ソフト寒天オーバーレイ技術の使用は、細菌産生阻害する化合物をスクリーニングするために

この手順の全体的な目標は、1 つの細菌株によって産生され、2 番目の細菌株に対して阻害する薬剤をスクリーニングすることです。この方法は、多くの微生物学的分野の質問に答えるのに役立ちますが、微生物生態学において、拮抗的な細菌の相互作用を理解するのに特に役立ちます。この手法の主な利点は、安価で実行と解釈が簡単なことです。

手順を実演するのは、研究室の学生であるアレサです。実験を開始するには、Pシリンガの1つのコロニーを3ミリリットルのKing's Medium Bブロス(KB)に接種します。培養物を一晩でインキュベートします。翌朝、培養液を1〜100で3ミリリットルの新鮮なKBブロスに希釈します。

室温で振とうしながら3〜4時間培養物をインキュベートします。培養物の濁度が著しく増加していることを確認してから、マイトマイシンC.次に、室温で振とうしながら培養物を一晩インキュベートします。翌日、ベンチトップマイクロ遠心分離機で1〜2ミリリットルのマイトマイシンC誘導培養物をペレット

培養上清を0.22μmの細孔径フィルターに通して、培養上清を除去し、滅菌します。塩化ナトリウムを添加して1モル濃度にし、ポリエチレングリコール(PEG 8000)を10%の最終濃度まで滅菌上清に加えます。塩化ナトリウムとPEGの両方が完全に溶解するまで、サンプルを繰り返し反転させます。

サンプルを氷浴で1時間インキュベートします。次に、サンプルを遠心分離します。遠心後、上清をデカントし、ピペッティングを繰り返してペレットをバッファーに再懸濁します。

同量のクロロホルムで2回連続抽出することにより、残留PEGを除去します。再懸濁したペレットとクロロホルムを混合し、混合物を15秒間ボルテックスします。次に、混合物をGの20, 000倍で5分間遠心分離します。

上部水相を新しいマイクロフュージチューブに移します。この抽出を2回繰り返して、水相と有機相の間の白い界面が見えなくなるまで繰り返します。ヒュームフード内で抽出された上清から残留クロロホルムを蒸発させます。

P syringae株の単一コロニーを3ミリリットルのKBに接種し、室温で振とうしながら培養物を一晩インキュベートします。翌朝、培養物を1〜100に希釈して新しいKBにします。室温で振とうしながら3〜4時間培養物をインキュベートします。次に、超純水で寒天懸濁液をオートクレーブすることにより、滅菌水寒天を調製します。

溶融した柔らかい寒天を摂氏60度の水浴で保存してから使用してください。滅菌血清学的ピペットを使用して、3ミリリットルの軟質寒天を滅菌培養チューブに移します。培養チューブをウォーターバスに戻して、溶融状態に維持します。

オーバーレイを注ぐ前に、溶けた寒天を冷ましますが、固まらないようにしてください。接種前に寒天を高温で完全に溶融した状態に維持することが重要です。そうでない場合、オーバーレイは粒子の粗い外観になり、解釈が難しくなります。

滅菌フードで、テスター菌株の培養物100マイクロリットルを柔らかい寒天と渦に接種して混合します。手で培養物を10〜15秒間回転させてから、寒天プレートの底に注ぎます。プレートを全方向に傾けて、柔らかい寒天が底の寒天を均等に覆うようにします。

プレートを覆い、固まるまで20〜30分待ちます。固化しながらプレートを乱さないように注意してください。固まったら、2〜5マイクロリットルの上清をオーバーレイにスポットします。

プレートを室温で一晩インキュベートします。翌朝、結果を観察して記録します。この方法を用いて、Pシリンガエの2つの菌株が異なるバクテリオシンによって阻害されます。

A株は高分子量バクテリオシンタイロシンに感受性がありますが、代替の低分子量バクテリオシンには感受性がありません。逆に、B株はタイロシンには感受性がありませんが、低分子量のバクテリオシンには感受性があります。タイロシンはPEG沈殿後に効率的に回収されますが、低分子量のバクテリオシンは回収されません。

バクテリオファージ媒介性殺傷は、希釈シリーズを比較することにより、他の非複製性抗菌薬と区別されます。バクテリオファージを介したクリアリングの場合、上清の希釈は個々のプラークまたはクリアリングゾーンに溶解しましたが、バクテリオシンを介したクリアリングはそのようなプラークに分解されませんでした。.この手順は、阻害薬を同定するための初期スクリーニングとして使用でき、下流の遺伝子操作と組み合わせて、この活性の原因を特定または確認することができます。