生後マウスにおける聴覚ブラの解剖：中耳の骨の単離および組織学的解析

解剖手順の全体的な目標は、聴覚水疱とカプセルを分離し、続いて出生後マウスから個々の聴覚耳小骨を分離して、さまざまなホールマウントおよび組織学的分析を行うことです。この方法は、形態形成不良、軟骨内骨化、ミネラル代謝不良のメカニズムなど、創傷生物学の分野における重要な問題に対処するために使用できます。この方法は、解剖学的詳細に関する深い知識に基づいています。

一般に、生物学的システムとしてマウスに不慣れな個体は、ヒトの中耳に関する知識がマウスの対応物に適用できない可能性があるため、苦労する可能性があります。その手順を実演していただくのは、私の研究室の技術者である坂本綾子さんです。まず、聴覚水疱と周囲の頭蓋骨を含むカプセルを、室温でリン酸緩衝生理食塩水pH7.4を含む標本皿に入れます。

双眼解剖顕微鏡で、ここに示すように、聴覚嚢を囲む頭蓋骨を特定します。1セットの鉗子を使用して周囲の頭蓋骨をつかみ、2セット目を使用して基底蝶形骨と後頭骨を引き離します。次に、鉗子を使用して、頭頂間骨と頭頂骨をカプセルからそっと引き離し、完全に緩んだら取り外します。

次に、扁平上皮を水疱とカプセルから引き離し、骨と軟組織を優しく引き離します。次に、外耳をつかみ、標本を裏返して内側を露出させます。次に、検体を180度回転させ、カプセルをつかんで残りの軟組織を引き離します。

背側の紋章が見えてきました。この角度では、内耳道、亜弓状窩、および前半規管の顔面神経と前庭蝸牛神経がはっきりと見えます。背側稜を解剖皿の底に向けて角度を付けると、聴覚の水疱がはっきりと見えます。

製剤がわずかに傾いていると、くるぶしが水疱内に見えます。鉗子を使用して、くるぶしの上の外耳道と鼓膜溝の外側を骨折することから始めます。1 つ目のファクチャの前方に 2 つ目のファクチャを作成します。

次に、鼓膜が見えるように外耳道の一部を取り除きます。次に、腹側壁と後壁の両方で、鼓膜の一部とマレアル突起近くの鼓膜骨を切除します。くるぶし、インカス、アブミ骨、鼓膜張筋が露出するはずです。

くるぶしを持ち上げ、27ゲージの針の斜めのエッジでテンソルティンパニ筋を切断します。マレアル糞尿は、他の哺乳類に見られるように、鼓膜にしっかりと付着していることに注意してください。胆汁のくるぶしの前突起を骨折することにより、小骨関節の内尖からくるぶ

鉗子を使用して、くるぶしを聴覚水疱から分離します。聴覚ブラの大部分を取り外して、インカスとステープを露出させます。次に、27ゲージの針の斜めの端を使用して、短い稜でインカスの後靭帯を切り取ります。

鉗子を使用してインカスを分離します。アブミ骨の近くのアブミ骨動脈を、27ゲージの針の斜めの端で切り取ります。丸い窓が下部に配置されるようにサンプルを回転させます。

次に、アブミ骨の閉鎖孔に縫い針を挿入し、アブミ骨を持ち上げます。アブサミを取り外すと、楕円形の窓の開口部がはっきりと見えるはずです。27ゲージの針を使用して、アブミ骨を縫製針から押し出します。

組織包埋を開始するには、まずハサミを使用して、ブラの前端で針状突起を切り取ります。くるぶしと背の稜は、切り取られた部分を通して見えます。ブラとカプセルをPBSの1〜2%パラホルムアルデヒドに浸します。

ブラに空気が閉じ込められている場合は、針と注射器を使用して空気を取り除きます。ブラとカプセルを摂氏4度の固定剤にチューブローテーターで一晩放置します。.翌日、PBSでブラとカプセルをすばやく洗います。

その後、すぐに摂氏4度の液体クライオ包埋化合物に浸します。クライオ包埋コンパウンドでは、中耳と外耳のレベルで気泡が形成されるのが一般的です。針で吸引することにより、中耳から気泡を取り除きます。

外耳の気泡にも同じ手法を使用します。すべての気泡を取り除いたら、取得する切片のタイプに応じて組織の向きを変えます。その後、切片化する前に組織を凍結ブロックに埋め込むことができます。

この画像は、Mの文字で示される脱灰くぶしの縦パラフィン切片のH染色とE染色、およびP14マウスの聴覚水疱とカプセルを示しています。鼓膜は文字TMで示されます。この画像は、凍結未脱灰くぶぶしの縦切片のカルシウム骨標識(文字Mで示されている)とP21マウスの聴覚水疱を示しています。カルシウムグリーンシグナルは、くるぶし、水疱、および被膜における新しい骨形成を明らかにします。

この技術を習得すると、手順が適切に行われれば、聴覚水疱とカプセルを10分で分離できます。このビデオを見た後、本文で説明されているマウスの聴覚小骨と水疱の解剖学的向きについてよく理解しているはずです。