3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

カスタマイズされたハイドロゲルを作製するこの方法の全体的な目標は、肺の細胞外マトリックスの複雑さを再現する細胞と培養条件を研究することです。この方法は、健康で病理学的な条件下で肺細胞がECMとどのように相互作用するかなど、肺領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、肺ECMハイドロゲルが2Dまたは3D培養のアプリケーションに合わせて調整できることです。

一般に、この方法に不慣れな個人は、脱細胞化技術の複雑さのために苦労し、生存可能な組織の量を最適化するために複数の人と細部への注意が必要な場合があります。このプロトコルでは、ブタの肺を脱細胞化の準備をします。その準備の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。

肺の準備ができたら、肺動脈に合うようにカニューレ挿入されたハンドポンプを使用します。まず、約1リットルの水を血管系に灌流し、次に1.5リットルを気管に灌流します。これを3回繰り返し、細胞の破片が除去されるときに灌流される水の量を増やします。

次に、同じくハンドポンプを使用してTriton X-100でティッシュを灌流します。その後、組織をTriton X-100溶液の浴槽に摂氏4度で24時間浸します。24時間後、蒸留水で血管系と気管を3回すすぎます。

すすぎ後、ハンドポンプを使用して組織にデオキシコール酸を灌流します。次に、組織をデオキシコール酸に4°Cで24時間沈めます。翌日、前と同じように、ティッシュを蒸留水で3回すすいでください。

すすぎ後、ハンドポンプを使用して、ろ過された塩化ナトリウムで組織を灌流します。次に、組織をろ過した塩化ナトリウムに摂氏4度で1時間浸します。入浴後、蒸留水で血管系と気管を3回灌流してすすぎます。

すすぎ後、組織にDNase溶液を灌流し、DNase溶液に摂氏4度で1時間浸します。1時間後、水ではなくPBSを使用して血管系と気管を5回灌流します。次に、不透明な白い組織のみを使用して、直径2ミリメートル以上のすべての細管を解剖します。

それらは主に肺の門部と内側部分の周りに見られます。呼吸領域はそのままにしておきますが、そのほとんどが周辺にあります。尿細管を切除した後、組織を1インチ以下のセクションに解剖します。

これらのブロックの向きは重要ではありません。ティッシュブロックを排出した後、50ミリリットルの円錐形チューブに移し、摂氏80度で凍結します。組織学のためにいくつかのブロックを確保して、細胞や破片の除去を確認できます。

肺組織を脱細胞化粉末に加工するには、凍結した組織チューブのカバーを濾紙に交換し、これをゴムバンドで固定します。次に、製造元の指示に従って、凍結乾燥機を使用して余分な液体がすべてなくなるまで組織を凍結乾燥します。次に、ティッシュを80°Cで粉砕できるようになるまで保管します。

ミルを準備するには、まず液体窒素を投入し、ミルチューブ用のスペースを確保します。次に、ミルチューブからマグネットミルバーを取り外し、チューブの底をティッシュで覆います。次に、ミルバーを交換し、チューブを充填するためにさらにティッシュを緩く詰めます。

次に、ミルチューブを閉じて冷凍庫/ミルに入れ、ミルを最大容量まで液体窒素で満たします。次に、ミルを約5分間、毎分約600のインパッション率で運転します。次に、脱細胞化粉末を必要になるまで摂氏80度で保存します。

プレゲル材料を作るには、脱細胞化組織粉末とペプシンを円錐形のチューブに加えます。次に、0.01モルの塩酸をチューブに加え、最終濃度を1%の脱細胞化組織粉末と0.01%のペプシンにします。この溶液を室温で48時間一定に攪拌し、組織を消化します。

48時間後、溶液を氷の上に5分間置きます。次に、冷たく0.1モルの水酸化ナトリウムを使用して溶液のpHを7.4に調整し、次にPBSを10倍に加えて溶液のPBS濃度を1倍にします。プレゲルの時間とpHを変更した経験があります。

使用できる範囲にはある程度の柔軟性がありますが、手順を少し変更すると、プロパティが大幅に変わる可能性があります。この溶液はプレゲルとは見なされず、未処理のプレートをコーティングして細胞を形成するためのヒドロゲルを形成したり、細胞を形成するためのヒドロゲルを形成したり、ヒドロゲルを形成する前にさらに改変してヒドロゲルの剛性を高めることができる。2次元微多孔質ゲルコーティングで細胞を培養するには、96ウェル未処理の組織培養プレートのウェルに20マイクロリットルのプレゲル溶液を加えます。

次に、プレートを摂氏4度で一晩冷蔵して、タンパク質がプレートに吸収されるようにします。翌日、プレゲル溶液を吸引し、PBSでウェルをすすぎます。次に、各ウェルに3,200個の細胞を加え、各ウェル内の培地量を100マイクロリットルに補充します。

その後、プレートをインキュベートできます。微多孔質ゲル内に細胞を入れた三次元細胞培養では、目的の細胞をプレゲル溶液中に1ミリリットルあたり100万個で再懸濁します。次に、16マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルにすばやく分注して、厚さ約500ミクロンの3D細胞培養を形成します。

ゲルは、摂氏37度でインキュベートすると30分で形成されます。ゲルが形成されたら、100マイクロリットルマークまでウェルに培地を追加します。微多孔質ゲルの上に細胞を載せた三次元細胞培養では、未処理の96ウェルプレートのウェルに100マイクロリットルのプレゲル溶液を加えます。

次に、プレートを摂氏37度で30分間インキュベートし、ゲル化します。ゲルが形成されたら、ヒドロゲルの上に100マイクロリットルの培地に3, 200個の細胞を加え、プレートのインキュベートに進みます。ヒドロゲルは、記載された方法を用いて、正常なブタ、ラット、およびマウスの肺から作製した。

レオロジー試験により、ゲル化の90%以上が摂氏37度に達した後の最初の数分で発生することが確認されました。形成されたハイドロゲルはPBS中で長期間安定でしたが、細胞の接着と増殖は時間とともに変化する可能性があります。プレゲル溶液は、細胞接着を改善するためのコードとして試験されました。

ヒト臍帯静脈内皮細胞の付着と増殖は、MTTSAを使用して測定されました。井戸をECMでコーティングすることにより、改善が観察されました。3Dゲルを作製する際に、Genipinを添加するとハイドロゲルの架橋が増加しました。

レオメーターの周波数スイープを使用して、ヒドロゲルの硬さはジェニピン濃度と直接相関し、中央値で最も関連性の高い濃度は0.01%でした。硬質ゲルが高いほど、細胞増殖はゲル上のMTTSAによって高く、架橋が増加しました。一度習得すれば、脱細胞化は4日間で8時間で行うことができます。プレゲル溶液は2日間で1時間で作製でき、ゲル形成は2日間で2時間で作製できます。

この手順に続いて、AFM、ウェスタンブロット、染色、免疫組織化学などの他の方法を実行して、弾性率、タンパク質組成、材料に対する細胞応答などの追加の質問に答えることができます。