マイクロスケールの熱泳動を使用してATPのアプタマーの結合部位のマッピング

この実験の全体的な目標は、マイクロスケールの熱泳動を使用して、結合部位のマッピングを含むDNAアプタマーの低分子相互作用を特徴づけることです。この方法は、分子相互作用の基本的な結合パラメータに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、相互作用パートナーのサイズに依存しないため、アプタマーと低分子との間の困難な相互作用の品質管理データを取得できることです。

この手法は、アプタマーの低分子相互作用に関する洞察を得ることができますが、薬物標的相互作用や抗原/抗体相互作用など、他の分子相互作用にも適用できます。手順を開始するには、蒸留水でCy5標識DNA DH25.42アプタマーの100マイクロモルストック溶液を準備します。次に、アプタマーストック溶液を結合バッファーで200ナノモルに希釈します。

アプタマー作業溶液を摂氏90度で2分間インキュベートします。氷の上で溶液を室温まで冷却します。次に、低結合性の200マイクロリットル微量遠心チューブを標識してセットし、試験するリガンドの16ステップの段階希釈を行います。

リガンドと結合緩衝液の10ミリモルストック溶液を20マイクロリットルでピペットでチューブ1に。10マイクロリットルの結合バッファーをチューブ2〜16にピペットで取り付けます。次に、10マイクロリットルのリガンドストックをチューブ1からチューブ2に移し、ピペットとよく混合します。

希釈した混合物の10マイクロリットルをチューブ3に移し、よく混合します。この方法で段階希釈を継続し、必要に応じてバッファー希釈効果を補正し、終了したらチューブ16から余分な10マイクロリットルを廃棄する。各希釈液に10マイクロリットルのアプタマー作業溶液を加え、ピペットとよく混合します。

サンプルを室温で5分間インキュベートします。次に、各混合物をきれいな標準キャピラリーに引き込み、両端のキャピラリーにのみ触れるようにします。キャピラリーをトレイホルダーに濃度の降順で配置します。

MSTデバイスを起動し、機器制御ソフトウェアを開きます。手動温度制御を有効にし、機器の温度を摂氏25度に設定します。装置が正しい温度になったら、キャピラリートレイを挿入します。

Cy5ラベル付きアプタマーのLEDチャネルを赤に設定します。LEDの電力を500ユニットの蛍光信号になるように設定します。次に、キャピラリースキャンを実行してキャピラリーの位置を取得し、サンプルの品質を確認します。

得られたピークがU字型または平坦な場合は、固着の影響を最小限に抑えるために、コード化されたキャピラリーに新しいサンプルを調製します。MST装置ソフトウェアで、最初のキャピラリーのリガンド濃度と希釈タイプを入力します。クリック&ドラッグして、残りのキャピラリーの濃度と希釈液を記入します。

最終ミックス中のアプタマーの濃度を入力します。実験方法が蛍光を5秒間検出するように設定されていることを確認し、MSTを30秒間記録し、レーザーをオフにしてから5秒間蛍光を記録します。レーザー出力を20%に設定し、ファイルパスを設定し、実験ファイルを保存します。

次に、MST測定を開始します。この方法で少なくとも 3 つの測定値を取得します。データ解析を開始するには、MST解析ソフトウェアを開き、実験ファイルをロードします。

解析タイプとして [MST] を選択します。分析ソフトウェアを使用すると、すべての測定値が同じ毛細血管のセットであったテクニカルリピートを比較できます。異なる毛細血管のセットからの生物学的リピートも分析に追加できます。

最初の測定値の下にある情報ボタンをクリックします。MST トレースに、凝集または降水の影響を示すバンプまたはスパイクがないか調べます。次に、キャピラリースキャンとキャピラリー形状のオーバーレイを検査し、固着または吸収効果を示す平坦なピークまたはU字型のピークがないか確認します。

MSTでは凝集体と吸収効果を迅速に検出できるため、この分析法では、技術セットアップを迅速かつ迅速に最適化して、最適なデータ品質を確保できます。キャピラリースキャンと初期蛍光におけるリガンド依存性の蛍光消光または増強効果を確認します。時間の経過に伴う蛍光変化を検査して、光の漂白または写真の強調の兆候がないか調べます。

データ品質を確認したら、用量反応モードに切り替えます。T ジャンプ MST 評価ストラテジでエキスパート解析設定を選択します。次に、曲線フィッティングの丘陵モデルを選択して、バインディングパラメータを自動的に計算します。

[結果の比較] メニューで、正規化の種類を選択します。正規化されたデータをスプレッドシートまたは PDF ファイルとしてエクスポートします。この手順では、MSTを使用して、一本鎖DNAアプタマーと選択した低分子リガンドとの結合相互作用を調査しました。

MST曲線をヒル方程式に適合させ、半値最大有効濃度値を決定しました。ATPを用いたアプタマーの5つの独立した生物学的反復測定では、ATPアプタマー相互作用は6〜13単位の負の結合振幅を示し、平均EC50値は約52.3マイクロモルでした。各リガンドのデータを結合分子の割合に正規化し、比較しました。

ATPと比較したADP、AMP、およびSAMのEC50値は、リン酸基の数がアプタマー結合挙動にせいぜいわずかな影響を与えることを示唆しています。ロボC2ヒドロキサール基の除去も、アプタマー結合親和性にわずかな影響しか示さなかった。アプタマーは、ペア基がない場合、またはペア基がグアニンに変更された場合、結合しませんでした。

アプタマーはアデニンのみに結合し、さらにアデニン基がアプタマーの主要な結合部位であることを示しました。この手法を習得すると、適切に実行すれば、基本的なバインディングパラメータに関する重要な情報を数分から数時間で提供できます。