ニュートラルキャピラリーを使用したモノクローナル抗体アイソフォームのキャピラリー電気泳動分離

今日、キャピラリー細胞電気泳動法は、モノクローナル抗体などのバイオ分子分析において、最も分解能が高く感度の良い手法の一つとなっています。しかし、この手法を正常に実施できるかどうかは、サンプルおよびシステムの調製における重要なステップにおける分析者の知識とスキルにかかっています。本チュートリアルでは、分析を成功させるための方法について、溶液およびサンプルの調製、キャピラリー電気泳動システムの準備、装置のメソッド設定、ならびにデータの判定と処理に関する詳細な解説を目的としています。

全体として、このプロトコルは分析化学研究室の準備に従事するスタッフのスキル開発および向上に利用できます。100 mLで最終濃度0.05%となる量のHPMCを量り取ります。HPMCは基本的な弾性ポリマーであるため、最初のステップとして、粉末をガラスビーカーに注ぎ、80 mLの水をゆっくりと加えて粉末を分散させます。

次に、濡らしトレイを水ですすいで粉末の痕跡を取り除きます。通常通りに残りの試薬を加え、溶液を撹拌します。50% 酢酸を用いて pH 値を 4.8 に調整します。

その後、溶液を5分間静置して安定させます。次いで、必要に応じてpHを調整します。最後に、水を加えて全量を100 millilitersにします。

調製したBG溶液を中性膜でろ過し、ガラス瓶に注ぎます。最後に、ガラス瓶に適切にラベルを貼り、冷蔵保存します。サンプルを調製するための最初のステップとして、1.5 milliliterチューブに162 microlitersのトレースバッファー溶液を加えます。

次に、あらかじめ調製した濃度 10 mg/mL のMAPサンプルを 18 µL 加えます。3番目のステップとして、あらかじめ調製した 1% ヒスタミン溶液を 20 µL 加え、最終サンプル容量を 200 µL にします。次のステップで、サンプルを 5 秒間調製します。

5秒間遠心分離します。サンプルの全量を吸引します。気泡の混入を防ぐため、マイクロバイアルの上方に向かって分注します。

最後に、バイアルにキャップをし、冷蔵保存します。電源スイッチを押してCE装置の電源を切ります。そして、フロントドアを開けます。

インターフェースブロックの下に新しい移動用ワイプを敷きます。洗浄ボトルを用いて、インターフェースブロック経由で電極を水で洗浄してください。水が穴から滴り落ちるようにし、インターフェースブロックを十分に乾燥させます。

ワイプを使用して、電極上の余剰な水を慎重に拭き取ります。この操作中に電極に触れないよう注意してください。サンプル保持システムからワイプを取り除きます。

新しい水で湿らせた非脱落性のワイプで、サンプルプレートの表面およびバッファープレートの表面を清掃します。バッファープレートを上にスライドさせ、サンプル保持システムを上に持ち上げ、ワイプを使用してその表面を清掃します。

バッファー用トレイを元の位置に戻します。その後、インターフェースブロックを徹底的に洗浄してください。クランプバーおよびUVランプハウジングも洗浄します。

最後に、使用前に必ずシステムの動作を確認してください。洗浄ボトルを用いて、開口レバーを水ですすぎます。その後、新しい低発塵ワイパーで表面を十分に清浄し、ほこりや蓄積した塩分を除去してください。

最後に、設置前に必ず動作確認を行ってください。水で湿らせたマイクロファイバークロスで光ファイバーケーブルの両端を清掃し、両端の間のライトポッドを確認します。パッケージから新しいニュートラルキャピラリーを取り出します。

キャピラリーの保護チューブの端をワークベンチに持ってきます。プラスチックチューブをほどいてまっすぐにし、キャピラリーをチューブから慎重に引き出します。以下の測定マークを付けた紙をワークベンチに貼り付けます。

以下のように、キャピラリーのウィンドウをセンチメートル測定目盛りのゼロ点に合わせてください。その後、キャピラリーの両端をテープでワークベンチに固定します。測定目盛りの外側2mmの箇所に、キャピラリー端の印を付けます。ウィンドウから最も遠い方のキャピラリー端にある保護キャップを切断してください。

キャピラリーの内部コーティングへの恒久的な損傷を防ぐため、キャピラリー端を水で満たしたCEバイアルに浸します。キャピラリーをバイアルから取り出し、この端をカートリッジの出口側に慎重に挿入します。キャピラリーが反対側に現れたら、次のようにキャピラリーウィンドウがカートリッジウィンドウの中央に位置するまで、必要分だけ引き出します。

その後、カートリッジを裏返し、アパーチャプラグをカートリッジウィンドウに挿入し、カチッと音がするまで押し込みます。この手順の間、キャピラリーウィンドウを破損させないよう注意してください。広範囲の光源にさらした際、ウィンドウを光が透過することを確認してください。

あらかじめナットとOリングが装着された冷却水チューブにキャピラリーを挿入します。キャピラリーが反対側に現れるまで、チューブの中を押し込んでください。次に、チューブの端をカートリッジの出口側に挿入し、チューブナットを締め付けます。

キャピラリーの入口端をカートリッジの入口側に挿入します。キャピラリーが反対側に現れたら、必要に応じて引き出します。続いて、チューブの端をカートリッジの入口側に挿入し、チューブナットを締めます。

ウィンドウに最も近い方のキャピラリー端にある保護キャップを切断します。次に、キャピラリー端にセル保持クリップを装着し、次のように押し込んで固定します。キャピラリー延長プレート上の基準線よりも下の位置でキャピラリー端を切断してください。

必ず拡大鏡でキャピラリーの末端を確認してください。キャピラリーの末端が滑らかでない場合は、クレビンストーンを用いて研磨してください。アパーチャー用Oリングをアパーチャーの青い穴に挿入します。

そして、Oリング挿入ツールを使用して慎重に挿入します。最後に、水で満たしたCEバイアルをカートリッジケースに取り付け、キャピラリー端をバイアルに挿入した状態で直ちにカートリッジをケースに入れ、冷蔵保存します。ピペットの容量を調整します。

トレイ座標A1、B1、およびF6のバッファー入口に、規定量の水を加えます。また、バッファー出口のトレイ座標A1、B1、C1、E6、およびF6にも同様に加えます。バッファー入口のトレイ座標C1およびE6に、0.1 N HClを加えます。次に、バッファー入口のトレイ座標D1およびE6、ならびにバッファー出口のトレイ座標D1にBGEを加えます。最後に、バッファー入口および出口トレイにあるすべてのCEバイアルにキャップをします。この際、カーボン漏れを防ぐため、バイアルキャップを濡らさないように注意してください。CE装置のフロントドアを開けます。

まず、UV検出器を設置し、ネジを時計回りに回して固定します。インナードアを上げ、インターフェースブロックにオープニングレバーを押し込んで取り付けます。光ファイバーケーブルをクランパーに挿入し、時計回りに回します。

そして、もう一方の端を検出器に接続します。光ファイバーケーブルを曲げると断線の原因となるため、慎重に取り扱ってください。サンプル（試料）トレイをサンプル保持システムにセットし、カチッと音がするまで固定します。

同様の手順に従い、バッファー用トレイをサンプル保持システムに設置します。クランプバーを上げ、キャピラリーカートリッジをインターフェースブロックに挿入します。クランプバーの両端を押し下げ、ノブを時計回りに回して締め付けます。

インナードアを閉め、フロントドアを閉じます。最後に、電源スイッチを押してCE装置を起動します。装置のコンディショニングメソッドを作成します。

電圧、カートリッジ、サンプル保存温度、およびトリガー設定を含む初期条件スタッフのパラメータを構成します。取得波長として2014を選択します。タイムプログラムセルにパラメータを構成して、装置が実行する動作を宣言します。

各洗浄、注入、および分離ステップの具体的な設定を含めてください。この手順に従って、コンディショニング、ランニング、および装置シャットダウン用のメソッドを作成します。次のステップは、新しいシーケンスを作成することです。

コンディショニング法を用いて、キャピラリーのコンディショニングをプログラムします。キャピラリーを初めて使用する場合は、4回の繰り返しをプログラムしてください。それ以外の場合は、2回の繰り返しをプログラムします。

次に、ランニングメソッドを用いて分析するサンプルを設定します。最後に、シャットダウンメソッドを用いてキャピラリーを保存状態に設定します。キャピラリーセル電気泳動分析は30分以内に完了します。

最初のピークは、システムの適切な性能を測定するためのヒスタミン内部標準に対応しています。それに続いて、評価したモノクローナル抗体の塩基性、主成分、および酸性の各アイソフォームが検出されます。分離はすべて、約30 µAの一定電流下で実施されます。

実験終了後、grabソフトウェアから生データをエクスポートし、解析のためにempowerソフトウェアでインポートします。エレクトロフェログラムプロファイルの垂直ドロップライン積分を行うことで、各アイスフォームの含有率が得られます。ここでは、キャピラリー細胞電気泳動によって生成されたモノクローナルの活性を解析するための詳細なステップバイステップガイドを示します。

潜在的な問題を軽減するためのいくつかの推奨事項に加え、本プロトコルは、導電率およびpHパラメータをわずかに修正することで、他のタンパク質の分析に合わせて容易にカスタマイズできるという利点があります。