRITC) 715 165 150 (ロバ抗マウス、 Cy3)</td><td>交差反応性が最小限で、非特異的な染色を最小限に抑えます。</td></tr><tr><td>CHAPS</td> Sigma <td>C5849</td><td>から購入</td><td>このカタログ番号は廃止されました。&nbsp;サプライヤーは、交換に関する情報を提供します。</td></tr><tr><td>ライブイメージング 35mmディッシュ</td><td>MatTek (Ashland MA)</td><td>P35G-1.0 &ndash; 20 mm - C</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta 63倍油浸レンズ付き</td><td>Figure 1, 2 and 3</td></tr> <tr><td>Confocal Microscope</td><td>Nikon</td><td>C2+ confocal with a <</td><td>strong>Figure 5</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 880 63倍油浸レンズ付き</td><td>Figure 2C</td></tr><tr><td>エレクトロポレーション装置</td>での画像に使用 <td>バイオ・ラッド</td><td>遺伝子パルサー X細胞システム</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット</td><td>MidSci</td><td>EC2L</td>から入手可能 <td>機器サプライヤーからも入手できます</td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td></td><td>TECAN TECAN Infinite&reg; m200 Proプレートリーダー</td><td>読み取り値は、表面ではなく井戸の中央にあります。</td></tr><tr><td>染色強度測定用コンピュータプログラム</td><td>画像J</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/ オンラインで入手可能なプログラムと情報</td><td>適切なプログラムを使用することができます。詳細については、https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html を参照してください&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>細胞培養トリプシン溶液</td><td>Sigma</td><td>T4174</td>を<td>10x溶液として購入</td></tr></tbody></table>

gfpタグtmem184aを使用すると、ヘパリン受容体のアイデンティティの確認のために構築します

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

新規タンパク質は、親和性に基づく分離やバイオインフォマティクス解析によって識別されると、彼らはしばしば、主に特徴付けられていないです。予測される配列内の特定のペプチドに対する抗体は、いくつかのローカライズ実験を可能にします。しかし、抗体と他の可能な相互作用は、多くの場合、除外することはできません。この状況は、タンパク質配列に依存するアッセイのセットを開発する機会を提供しました。具体的には、タンパク質のC末端にGFPコード配列に連結された遺伝子配列を含む構築物が得られ、これらの目的のために使用しました。局在化、リガンド親和性、および機能の利得を特徴付けるための実験は、最初に設計し、ヘパリン受容体1としてTMEM184Aの同定を確認するために行きました。さらに、構築物は膜トポロジーの問題に取り組む研究および詳細なタンパク質 - リガンド相互作用のために使用することができます。本報告書は、ARを提示します簡単に他の新規タンパク質のために適合させることができる血管細胞で発現したGFP-TMEM184A構築に基づいて実験プロトコルのアンジュ。

、理論的には、任意のDNAのトランスフェクション細胞への構築物は、親油性のトランスフェクション試薬を用いて達成することができるが、これまでの報告は、GFPのより効果的なトランスフェクションはエレクトロポレーション12を使用して、内皮細胞への構築物を示します。ここに提供されたプロトコルは、一般的に使用される主要由来内皮細胞および平滑筋細胞の80％以上でGFP構築物の発現を達成しました。採用コンストラクトのデザインが急速にこの構築物を提供できる市販のシステムを使用していました。主な目的とする用途には最適な真核生物のタンパク質発現および継続的な構築物の生産に伴って、膜に従って正しい配信、場所の問題に焦点を当てた第一に考慮しました。含めることができますその他の考慮事項：折り畳まれた領域の一部であるC末端、wantiの可能性と異なって局在するタンパク質またはタンパク質のためのGFPの別の場所（プロテアーゼ切断部位を追加）、GFPを除去するためのngの、および二次親和性部位。後者は、GFP構築物を精製し、結合アッセイのために表面上でそ...

真核生物の発現のために設計されたカルボキシ末端にGFPタグを有する構築物をコードするTMEM184Aは、血管細胞中のヘパリン受容体としてTMEM184Aの同定を確認するために設計されたアッセイに使用しました。

GFPタグTMEM184Aを使用すると、ヘパリン受容体のアイデンティティの確認のために構築します

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

GFPタグ付きコンストラクトを使用する全体的な目標は、GFPをハンドルとして使用して、これまで知られていなかったタンパク質の同一性を確認することです。この方法は、特定の酵素活性が確認できない場合のオーファン遺伝子の機能的同定に役立ちます。この手法の主な利点は、GPFタグを使用すると、同じコンストラクトをいくつかのタイプの実験に使用できることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、トランスフェクションが必ずしもストロングコンストラクトの発現をもたらすとは限らず、細胞が常に復活するとは限らないため、問題を抱える可能性があります。この手法のアイデアを思いついたのは、タンパク質に対して作られた抗体だけでタンパク質を特定することの難しさを認識し始めたときでした。まず、目的の細胞を1ミリリットルのHEPES緩衝生理食塩水エレクトロポレーションバッファーに再懸濁し、すぐに細胞を氷上に置きます。十分な量のGFP-TMEM184Aタグ付き血漿を細胞に加えて、DNA1ミリリットルあたり20マイクログラムの最終濃度を達成し、約0.4ミリリットルの細胞を事前に冷却したエレクトロポレーションキュベットに移します。細胞をエレクトロポレーションします。次に、トランスフェクションした細胞を組織培養皿に観察し、皿を細胞培養インキュベーターに24〜72時間置きます。トランスフェクションステップは、細胞が生存せず、GFPタグ付きコンストラクトの有意なレベルを発現していない場合、残りの実験作業の大部分を効果的に完了できないため、手順の最も重要なステップです。適切な実験時点で、GFPプラスミド発現細胞培養培地に1ミリリットルあたり100マイクログラムのローダミンヘパリンを添加し、蛍光顕微鏡で観察されるように所望の染色レベルに達するまで、光から保護された細胞をインキュベートします。次に、PBSで細胞をすすぎ、光から保護された数秒間の穏やかな振とうを行い、続いて4%パラホルムアルデヒドで室温で15分間穏やかに振とうします。GFPタグ付きローダミンヘパリンの共局在を評価するには、適切なGFPおよびローダミン励起レーザーと減少レーザーを備えた共焦点顕微鏡を使用して、各ラベリング実験から少なくとも50個の細胞をイメージングします。適切な画像解析プログラムで画像を調べ、フリーハンドツールを使用して各蛍光画像内の細胞を丸で囲むことにより、各細胞における相対的なローダミンの所見と取り込みを決定します。測定ツールを使用して、各円で囲まれた空間内の強度を決定し、蛍光強度データをスプレッドシートにエクスポートして、強度を掛けた面積を計算し、各セルの同じ面積のバックグラウンドを差し引きます。その後、細胞あたりの蛍光をすべての細胞について平均化して、統計的に有意なデータを取得できます。GFP TMEM184Aからローダミンヘ

using-gfp-tagged-tmem184a-construct-for-confirmation-heparin-receptor

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

我々のGPCRの様​​々な標的位置に非天然アミノ酸p-アジド-L-フェニルアラニンを遺伝的に符号化し、異なる用途におけるアジド基の汎用性を示している。これらは、GPCRのリガンド結合ポケットに残基を同定するために目標と光架橋技術、およびペプチドエピトープタグまたは蛍光プローブでのGPCRの部位特異的バイオ直交修飾を含む。...

遺伝的にコードされた分子プローブは、Gタンパク質共役受容体を研究する

ここでは、GABA海馬ニューロンにおける受容体表面局在およびエンドサイトーシスを測定するために、ブンガロトキシンをαに結合された蛍光Alexaの色素の使用を示す。 α-ブンガロトキシンに結合する細胞外の短いタグを有する構築物の使用によって、血漿膜タンパク質のエンドサイトーシス輸送の分析を達成することができる。...

GABA A受容体の膜局在化および輸送を研究するために、α-ブンガロトキシン結合部位タグを使用して

この原稿では、T細胞抗原受容体(TCR)と抗原性ペプチドをロードしたMHC分子との間の結合ダイナミクスを測定するための(単一分子)フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)ベースのアッセイの実施方法について説明します。これらの機能化された平面支持脂質二重層と接触しているT細胞の免疫学的シナプス内で発生します。...

TCR-のpMHCが結合を測定します<em&gt;その場で</em&gt; FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して

核膜タンパク質は、多くの基本的な生物学的プロセスにおいて中心的な役割を果たしており、さまざまなヒトの病気に関与しています。...

細胞特異的にLINC複合体を破壊するマウスモデルの検証

継承された不整脈は、しばしば、一つ以上のイオンチャネルの表面の配信を変更する突然変異によって引き起こされます。ここでは、TSA-201細胞で発現された組換えイオンチャネルの相対的な合計および細胞表面タンパク質発現の定量化を提供するために、フローサイトメトリーアッセイを適合させます。...

フローサイトメトリーを用いた組換えイオンチャネルの相対的な細胞表面および合計式の決意

安易な蛍光アッセイであるアミノ アミノアシル tRNA-合成酵素/tRNA ペア哺乳類細胞で発現したタンパク質に非正規のアミノ酸 (ncAAs) を組み込むことの効率を評価する. します。サイトと bioorthogonal GPCR の生きているセルのラベルを連結する光橋マッピングを含む ncAAs の G タンパク質共役受容体 (Gpcr)...

光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における Bioorthogonal 化学の Gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化

ここでは、ネイティブなタグ無料モノマーのミリグラム量と小さなユビキチン関連修飾子 (相撲) の一時的な融合に基づくハンチンチン蛋白質 (Httex1) の exon1 の線維の生産のための堅牢な最適化されたプロトコルを提案する.

ネイティブ、タグなしの Huntingtin Exon1 モノマーと相撲の融合戦略を使用して線維の生成

このプロトコルは、バキュロ ウイルス システムを効率的に最小限の労力と毒性、蛋白質の抽出、精製、哺乳類細胞の遺伝子を表現するために使用を含むクライオ電子顕微鏡によるイオン チャネルの構造を決定するために使用方法をについて説明します品質チェック、サンプル...

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

本稿では、細胞外受容体とリガンドの相互作用を同定するためのゲノムスケール細胞ベースのスクリーニングアプローチについて述べる。...

ゲノムスケールCRISPR/Cas9遺伝子スクリーンを用いた細胞表面受容体同定

本稿では、サッカロマイセス・セレビシエで過剰発現したカンジダ・アルビカンスABC(ATP結合カセット)タンパク質Cdr1の特性評価のための小規模な血漿膜分離プロトコルを提示する。プロテアーゼ切開性C末端mGFPCdr1とタグの間に16残基リンカーを備えた二重タグは、Cdr1の精製および洗剤スクリーニングを容易にするように設計された。...

カンジダ・アルビカンスCdr1-mGFPHisの分析のための小スケールプラズマ膜調製

学ぶGFPタグTMEM184A構築によるヘパリン受容体の同定法。電気穿孔と蛍光顕微鏡を用いて血管細胞でタンパク質機能を解析し、オーファン遺伝子の機能的同定に有用な手法を示します。

GFPタグTMEM184Aを使用すると、ヘパリン受容体のアイデンティティの確認のために構築します

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