遺伝子発現と組織学的分析のためにシングルマウス骨格筋の連続領域の凍結切片化

この手順の全体的な目標は、単一の組織の隣接するセクションからの組織学的および分子的パラメーターの分析を可能にすることです。この方法により、骨格筋の生物学と疾患という分野における重要な疑問に答えることができます。例えば、筋肉損傷後の再生効果は何か、筋肉内注射によるウイルス遺伝子送達の影響は何か。

この方法の利点は、組織学的データと分子データを単一の組織から直接相関させることができることです。これにより、より効果的なデータ解析が可能になり、実験組織の有効活用が可能になります。解剖を完了する5分前に、凍結保存浴を冷却します。

組織サンプルを埋め込む準備ができたら、まず、筋肉がコルクと出会う組織の下3分の1から半分に埋め込み樹脂を塗布します。これは、下流のステップとの樹脂の干渉を減らすために、きちんと行う必要があります。次に、すぐにコルクをマイナス140°Cに冷却した2-メチルブタンバスに落とします。

バッチごとに最大8つの組織調製物を含めます。お風呂で、ティッシュを30秒間かき混ぜ、ビーカーの底をこすり、ティッシュのコルクが溶液に凍結するのを防ぎます。30秒後、金属製の工具を使用して、2-メチルブタンからティッシュコルクを引き出します。

次に、支持カバースリップをすばやく取り外します。余分な2-メチルブタンを浴に軽くたたいて戻し、次に組織のコルクを外側の窒素浴に落とします。すべての組織が液体窒素に移された後、それらを容器に移し、摂氏マイナス80度で保存します。

クライオスタットを調製し、組織サンプルをマウントした後、粗いコントロールと細かいコントロールを使用して、試料をブレードまで進め、ブレードに触れるようにします。この時点で、断面の厚さの合計を 0 にリセットします。次に、クライオスタットをトリム機能に設定し、セクションの厚さを30ミクロンにします。

そして、目的の組織の深さまで切片を切断して廃棄します。RNA抽出用のクライオ切片を効率的に収集するには、まず収集チューブを開き、ブレードキャリアの近くに配置します。そこで、予冷した清潔なブラシを使用して各セクションをピックアップし、チューブに移します。

プールされた30ミクロンのマウス脛骨筋の前部セクションは、400から4、000ミクロンの組織の深さから採取され、通常、25〜50ミリグラムの筋肉をもたらします。クライオ切片の周囲に樹脂が埋め込まれている場合は、ハンドブレーキをロックし、カミソリの刃を使用して、筋肉の上部に薄い層ができるまで樹脂の小片を削り取ります。常にブレードが筋肉から離れるようにして樹脂をカットしてください。

包埋樹脂の薄層は、下流のRNA抽出を実質的に損なうことはありません。より厚い埋め込み樹脂が存在する場合は、凍結切片を採取チューブに移動する前に、ブラシを使用して筋肉からからかい取ります。切片作成プロセス中に組織学的切片が必要な場合は、クライオスタットコントロールを使用してスライスの厚さを7ミクロンにリセットします。

次に、4〜7つの切片を切断して廃棄し、一貫性のある均一な組織表面を取得し、この組織の深さをメモします。次に、適切なセクションを切り取り、ブレードキャリアの表面に向けます。室温の顕微鏡スライドを使用して、切片をピックアップし、スライドを室温に戻します。

必要な切片をすべて収集し、最終的な組織の深さをメモします。切片作成が完了したら、RNA単離のためにプールされた凍結切片の重量を迅速に記録します。すぐにチューブをクライオスタットチャンバーに戻し、切片の温度をマイナス20°C付近に維持します。

まず、プールしたクライオ切片を氷に素早く移し、クライオ切片50ミリグラムあたり約1ミリリットルの有機RNA抽出試薬を添加します。試薬の適用が早ければ早いほど、RNAの分解は少なくなります。次に、18ゲージの針が付いた1ミリリットルの注射器を使用して、溶液を繰り返し引き上げてチューブ壁に噴出することにより、気泡をあまり作らないように凍結切片を均質化します。

針先を使用して、固まった破片を分散させます。5回のストロークごとに、サンプルを氷に短時間戻して冷やします。均質化したら、22ゲージの針を使用して、さらに5回のストロークでサンプルを慎重に三分化します。

次に、サンプルを氷に戻します。このプロセスを3〜4回繰り返して、非常に微細に分散した組織の均質性を実現します。最終的なホモジネートが作られたら、室温で5分間インキュベートして分子複合体を破壊します。

次に、ドラフトに、RNA単離試薬1ミリリットルあたり0.1ミリリットルのBCPを添加します。その後、チューブを15秒間激しく振ってください。ボルテックスは使用しないでください。

その後、サンプルを室温で2〜3分間インキュベートします。短時間のインキュベーション後、サンプルを12, 000g、摂氏4度で15分間遠心分離します。次に、RNAを含む透明な上層部を慎重に収集します。

それをきれいなチューブに移し、海洋深層水で作った70%エタノールを等量加えます。チューブを短時間ボルテックスした後、室温で10分間インキュベートし、テキストプロトコールに従って進めます。骨格筋RNA調製物は、マウスの前方脛骨から調製した。

3日前に、一部の筋肉には10マイクロモルのカルジオトキシンを注射し、他の筋肉には生理食塩水を注射しました。これらのサンプルからのRNAの純度と収量は優れていました。毒素損傷後の脛骨筋では、RNA収量が大幅に高かった。

組織の完全性とRNA産生は、この観察に考慮される可能性があります。調製したRNA品質の持続性は、マイナス20°Cで18ヶ月間保存した1マイクロリットルのRNAを用いて評価した。顕著な18Sおよび28SリボソームRNAバンドは、高いRNA品質を示すサンプルで依然として明らかです。

7ミクロンの切片を染色し、胚性ミオシン重鎖の発現を赤く示しました。再生繊維を検出するために、コラーゲン6を染色し、緑色で見られる、筋線維の輪郭を描く緑色、青色で染色し、核を観察する。毒素注射が不十分な場合、怪我は最小限に抑えられているように見えます。

毒素注射が成功すると、標的となる筋肉コンパートメントのはるかに広い領域が影響を受けます。損傷の程度は、RNA分析の選択基準として使用できます。一度習得すれば、RNA抽出と組織学的スライドのための切片の切断は、単一の組織に対して30分以内に完了することができます。

この手順に続いて、免疫蛍光染色の他の組織学的染色を追跡して、さまざまな質問に答えることができます。プールされた凍結切片は、DNAまたはタンパク質の収集にも使用できます。