実験的大腸炎の間、腸上皮バリア機能に栄養補助食品の有益な効果を分析

このプロトコルの全体的な目標は、デキストラン硫酸ナトリウムによって誘発される大腸炎のマウスモデルにおけるサプリメント栄養素の効果を評価することです。この方法は、大腸炎モデル実験の方向性全体にわたる臨床科学の発展に関する腸管免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、低コストで、高度な機器を必要とせず、結腸全体の形態を明確に分析できることです。

この方法は、好中球の過剰な動員の結果として結腸の酸化ストレスを評価するために使用できます。強制経口投与による栄養補助食品の投与は、まずマウスの首筋を手で拘束し、尾を薬指と親指の付け根の間に置きます。次に、マウスを直立させた状態で、動物の口の左側に強制針を挿入し、口蓋を慎重にたどって食道を見つけます。

抵抗がない場合は、針を胃に向かって進めます。.サプリメントの全量をゆっくりと送達し、続いて注射器を慎重に取り外し、動物の体重を測定します。減量率に応じて 0 から 4 のスコアを割り当て、新鮮な便サンプルを採取し、付属のアプリケーターを使用して、グアヤック便潜血検査キットのスライドにサンプルの薄い塗抹標本を塗布します。

キットの前面にあるカバーを閉じ、背面ウィンドウを開いて、サンプル位置の背面に開発者ソリューションを 2 滴塗布します。30秒後に結果を読み取り、信号強度に応じて0から4のスコアを割り当てます。次に、2 番目の新鮮な便サンプルを観察して便の一貫性を評価し、必要に応じて 0 から 4 のスコアを割り当てます。

in vivoで腸上皮透過性を決定するには、麻酔をかけた動物を仰臥位に置き、正中線切開を行って腸を露出させます。盲腸の位置を特定し、結腸の近位部分に小さな切開を行います。次に、22ゲージの送り針を挿入し、一般的な絹糸の結紮糸で針を固定します。

大量のPBSを針を通して慎重に洗い流し、結腸からすべての糞便を洗い流し、続いて染料が肛門に到達するまでエバンスブルー溶液を取り付けます。15分後、肛門周囲のウォッシュアウトがクリアになるまで、過剰な量のPBSでチューブを洗い流します。.次に、結腸を切除し、さらにPBSで組織をすすぎ、続いて1ミリリットルの6ミリモルN-アセチルシステインをすすぎ、結腸粘液に付着した色素を排除します。

次に、結腸を縦方向に切断し、PBSとN-アセチルシステインで組織をもう一度すすぎ、結腸の重量と長さを記録し、組織を室温で2ミリリットルのN、N-ジメチルホルムアミドに入れ、穏やかに攪拌して残りの色素を抽出し、翌朝610ナノメートルで分光光度で染料濃度を測定します。デキストラン硫酸ナトリウム、またはDSS誘発性大腸炎の7日後、結腸全体を解剖し、その長さを記録します。スイスロールの場合は、結腸を縦方向に開き、糞便を慎重に取り除き、細い丸い木製の棒または先端の細い鉗子を使用して、粘膜を内側に向けて組織を転がします。

次に、組織を埋め込みカセット内に慎重に置き、続いて室温で5ミリリットルの10%ホルムアルデヒドで固定します。組織切片化中の問題を避けるためには、折りたたむことなく結腸をしっかりと巻き上げることが重要であり、臨床的な組織損傷や大腸炎関連の損傷と誤って解釈される可能性があります。48時間後、サンプルを水道水で18時間洗浄し、続いてエタノールシリーズで脱水します。

最後の無水エタノール浸漬後、キシレンで1時間のインキュベーションを4回行い、組織を処理します。最後のキシレン浸漬後、サンプルを50ミリリットルの流動パラフィンに入れ、17時間インキュベーション1回と3時間インキュベーション1回を行います。3時間のインキュベーションの終わりに、サンプルを22立方ミリメートル四方のプラスチック型に8〜10ミリリットルの新鮮な液体パラフィンに24時間浸します。

パラフィンが固まったら、ミクロトームを使用して5ミクロンの厚さの組織切片を取得し、0.3%ゼラチンを含む1リットルの水浴に断面を短時間浸し、すぐにサンプルをポリリジンで処理したスライドガラスにマウントしてH&E染色します。酸化ストレス解析では、まず疎水性ペンを使用して組織の周囲にバリアを作成します。次に、8ミクロンの組織クライオ断面を5マイクロモルDHEにインキュベートし、暗所で摂氏37度で30分間溶解します。

インキュベーションに続いて、室温で穏やかに撹拌しながらPBSで15分間洗浄を3回行います。サンプルを風乾し、蛍光を保護するために封入剤を一滴加えます。次に、酸化したエチジウム蛍光をレーザー走査型共焦点顕微鏡で40倍の倍率で観察します。

DSS治療は、予想通り疾患活動性指数を継続的に増加させ、導入後7日目に最大スコアに達します。抗炎症食のサプリメントは大腸炎の早期発症を遅らせますが、保護効果は後の時点ではわずかです。食事介入は、DSSによる腸上皮透過性の増加、および結腸の長さの短縮を防ぐ可能性もあります。

パラフィン包埋遠位結腸組織のヘマトキシリンおよびエオシン染色は、対照サンプルが正常な形態を示すのに対し、DSSで治療された動物は大腸炎の典型的な徴候を示すことを明らかにしています。注目すべきは、食事補給との並行治療は、対照群と全体的な形態が同様の形態で、大腸炎による形態学的変化を明らかに緩和することです。遠位結腸組織の免疫蛍光染色は、DSS誘発性大腸炎中にタイトなインアドヘレンジャンクション分子が内在化され、これらのタンパク質の共局在が陰窩上皮細胞の接触で部分的に失われることも示しています。

重要なことに、DSSで治療したマウスが抗炎症および抗酸化食のサプリメントを投与されると、この内在化が減少します。さらに、DSS誘発性大腸炎に応答した結腸への好中球の強力な動員は、食事補給によって打ち消され、好中球誘発性酸化ストレスの同時改善と炎症性サイトカイン産生のわずかな減少をもたらします。この手順に続いて、にじみ出るチャンバー測定などの他の方法を実行して、結腸の上皮バリアの電気抵抗を分析できます。

その開発後、この技術は、大腸炎研究の分野の研究者と、再現性のあるマウスモデルで潰瘍性大腸炎の病因の分子メカニズムを探求する道を開きました。このビデオを見た後、大腸炎の発症を分析する方法と、腸の上皮バリア機能に対する栄養補助食品の有益な効果について十分に理解しているはずです。生きた動物を扱うには、不必要な苦しみを避けるために高い倫理基準を順守する必要があることを忘れないでください。