Name: 遺伝子発現と組織学的分析のためにシングルマウス骨格筋の連続領域の凍結切片化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学ぶ連続凍結切片法によるマウス骨格筋の組織学的・分子学的解析。隣接切片から高品質RNAを抽出し、再生効果や遺伝子導入効果を相関分析できる。実験組織の有効活用とデータ統合に貢献する。

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Madison Grant、Steven Foltz、Halie Zastre、Junna Luanが技術支援を提供しました。この出版物で報告された研究は、国立衛生研究所の国立関節炎および筋骨格系および皮膚疾患研究所によって賞番号AR065077で支援されました。 内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

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</ol>

著者は、競合する金銭的利益はないと宣言しています。

余分な樹脂は、プールされた凍結切片のコレクションが遅くなりますし、RNA単離に樹脂汚染を埋め込む増加させることができるので、この方法で最良の結果を達成するために、組織の凍結保存中に筋肉の下3分の1または半分に制限された樹脂を埋め込む保ちます。また、針の均質化中細心の注意は、収量を最大化し、針を目詰まりの可能性を最小限にすることが重要です。プロトコルは、針がブロックされ、目詰まりを取り除くために高圧が必要になった場合、サンプルの損失から保護するために、ルアーロックシリンジを使用して変更することができます。 25または26ゲージ針を有する付加的な針の均質化ステップは、さらにRNAの収量を増強するために、より微細な組織懸濁液を製造するために添加することができます。クロロホルムは、BCPの代わりに用いることができるが、これは、BCPとして推奨されていないRNA 12の有機抽出の際、水相中のゲノムDNA汚染の低いレベルで毒性が低く、その結果です。増加均質化はあまり効率的であるように、30ミクロン以上のプールされた凍結切片のセクション厚さも推奨されません。 RNA収量が...

この技術の目的は、単一の小さな骨格筋ソース組織からアクセスでき、そのような組織学および遺伝子発現など異なるモダリティ、ことで、複数の実験的な分析を行うことです。顕微鏡アプリケーションを注意深く凍結保存中に氷晶アーチファクトの形成を制限するように制御されなければならないサンプルの保存方法に最も敏感です。したがって、この方法の開発は、部分的に免疫蛍光顕微鏡法および遺伝子発現の両方のための原料物質分析として-140℃の液体窒素冷却2-メチルブタン浴中で樹脂を埋め込んで被覆された凍結前脛骨（TA）筋に基づいています。 多様な技術的アプローチのために同一の原料物質を使用する必要性は、左右の筋肉が異なる条件、実験の1つずつの制御を表す筋肉内注射に基づく実験のために特に重要です。例えば、筋肉再生の研究で一μSCLEは反対側の筋肉がビヒクル注射対照1として機能する広範な組織の損傷を引き起こす毒素を注射します。同様に、筋疾患の遺伝子治療研究は、典型的には、反対側2の空ベクター、無関係ベクターまたはビヒクル対照と比較する筋肉内注射による遺伝子治療ベクターの検証で始まります。したがって、別のアプリケーションに各TA筋を供給することは不可能です。 この問題に対処するための一般的な戦略は次のとおりです。私は）ii）の追加のマウスを使用すること、またはiii）は、各アプリケーションのための筋肉の一部を遮断するために、アプリケーションごとに異なる筋肉群を使用します。しかし、筋群の間に実質的な差異は、それが困難な別個のアプリケーションからのデータを比較することを可能にする、追加の動物は費用を増加させ、他の選択肢が存在する場合、不十分正当化されます。異なるアプリケーションを調達するために解剖した後に筋肉を割ると、最良の選択肢の私ですnは多くの場合。しかし、筋肉片は、しばしば均質2-5のために液体窒素または機械的な粉砕技術の下で粉砕を使用するには小さすぎます。筋肉は、細胞外マトリックス及び収縮タンパク質を充填した高度に構造組織であるため、不十分な機械的な均質化は、その後のDNA、RNAまたはタンパク質の低い収率をもたらします。ここでの詳細な方法は、複数のアプリケーションで使用するための1つのソース筋からの組織の少量を可能にし、凍結切片と針粉砕を含めることは、より良好なRNAの収量のための機械的均質化を向上させます。

<table><tbody><tr><td>コルク</td><td>VWRサイエンティフィック</td><td>23420-708</td><td>鋭利な刃で小さな正方形にカットします。</td></tr><tr><td>プラスチック製のカバースリップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>12-547</td><td>凍結時に筋肉の向きを変えるために使用されます。</td></tr><tr><td>低温温度計</td><td>VWR科学</td><td>89370-158</td><td></td></tr><tr><td>2-メチルブタン</td><td>シグマ</td><td>M32631-4L</td><td>注意:危険な化学物質。可燃性のキャビネットに保管してください。</td></tr><tr><td>埋め込み樹脂:「cryomatrix」</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>6769006</td><td>他の埋め込み樹脂は、cryomatrixの代わりに使用できます。</td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>マイクロm HM550 使い捨てブレードキャリア付き</td><td>プロトコルには、動作するクライオスタットで十分です。</td></tr><tr><td>使い捨てクライオスタットブレード</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>3052835</td><td>使用するクライオスタットに適したブレードまたはナイフを使用してください。</td></tr><tr><td>RNase除染液:「RNase Zap」</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>分析天びん</td><td>メトラー・トレド</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>ペイントブラシ</td><td>ダラー・ローニー</td><td>214900920</td><td>クライオ切片の取り扱いに使用します。シンプルな画材を扱う店頭で見つけることができます。</td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>VWR Scientific</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>VWR Scientific</td><td>48311600</td><td></td></tr><tr><td>RNA 有機抽出試薬: TRIzol</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>15596026</td><td>注意: TRIzol は危険な化学物質です。注:骨格筋からのRNA抽出には、有機抽出試薬のみが推奨されます。</td></tr><tr><td>18ゲージニードル</td><td>VWRサイエンティフィック</td><td>BD305185</td><td></td></tr><tr><td>22ゲージニードル</td><td>VWRサイエンティフィック</td><td>BD305155</td><td></td></tr><tr><td>26ゲージニードル</td><td>VWRサイエンティフィック</td><td>BD305115</td><td>オプション。RNA抽出プロトコルにおける3回目のサンプルトリチュレーションに使用できます。</td></tr><tr><td>1mlシリンジ</td><td>VWRサイエンティフィック</td><td>BD309659</td><td>非常に価値の高いサンプルには、Luer-Lokシリンジ(例:、VWR BD309628)をお勧めします。</td></tr><tr><td>1-ブロモ-3-クロロペンタン (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 水中の 70% エタノールの場合: 200 プルーフアルコール</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>+M18027161M</td><td>200プルーフアルコール35ml + DEPC水15ml を混ぜる&nbsp;</td></tr><tr><td>DEPC水中の70%エタノールの場合:DEPC処理水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9922</td>ミックス<td>35 ml 200プルーフアルコール+ 15 mlDEPC水。</td></tr><tr><td>RNA精製キット:PureLink RNAミニキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12183018A</td><td>RNA調製の最終ステップ。</td></tr><tr><td>DNase/Rnaseフリー水&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td>DEPC処理水も使用できます。</td></tr><tr><td>分光光度計 Nanodrop 2000</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM2222</td><td>精製されたRNAを処理して、下流のアプリケーション化の前にDNA汚染を除去します。</td></tr><tr><td>疎水性ペン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>PBS 免疫蛍光プロトコル用。</td></tr><tr><td>ロバ血清</td><td>Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc</td><td>017-000-121</td><td>製造元の指示に従って正常なロバ血清ストックを再水和し、免疫蛍光のためにアリコートを5%に希釈します。&nbsp;通常のヤギの美容液も使用できます。</td></tr><tr><td>eMHC 抗体</td><td>アイオワ大学 Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>F1.652</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン VI 抗体</td><td>Fitzgerald Industries</td> <td>#70R-CR009x</td><td></td></tr><tr><td>ロバ 抗ウサギ AlexaFluor488</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG1 AlexaFluor546</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A21123</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-ジアミディノ-2-フェニルインドール)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>水性封入剤:Permafluor</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>TA-030-FM</td>退<td>色防止特性を備えた蛍光アプリケーション用に設計された封入剤のみを使用してください。</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>VWR Scientific</td><td>16004-314</td><td>免疫蛍光プロトコルの末端にスライドを取り付けるための使用</td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア: ImageProExpress</td><td>Media Cybernetics, Inc.</td><td>Image-Pro Express、またはより高度な製品</td>である<td>Freeware ImageJは、手動カウントにも機能するはずです。セグメンテーション機能を備えたより高度なソフトウェアにより、プロセスの部分的な自動化が可能になる場合があります。例:、ImageProPremier。</td></tr><tr><td>セクションの画像のマージとマッピング:Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop</td><td></td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Sigma</td><td>C9659</td><td>Sigma C9659は廃止されました。カルジオトキシンの他のオプションは、EMDミリポア#217503です。アメリカンカスタムケミカルズコーポレーション#BIO0000618;またはGeスクリプト#RP17303。しかし、これらは検証されていません。</td></tr><tr><td>逆転写キット Superscript III ファーストストランド合成システム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>18080051</td><td>バリデーション済みの高品質な逆転写試薬を使用することができます。</td></tr><tr><td>標準PCR:GoTaq Flexiポリメラーゼシステム</td><td>Promega</td><td>M8298</td><td>検証済みの高品質なTaqポリメラーゼシステムであれば、どれでも使用することができます。DNAシーケンシングをPCRの下流のアプリケーションに使用する場合は、代わりにハイフィデリティPCRシステムを使用する必要があります。</td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7585</td><td>専用の qPCR マスターミックスを使用しない場合の qPCR に使用します。SuperROX(Applied Biosystems機器用)およびGoTaq Flexiポリメラーゼおよびバッファーと併用します。</td></tr><tr><td>ROX: SuperROX, 15 mM</td><td>BioResearch Technologies, Inc. Novato CA</td><td>SR-1000-10</td><td>SuperROXはPCR反応においてより安定しているため、ROX(カルボキシ-X-ロダミン)よりもqPCRパッシブリファレンス色素としての使用に適しています。Applied Biosystemsの装置によるqPCRの場合</td></tr><tr><td>リアルタイムPCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>7900HT</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝子発現と組織学的分析のためにシングルマウス骨格筋の連続領域の凍結切片化

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

この方法では、連続した凍結切片は、単一のマウス骨格筋からの隣接領域を用いて、遺伝子発現のための組織の組織学とRNAの濃縮のための両方の顕微鏡アプリケーションを可能にするために収集されます。典型的には、それがバッファボリュームは、効率的な研削用途には低すぎるかもしれないので、まだ十分な機械的破壊することなく、小さな骨格筋サンプルの適切な均質化を達成するために挑戦され、緩衝剤の筋限界浸透の密集組織構造は、最終的に低いRNA収量を引き起こします。ここで報告されたプロトコルに従うことにより、30μmのセクションでは、収集され、バッファへの浸透のために露出表面積を増加させ、凍結切片およびその後の針均質化が筋肉を混乱させる機械的にできるようにプールしました。技術の主要な制限は、クライオスタットを必要とすることであり、それは比較的低いスループットです。しかし、高品質のRNAをプールし、Mの小さなサンプルから得られますuscle凍結切片は、多くの異なる骨格筋および他の組織のために、この方法は、アクセス可能にします。測定は直接実験的不確実性を低減し、のための小さな組織を供給するのに必要な複製の動物実験を低減するためにアプリケーション間で比較することができるように、また、この技術は、単一の骨格筋の隣接領域からの一致分析（ 例えば、組織の組織病理学および遺伝子発現）を可能にします複数のアプリケーション。

筋肉凍結切片のRNAは、品質が高く、ほとんどのアプリケーションのための十分な収量を提供します分析は、16骨格筋のRNA調製物を、8匹の対照マウスからプールした前脛骨（TA）筋の19.4〜41ミリグラムを用いて、 表1に示します。どちらの左（L）と右（R）TAの筋肉がメソッドを使用して、筋肉の損傷を引き起こすことが3日、生理食塩水または10μMのカルジオトキシンの25μlに縦筋肉内注射後に採取した筋肉で再生実験で調製したが、以前に1を報告しました 。 表1に示すように 、筋肉凍結切片のRNAのためのA260 / 280比は、典型的には、これらの代表的なサンプル中の2以上の近くにあります。 「純粋な」RNAは2.2 2.0〜A260 / 280 1.8のA260 / 280を有すると考えられているように、凍結切片のRN...

連続凍結切片を、単一のマウス骨格筋からの隣接領域を用いた遺伝子発現の測定のための組織学的応用およびRNAの濃縮を可能にするために収集されます。直接アプリケーション間で比較され、プールされた凍結切片と測定30mgの - 高品質のRNAが20から得られます。

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

この手順の全体的な目標は、単一の組織の隣接するセクションからの組織学的および分子的パラメーターの分析を可能にすることです。この方法により、骨格筋の生物学と疾患という分野における重要な疑問に答えることができます。例えば、筋肉損傷後の再生効果は何か、筋肉内注射によるウイルス遺伝子送達の影響は何か。この方法の利点は、組織学的データと分子データを単一の組織から直接相関させることができることです。これにより、より効果的なデータ解析が可能になり、実験組織の有効活用が可能になります。解剖を完了する5分前に、凍結保存浴を冷却します。組織サンプルを埋め込む準備ができたら、まず、筋肉がコルクと出会う組織の下3分の1から半分に埋め込み樹脂を塗布します。これは、下流のステップとの樹脂の干渉を減らすために、きちんと行う必要があります。次に、すぐにコルクをマイナス140°Cに冷却した2-メチルブタンバスに落とします。バッチごとに最大8つの組織調製物を含めます。お風呂で、ティッシュを30秒間かき混ぜ、ビーカーの底をこすり、ティッシュのコルクが溶液に凍結するのを防ぎます。30秒後、金属製の工具を使用して、2-メチルブタンからティッシュコルクを引き出します。次に、支持カバースリップをすばやく取り外します。余分な2-メチルブタンを浴に軽くたたいて戻し、次に組織のコルクを外側の窒素浴に落とします。すべての組織が液体窒素に移された後、それらを容器に移し、摂氏マイナス80度で保存します。クライオスタットを調製し、組織サンプルをマウントした後、粗いコントロールと細かいコントロールを使用して、試料をブレードまで進め、ブレードに触れるようにします。この時点で、断面の厚さの合計を 0 にリセットします。次に、クライオスタットをトリム機能に設定し、セクションの厚さを30ミクロンにします。そして、目的の組織の深さまで切片を切断して廃棄します。RNA抽出用のクライオ切片を効率的に収集するには、まず収集チューブを開き、ブレードキャリアの近くに配置します。そこで、予冷した清潔なブラシを使用して各セクションをピックアップし、チューブに移します。プールされた30ミクロンのマウス脛骨筋の前部セクションは、400から4、000ミクロンの組織の深さから採取され、通常、25〜50ミリグラムの筋肉をもたらします。クライオ切片の周囲に樹脂が埋め込まれている場合は、ハンドブレーキをロックし、カミソリの刃を使用して、筋肉の上部に薄い層ができるまで樹脂の小片を削り取ります。常にブレードが筋肉から離れるようにして樹脂をカットしてください。包埋樹脂の薄層は、下流のRNA抽出を実質的に損なうことはありません。より厚い埋め込み樹脂が存在する場合は、凍結切片を採取チューブに移動する前に、ブラシを使用して筋肉からからかい取ります。切片作成プロセス中に組織学的切片が必要な場合は、クライオスタットコントロールを使用してスライスの厚さを7ミクロンにリセットします。次に、4〜7つの切片を切断して廃棄し、一貫性のある均一な組織表面を取得し、この組織の深さをメモします。次に、適切なセクションを切り取り、ブレードキャリアの表面に向けます。室温の顕微鏡スライドを使用して、切片をピックアップし、スライドを室温に戻します。必要な切片をすべて収集し、最終的な組織の深さをメモします。切片作成が完了したら、RNA単離のためにプールされた凍結切片の重量を迅速に記録します。すぐにチューブをクライオスタットチャンバーに戻し、切片の温度をマイナス20°C付近に維持します。まず、プールしたクライオ切片を氷に素早く移し、クライオ切片50ミリグラムあたり約1ミリリットルの有機RNA抽出試薬を添加します。試薬の適用が早ければ早いほど、RNAの分解は少なくなります。次に、18ゲージの針が付いた1ミリリットルの注射器を使用して、溶液を繰り返し引き上げてチューブ壁に噴出することにより、気泡をあまり作らないように凍結切片を均質化します。針先を使用して、固まった破片を分散させます。5回のストロークごとに、サンプルを氷に短時間戻して冷やします。均質化したら、22ゲージの針を使用して、さらに5回のストロークでサンプルを慎重に三分化します。次に、サンプルを氷に戻します。このプロセスを3〜4回繰り返して、非常に微細に分散した組織の均質性を実現します。最終的なホモジネートが作られたら、室温で5分間インキュベートして分子複合体を破壊します。次に、ドラフトに、RNA単離試薬1ミリリットルあたり0.1ミリリットルのBCPを添加します。その後、チューブを15秒間激しく振ってください。ボルテックスは使用しないでください。その後、サンプルを室温で2〜3分間インキュベートします。短時間のインキュベーション後、サンプルを12, 000g、摂氏4度で15分間遠心分離します。次に、RNAを含む透明な上層部を慎重に収集します。それをきれいなチューブに移し、海洋深層水で作った70%エタノールを等量加えます。チューブを短時間ボルテックスした後、室温で10分間インキュベートし、テキストプロトコールに従って進めます。骨格筋RNA調製物は、マウスの前方脛骨から調製した。3日前に、一部の筋肉には10マイクロモルのカルジオトキシンを注射し、他の筋肉には生理食塩水を注射しました。これらのサンプルからのRNAの純度と収量は優れていました。毒素損傷後の脛骨筋では、RNA収量が大幅に高かった。組織の完全性とRNA産生は、この観察に考慮される可能性があります。調製したRNA品質の持続性は、マイナス20°Cで18ヶ月間保存した1マイクロリットルのRNAを用いて評価した。顕著な18Sおよび28SリボソームRNAバンドは、高いRNA品質を示すサンプルで依然として明らかです。7ミクロンの切片を染色し、胚性ミオシン重鎖の発現を赤く示しました。再生繊維を検出するために、コラーゲン6を染色し、緑色で見られる、筋線維の輪郭を描く緑色、青色で染色し、核を観察する。毒素注射が不十分な場合、怪我は最小限に抑えられているように見えます。毒素注射が成功すると、標的となる筋肉コンパートメントのはるかに広い領域が影響を受けます。損傷の程度は、RNA分析の選択基準として使用できます。一度習得すれば、RNA抽出と組織学的スライドのための切片の切断は、単一の組織に対して30分以内に完了することができます。この手順に続いて、免疫蛍光染色の他の組織学的染色を追跡して、さまざまな質問に答えることができます。プールされた凍結切片は、DNAまたはタンパク質の収集にも使用できます。

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生物学

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