Name: ニュートラルキャピラリーを使用したモノクローナル抗体アイソフォームのキャピラリー電気泳動分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 学ぶモノクローナル抗体アイソフォームのキャピラリー電気泳動分離法。HPMC溶液調製、サンプル前処理、装置セットアップ、データ解析の詳細プロトコルを習得し、分析化学ラボの技術向上に活用できます。

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著者は、このチュートリアルのために以下の出版物の概念を使用する許可を与えてくださったWileyに感謝します。Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: キャピラリーゾーン電気泳動による組換えモノクローナル抗体の分析.電気泳動。2013. 34.1133-1140. 著作権 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.この研究は、CONACyT(メキシコ)の助成金230551の支援を受けました。

ソリューションの調製<ol><li> BGE溶液を調製します。 <ol><li> 0.05％からなる溶液100mlを調製（M / V）のヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、200mMのεアミノ、N-アミノカプロン酸（EACA）および30ミリモルの酢酸リチウム。 注：HPMCは、粘弾性ポリマーであるため、ガラスビーカーに粉末を注ぎ、水80 mLを加え、最後に攪拌棒を加えます。通常のように残りの試薬の追加を続けます。それは、目に刺激を与える可能性として酢酸リチウムを取り扱うときは、保護眼鏡を着用してください。 </li><li> 50％（v / v）の酢酸でpHを4.8±0.1に調整します。溶液を5分間安定化し、必要に応じて調整することができます。 </li><li>メスフラスコで最終容量100mlまで作るために水を追加します。 </li><li> 0.2μmの孔サイズを有する親水性膜で濾過します。 </li><li> 7日間まで2〜8℃で保存します。 </li></ol></li><li> 内部標準を準備します。 <ol><li> 1ミリリットルを準備1％（M / V）ヒスタミン成る溶液。 </li><li> 0.2μmの孔サイズを有する親水性膜で濾過します。 </li><li>最大で1日2〜8℃で保存します。 </li></ol></li></ol> 2.試料の調製<ol><li> 1mg / mlの最終濃度にTris緩衝液（50mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、pH8.0）で希釈したmAb試料180μLを準備します。 </li><li> 1％（メートル/ v）のヒスタミンの20μLを加えます。 </li><li>混合し、5秒間千×gで遠心します。 </li><li>ユニバーサルバイアル内部のマイクロバイアルを置きます。 </li><li>マイクロバイアルに試料を移し、ユニバーサルバイアルをキャップ。任意の気泡を導入しないようにするために上向きにサンプルを分注します。 </li><li>最大で1日2〜8℃で保存します。 </li><li>サンプル入口トレイに（試料溶液を含むマイクロバイアルで）ユニバーサルバイアルを置きます。 </li></ol> CEシステムの調製。 <ol><li> CEシステムクリーニング。 注：行動番目ほこりやごみの蓄積から派生した電流リークを避けるために少なくとも週に一度の手順です。しかし、アプリケーションに応じて（ 例えば 、増加した粘度を持つまたは高塩濃度、粘度が増加した試料でBGEの使用）電極と開放レバーが交差汚染やサンプルのキャリーオーバーを防止するために、より頻繁に清掃する必要があります。 <ol><li> CE機器の電源スイッチをオフにし、フロントドアを開きます。 </li><li>水で湿らせた不織布で拭いて、試料保持システム（サンプルとバッファートレイ）、カートリッジカバー、クランプバー、インターフェースブロックおよび電極をサンプルカバーの表面を清掃してください。使用前にエタノールで湿らせたワイプとドライを使用して手順を繰り返します。 </li><li>水で十分に開くレバーをすすぎます。ワイプ不織布とその表面を清掃してください。インストールの前にエタノールで湿らせたワイプとドライを使用して手順を繰り返します。 </li><li>光ファイバケーブルの両端には注意清掃します水で湿らせマイクロファイバーの布でLY。エタノールで湿らせた布で手順を繰り返します。 </li></ol></li><li> カートリッジアセンブリ。 <ol><li>そのパッケージから新しいニュートラルキャピラリー（50μmの内径）を削除します。 </li><li>ワークベンチへの毛細血管の保護チューブの一端ダウンテープ。 、解かまっすぐとチューブ外キャピラリを引き出します。 </li><li>作業台にテープまたは一枚の紙を貼ると、次のように測定マークを追加します。長さを検出器（30センチメートル）、出口端に毛細管ウィンドウ（0.3センチ）、長さ（10センチメートル）（ すなわち 、40.2センチメートル全長に、 30.0センチメートル有効長）。 </li><li>参考論文に0.2cmの測定マークに毛細管ウィンドウを合わせます。テープで毛細血管を修正し、毛細血管が計測マーク外2ミリメートルを終了マーク。 </li><li>切断石のフラッシュエッジを使用して、単一の直線運動にキャピラリー入口端部（窓からの終了最も遠い）で保護キャップをカットします。<ol><li>キャピラリー内側のコーティングに恒久的な損傷を避けるために、水で満たされたキャップされたユニバーサルバイアル中に毛細管の端を浸し。この手順を、キャピラリー末端以上1分周囲に露出されるたびに繰り返します。 </li></ol></li><li>カートリッジの出口側にキャピラリー入口端部を挿入します。 </li><li>キャピラリーウィンドウがカートリッジウィンドウにセンタリングされるまで、必要に応じてカートリッジを通して毛細血管を押して引きます。 </li><li>カートリッジウィンドウに絞りプラグ（100ミクロン×200μm）を挿入します。 注：光の白色光源にさらされたときに、白色光が窓を通過することを確認してください。通過した光は、茶色がかった外観を持っている場合は、必要に応じて調整します。 </li><li> （そのために、両端にプリインストールされたチューブナット、フェルールとOリング付き）40.2センチメートルの総キャピラリー長のために予め形成された冷却水チューブ内に毛細管を挿入します。 </li><li> coolanを通して毛細血管を押してくださいキャピラリーチューブのもう一方の側に表示されるまで、必要に応じトンチューブ。 </li><li>カートリッジの出口側に冷却水チューブの先端を挿入し、チューブナットを締めます。 </li><li>カートリッジの入口側にキャピラリー入口端部を挿入します。 </li><li>キャピラリーカートリッジの入口側に表示されるまで、必要に応じてカートリッジを通して毛細血管を押して引きます。 </li><li>カートリッジの入口側に冷却水チューブの先端を挿入し、チューブナットを締めます。 </li><li>切断石のフラッシュエッジを使用して、単一の直線運動のキャピラリー出口端部（窓から最も近い端部）に保護キャップをカットします。 </li><li>キャピラリー端にあるシールリテーナクリップを挿入し、所定の位置にスナップするキーを押します。視覚的に毛細管の端部を点検します。彼らもない場合は、手順を繰り返します。 </li><li>ワークベンチの端にキャピラリーの長さのテンプレートを配置します。 </li><li> AGを下向きにカートリッジを置きますキャピラリーの長さのテンプレートをainstとキャピラリは、テンプレート上の基準線で終わる揃えます。毛細管計測マークは、（3.2.4を参照）の基準線と整列していない場合は、必要に応じて調整します。 </li><li>キャピラリー長のテンプレートに対する毛細血管を持ち、テンプレート上の基準線下の切断石2ミリメートルのフラッシュエッジを使用して、キャピラリーの両端をカット。 </li><li>視覚的に毛細血管が虫眼鏡で終わる検査。キャピラリー端が滑らかでない場合は、切断石のソフト面を使用してそれらを磨きます。 </li><li> Oリングの挿入工具を使用して、開口プラグ孔に絞りOリングを挿入します。 </li><li>バイアルに挿入されたキャピラリーの末端ですぐにケースにカートリッジケースと場所のカートリッジ内に水を満たしキャップされたユニバーサルバイアルをインストールします。短期および長期保存のために2〜8℃で保管してください。 </li></ol></li><li> バッファトレイの準備。 <ol><li>キャップされたユニバースを記入し、配置バッファ入口におけるAlバイアルおよび出口トレー（ 図1）。すべての6サンプルの注入のための1レーンを配置し、分析されるサンプルの数に応じて繰り返しバイアルレーン2における位置、3、4、5、。 注：現在の漏れを防止するために、バイアルキャップ湿潤避けます。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig1.jpg" /> 図1：位置とバッファ入口と出口トレイにユニバーサルバイアルのレベルを埋めます。レベルを入力します。= 1400年1月1日μL、3/4 = 1300μLと1/2 = 1000μL。略語：W =水、塩酸= 0.1 M塩酸。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="4"><li> CEシステムコンポーネントアセンブリ。 <ol><li> UV検出器を取り付けます。 </li><li>開放レバーをインストールインターフェイスブロックにまで押します。 </li><li>光ファイバケーブルを取り付けます。クランプバーに対応する端部を挿入し、両端を保持しながら、時計回りに回転させます。 UV検出器へのもう一方の端を接続します。 注：その破壊を引き起こす可能性が曲げため、この手順の間に注意して光ファイバケーブルを処理します。 </li><li>場所のサンプルとサンプル保持システムにバッファトレイとは、所定の位置にはめ込みます。 </li><li>インターフェイスブロックにキャピラリーカートリッジを置き、両端にクランプバーを押しながら、ノブを締めます。 </li></ol></li></ol> 4.機器のメソッドセットアップ<ol><li>電圧、最大：：次のパラメータと、表1によれば、コンディショニングを作成して実行し、シャットダウン楽器方法30.0 kVの。現在、最大：300.0μA。カートリッジの温度：20.0°C;サンプル保存温度：10.0°C。 UV検出器初期条件：波長：214nmで、データレート：4ヘルツ。フィルター：ノーマル;ピーク幅（ポイント）：16-25;吸光度信号：ダイレクト。 注：データ取得速度は、狭い分離ゾーンのカバレッジを向上させるために、25ヘルツまで増加させることができます。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="8">コンディショニング方式のタイムプログラム</td></tr><tr><td> 時間（分） </td><td> イベント </td><td> 値 </td><td> デュレーション </td><td> 入口バイアル </td><td> アウトレットバイアル </td><td> 概要 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 1.0分</td><td> BI：C1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード</td><td>塩酸0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 2.0分</td><td> BI：B1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード</td> &lt;TD&gt;水</td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 10.0分</td><td> BI：E1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード</td><td> BGE </td></tr><tr><td> 0.00 </td><td>セパレート - 電圧</td><td> 15.0 KV </td><td> 10.0分</td><td> BI：D1 </td><td> BO：D1 </td><td> 0.17分ランプ、通常の極性</td><td>別</td></tr><tr><td> 10.00 </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2758ミリバール</td><td> 10.0分</td><td> BI：E1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード</td><td> BGE </td></tr><tr><td> 20.01 </td><td>待つ</td><td> - </td><td> 0.0分</td><td> BI：A1 </td><td> BO：A1 </td><td> - </td><td>リンスのヒント</td></tr><tr><td colspan="8">方式のタイムプログラムを実行します</td></tr><tr><td> 時間（分） </td><td> イベント </td><td> 値 </td><td> デュレーション </td><td> 入口バイアル </td><tD&gt; アウトレットバイアル </td><td> 概要 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 1.0分</td><td> BI：C1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード、イン/アウトバイアル株式会社6 </td><td>塩酸0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 2.0分</td><td> BI：B1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード、イン/アウトバイアル株式会社6 </td><td>水</td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 4.0分</td><td> BI：E1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード、イン/アウトバイアル株式会社6 </td><td> BGE </td></tr><tr><td> - </td><td>注入 - 圧力を</td><td> 34ミリバール</td><td> 20.0秒</td><td> SI：A1 </td><td> BO：B1 </td><td>フォワード、オーバーライド</td><td>試料注入</td></tr><tr><td> - </td><td>待つ</td><td> - </td><td> 0.4分</td><td> BI：A1 </td><td> BO：A1 </td><td>アウト/インバイアル株式会社6 </td><td>ウォッシュのヒント</td></tr><tr><td> 0 </td><td>セパレート - 電圧</td><td> 15.0 KV </td><td> 30.0分</td><td> BI：D1 </td><td> BO：D1 </td><td> 0.17分ランプ、通常の極性、イン/アウトバイアル株式会社6 </td><td>サンプル分離</td></tr><tr><td> 0.5 </td><td>オートゼロ</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.01 </td><td>データを停止します</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.02 </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 2.0分</td><td> BI：B1 </td><td> BO：C1 </td><td>フォワード、イン/アウトバイアル株式会社6 </td><td>水</td></tr><tr><td> 32.03 </td><td>待つ</td><td> - </td><td> 0.0分</td><td> BI：A1 </td><td> BO：A1 </td><td>アウト/インバイアル株式会社6 </td><td>リンスのヒント</td></tr><tr><td> 32.04 </td><td>終わり</td><td> -</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td>終わり</td></tr><tr><td colspan="8">シャットダウン方式のタイムプログラム</td></tr><tr><td> 時間（分） </td><td> イベント </td><td> 値 </td><td> デュレーション </td><td> 入口バイアル </td><td> アウトレットバイアル </td><td> 概要 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 1.0分</td><td> BI：E6 </td><td> BO：E6 </td><td>フォワード</td><td>塩酸0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td>すすぎ - 圧力を</td><td> 2068ミリバール</td><td> 6.0分</td><td> BI：F6 </td><td> BO：F6 </td><td>フォワード</td><td>水</td></tr><tr><td> - </td><td>ランプ - オフ</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td>待つ</td><td> - </td><td> 0.0分</td><td> BI：A1 </td><td> BO：A1 </td><td> - </td><td>リンスのヒント</td></tr></tbody></table> 表1：エアコン、実行し、シャットダウン時間のプログラム。 5.データ収集と処理<ol><li> サンプルセットをプログラムします。 <ol><li>空調機器のメソッドを使用して調整するためのキャピラリーをプログラムします。毛細管が初めて使用されるとき、プログラム4回繰り返し、そうでなければコンディショニング方法の2つだけの反復をプログラムします。 </li><li>プログラム実行中の機器法を用いて分析されるサンプル。 </li><li>シャットダウン装置メソッドを使用してストレージ用のキャピラリーをプログラムし、セクション3.2.22に示されている手順を繰り返します。 </li></ol></li><li>実験を実行します。 </li><li>電気泳動図をエクスポートします。 </li><li>移動時間を計算し、基本的な、メインAの含有率電気泳動プロファイルの垂直ドロップラインの統合を使用して酸性のアイソフォームND。 </li></ol>

<ol><li>Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advent+of+monoclonal+antibodies+in+the+treatment+of+chronic+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases.</a> Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).</li>
<li>Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of monoclonal antibodies.</a> J. Pharm. Sci. 97 (7), 2426-2447 (2008).</li>
<li>Creamer, J. S., Oborny, N. J., Lunte, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+analysis+of+therapeutic+proteins+by+capillary+and+microchip+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Methods%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the analysis of therapeutic proteins by capillary and microchip electrophoresis.</a> Anal. Methods. 6 (15), 5427-5449 (2014).</li>
<li>Fekete, S., Guillarme, D., Sandra, P., Sandra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic%2C+Electrophoretic%2C+and+Mass+Spectrometric+Methods+for+the+Analytical+Characterization+of+Protein+Biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals.</a> Anal. Chem. 88 (1), 480-507 (2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+identity%2C+charge+variants%2C+and+disulfide+isomers+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+an+uncoated+capillary+column%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of identity, charge variants, and disulfide isomers of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in an uncoated capillary column.</a> Anal. Chem. 82 (8), 3222-3230 (2010).</li>
<li>He, Y., Isele, C., Hu, W., Ruesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+charge+variants+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+dynamically+coated+fused-silica+capillary%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary.</a> J. Sep. Sci. 34 (5), 548-555 (2011).</li>
<li>Zhao, S. S., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+capillary+electrophoresis+in+characterizing+recombinant+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics.</a> Electrophoresis. 35 (1), 96-108 (2014).</li>
<li>Štěpánová, S., Kašička, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+impurities+and+counterions+of+pharmaceuticals+by+capillary+electromigration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of impurities and counterions of pharmaceuticals by capillary electromigration methods.</a> J. Sep. Sci. 37 (15), 2039-2055 (2014).</li>
<li>Štěpánová, S., Kašička, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+applications+of+capillary+electromigration+methods+to+separation+and+analysis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Recent applications of capillary electromigration methods to separation and analysis of proteins.</a> Anal. Chim. Acta. 933, 23-42 (2016).</li>
<li>Espinosa-de la Garza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+recombinant+monoclonal+antibodies+by+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis.</a> Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).</li>
<li>Staub, A., Guillarme, D., Schappler, J., Veuthey, J. L., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+protein+analysis+in+the+biopharmaceutical+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Intact protein analysis in the biopharmaceutical field.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 55 (4), 810-822 (2011).</li>
<li>Altria, K. D. Troubleshooting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltria%2C+KD+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Vol+52.+Capillary+Electrophoresis+Guidebook%3A+Principles%2C+Operation+and+Applications%22">Methods in Molecular Biology, Vol 52. Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation and Applications</a>. Altria, K. D. , Chapter 10 (1996).</li>
<li>Ma, S., Nashabeh, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+therapeutics+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatographia%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein therapeutics by capillary electrophoresis.</a> Chromatographia. 53 (5), 75-89 (2001).</li>
<li>Jaccoulet, E., Smadja, C., Prognon, P., Taverna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+for+rapid+identification+of+monoclonal+antibodies+for+routine+application+in+hospital%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis for rapid identification of monoclonal antibodies for routine application in hospital.</a> Electrophoresis. 36 (17), 2050-2056 (2015).</li>
</ol>

著者のカルロス・E・エスピノサ・デ・ラ・ガルザ、ロドルフォ・D・サラザール・フローレス、ネストル・O・ペレス、ルイス・F・フローレス・オルティス、エミリオ・メディナ・リベロは、バイオシミラー製品の開発、製造、販売を行うプロバイオメッドS.A.デC.V.の従業員です。すべての著者は、プロバイオメッドのバイオシミラー製品の開発に携わっています。

CZEが成功する確率を高めるために、mAbの分析を行う際に、このチュートリアルでは、適切な実践の重要性を強調しています。 CZEが日常的に使用されている場合しかし、問題は必然的に12生じます。 最良の結果を得るために、彼らが困難なステップを克服し、トラブルシューティングするためのアナリストを助けるように、プロトコル全体に含まれていたノートに従うことが重要です。所与の条件のセットに最適な解像度を得るための主要な考慮事項は、BGEソリューションの正しい準備です。このプロセスは、緩衝剤のイオン強度、非緩衝剤およびpHの濃度に対する厳密な制御を有する必要があります。全体的に、CEシステムは、細部にまでケアと注意が必要です。システムの洗浄またはアセンブリに関するいずれかのステップが無視されるかどうかは容易に損傷することができます。 本発明の方法は、中性キャピラリーの使用を考慮しています。裸の溶融シリカキャピラリーとは異なり、中立毛細血管は、このように分離効率、精度と再現9を改善し<...

モノクローナル抗体（mAb）は原因でいくつかの慢性および変性疾患1に対して作用する能力に関心の増加に伴ってバイオ治療タンパク質です。他の生体分子と同様に、mAbは（生合成から最終製品まで、 すなわち ）そのライフサイクルのすべての段階でいくつかの物理化学的修飾を受けるする傾向があります。このような修飾としては、限定されるものではないが：脱アミド化、グリコシル化、酸化、環化、異性化、凝集およびタンパク質分解性切断2。したがって、内因性のイソ型を解決することが可能な分析技術は、品質規格を確立するために、モノクローナル抗体の不均一性と安定性を監視するために必要とされます。 キャピラリー電気泳動（CE）は、バックグラウンド電解液（BGE）を充填した狭い溶融シリカチューブ（μmの範囲）の高性能分離技術行っoutinsideあります。電界を印加すると、荷電分子（3万Vまで）sが反対の電荷（ すなわち 、電気駆動の分離）を有する電極に向かって移動します。 CEでの高電圧の使用は、古典的なゲル電気泳動に優れており、高速分析と効率の向上を可能にします。キャピラリーゾーン電気泳動（CZE）は、定期的に製品の品質評価3-9ためにバイオ医薬品産業で使用されるCEベースの技術です。 CE（ 例えば 、キャピラリーゲル電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動）またはクロマトグラフィーをベースとする方法の他のモードとは異なり、CZEは、その天然の状態10に近いmAbの固有の不均一性の解析を可能にする、変性剤または固相界面を用いることなく実施することができます。モノクローナル抗体アイソフォームのCZE分離は、親水性ポリマー（中性毛細血管）で覆われた溶融シリカキャピラリーの内部で発生した電荷、質量、大きさや形状（または流体力学的体積）11によって支配されているそれらの異なる電気泳動移動度に基づいています。モノクローナル抗体部分は、ときに検出されますそれらは、動員および214 nmの4の紫外線（UV）吸光度検出器によって検出される検出窓を通過しています。 この分析技術の実装を成功させるには、前と実験中に詳細に適切な配慮に依存することになります。そうでなければ作用し、最終的に一定の障害や不満につながる、分析を行うためのコストと時間を増加します。 ここでは、ソリューションやサンプル、CEシステム、設定機器方法、データ収集の準備の準備の詳細な説明を通じてCZEによりモノクローナル抗体の異質性の成功した分析を行うためにステップバイステップのガイドを提示し、処理。このチュートリアルの目的のために、組換え完全ヒト抗腫瘍壊死因子アルファ（抗TNFα）モノクローナル抗体は、タンパク質モデルとして使用されます。しかしながら、このプロトコルは、簡単に短時間の変更を考慮し、他のタンパク質の分析のためにカスタマイズすることができます。 Additionally、潜在的な問題を軽減するためのいくつかの推奨事項が提案されています。読者が成功する確率が増加するように厳密に、提案されたプロトコルに従うことが奨励されています。

<table><tbody><tr><td>氷酢酸</td><td>Tecsiquim</td><td>AT0035-7</td><td></td></tr><tr><td>ACSグレードの塩酸</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-05</td><td></td></tr><tr><td>ヒスタミン二塩酸塩</td><td>Fluka</td><td>53300</td><td></td></tr><tr><td>(ヒドロキシプロピル)メチルセルロース&nbsp;</td><td>Fluka</td><td>09963</td><td></td></tr><tr><td>酢酸リチウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>6-アミノカプロン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,&nbsp; pH 8</td><td>Beckman Coulter</td><td>477427</td><td></td></tr><tr><td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66528</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Neutral Capillary&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>477441</td><td></td></tr><tr><td>バイアル、マイクロ、200 & マイクロ;l</td><td>ベックマン・コールター</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルバイアルキャップ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A62250</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルバイアル</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A62251</td><td></td></tr><tr><td>ケーブル、光学、UV/ヴィス</td><td>ベックマン・コールター</td><td>144093</td><td></td></tr><tr><td>UV/ヴィス検出器モジュール</td><td>ベックマン・コールター</td><td>144733</td><td></td></tr><tr><td>カートリッジ組立キット、ブランク</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td>144738</tr></tbody></table>

ニュートラルキャピラリーを使用したモノクローナル抗体アイソフォームのキャピラリー電気泳動分離

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

モノクローナル抗体(mAb)のようなバイオ医薬品タンパク質は、慢性変性疾患の治療のための実行可能な代替手段です。これらのタンパク質の生物学的活性は、それらの物理化学的性質に依存します。クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動などの高性能技術の使用は、モノクローナル抗体の物理化学的不均一性の分析のために説明されています。今日、キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)技術は、生体分子の分析のための最も溶解力があり感度の高いアッセイの1つを構成しています。さらに、CZEにおける電気駆動の分離は、物質の広範な特性によって支配されており、天然の状態に近いタンパク質を分析できるという利点があります。ただし、この手法をルーチン分析にうまく実装できるかどうかは、サンプルおよびシステム調製中の重要なステップにおける分析者のスキルにかかっています。このチュートリアルの目的は、mAbのCZE解析を成功させるための手順を詳しく説明することです。さらに、このプロトコルは、タンパク質分析化学実験室に関与する人員のスキルの開発と向上に使用できます。

図2は、200mMのEACA、30ミリモルの酢酸リチウムの典型的な電流プロファイルを示し、トリス緩衝液（50mM、pH8.0）で希釈した抗TNFαモノクローナル抗体の試料を用いてpHを4.8 BGE。観察されるように、現在の分析を通して安定であり、30〜35μAの値の間で振動することができます。 図3は、検出されたピークは、ヒスタミン内部標準に対応するブランク試料のCZEの電気泳動図を示しています。 3.7〜4.1分の移動時間を持つようにヒスタミンが期待されています。 図4は、抗TNFαmAbのCZEの電気泳動図を示しています。注目されるように、主ピークが先行し、より小さい強度のピークが続きます。分離は通常の極性（ すなわち 、正から負への）下で実施されているので、分析は、基本的なアイソフォーム（mAbは正の電荷を有する変異体）より速く移行し、酸性のアイソフォームを（mAbが負電荷を有する変異体）を明らかに<html>...

ここでは、モノクローナル抗体の固有の物理化学的不均一性を品質属性として評価するための包括的な毛細血管ゾーン電気泳動プロトコルを提示します。

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

今日、キャピラリー細胞電気泳動法は、モノクローナル抗体などのバイオ分子分析において、最も分解能が高く感度の良い手法の一つとなっています。しかし、この手法を正常に実施できるかどうかは、サンプルおよびシステムの調製における重要なステップにおける分析者の知識とスキルにかかっています。本チュートリアルでは、分析を成功させるための方法について、溶液およびサンプルの調製、キャピラリー電気泳動システムの準備、装置のメソッド設定、ならびにデータの判定と処理に関する詳細な解説を目的としています。全体として、このプロトコルは分析化学研究室の準備に従事するスタッフのスキル開発および向上に利用できます。100 mLで最終濃度0.05%となる量のHPMCを量り取ります。HPMCは基本的な弾性ポリマーであるため、最初のステップとして、粉末をガラスビーカーに注ぎ、80 mLの水をゆっくりと加えて粉末を分散させます。次に、濡らしトレイを水ですすいで粉末の痕跡を取り除きます。通常通りに残りの試薬を加え、溶液を撹拌します。50% 酢酸を用いて pH 値を 4.8 に調整します。その後、溶液を5分間静置して安定させます。次いで、必要に応じてpHを調整します。最後に、水を加えて全量を100 millilitersにします。調製したBG溶液を中性膜でろ過し、ガラス瓶に注ぎます。最後に、ガラス瓶に適切にラベルを貼り、冷蔵保存します。サンプルを調製するための最初のステップとして、1.5 milliliterチューブに162 microlitersのトレースバッファー溶液を加えます。次に、あらかじめ調製した濃度 10 mg/mL のMAPサンプルを 18 µL 加えます。3番目のステップとして、あらかじめ調製した 1% ヒスタミン溶液を 20 µL 加え、最終サンプル容量を 200 µL にします。次のステップで、サンプルを 5 秒間調製します。5秒間遠心分離します。サンプルの全量を吸引します。気泡の混入を防ぐため、マイクロバイアルの上方に向かって分注します。最後に、バイアルにキャップをし、冷蔵保存します。電源スイッチを押してCE装置の電源を切ります。そして、フロントドアを開けます。インターフェースブロックの下に新しい移動用ワイプを敷きます。洗浄ボトルを用いて、インターフェースブロック経由で電極を水で洗浄してください。水が穴から滴り落ちるようにし、インターフェースブロックを十分に乾燥させます。ワイプを使用して、電極上の余剰な水を慎重に拭き取ります。この操作中に電極に触れないよう注意してください。サンプル保持システムからワイプを取り除きます。新しい水で湿らせた非脱落性のワイプで、サンプルプレートの表面およびバッファープレートの表面を清掃します。バッファープレートを上にスライドさせ、サンプル保持システムを上に

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治療用抗体の実験室規模の産生および精製

学ぶモノクローナル抗体アイソフォームのキャピラリー電気泳動分離法。HPMC溶液調製、サンプル前処理、装置セットアップ、データ解析の詳細プロトコルを習得し、分析化学ラボの技術向上に活用できます。

ニュートラルキャピラリーを使用したモノクローナル抗体アイソフォームのキャピラリー電気泳動分離

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