マウスで有酸素運動によってオートファジーのアクティブ化

この実験の全体的な目的は、強制走行または自発走行によってマウスのオートファジーを生理的に活性化し、特定の組織におけるオートファジーレベルを測定することです。この手法は、オートファジーに関する重要な疑問、特にオートファジーと身体活動が有酸素運動による有益な効果にどのように寄与しているかという問いへの回答に役立ちます。この手法の主な利点は、身体運動がマウスを用いたin vivoでのオートファジーを誘導する迅速な有酸素的手段となることです。

本実験では、生体内での運動誘発性オートファジーを検出するためのトランス遺伝子（GFP-LC3）を保持する、生後8〜12週のC57BL/6マウスを使用します。マウス用トレッドミルの使用方法の詳細については、以下のJoVE論文を参照してください。トレッドミルの電気刺激は低強度に設定します。

最初の2回のセッションで、マウスを傾斜10度のオープンランニングマシンに慣らします。1日目は、ランニングマシンを8 meters per minuteで動作させ、マウスを5分間運動させます。2日目は、最初は8 meters per minuteで、5分後に速度を10 meters per minuteまで上げ、合計10分間走らせます。

3日目には、マウスを90分間全力で走らせます。トレッドミルの速度を分速10メートルで開始し、足への電気ショックが繰り返されないよう、軽く背中を押すなどしてマウスに走るよう促してください。90分間の走行中に、マウスが過度な電気ショックを受けないよう、注意深く観察し、適切に誘導することが極めて重要です。

走行中は、指を使ってマウスがトレッドミルの上に留まるように促してください。40分後、速度を1 m/min上げます。50分後、さらに速度を1 m/min上げます。

60分後、速度をさらに 1 meter per minute 上げます。70分後から5分ごとに速度を上げ、90分間の走行の最後の5分間が 17 meters per minute になるように調整します。試験終了後、必要に応じて組織回収のためにマウスを直ちに安楽死させます。

この試験では、マウスを個別に飼育します。系統は前述のものを使用してください。自転車用走行距離計を取り付けた直径11.4 centimeterのマウス用ランニングホイールを用意します。

1回転につき358 millimetersの走行距離となるように設定します。マウスをホイールの入ったケージに入れ、2週間自由に走行させます。24時間ごとに、オドメーターからマウスの走行距離を記録してください。

2週間後、必要に応じて解析用の組織を採取します。オートファジーフラックスを測定するため、オートファジー阻害剤であるクロロキンを3日間マウスに投与します。クロロキンをPBSに溶解して5 mg/mLとし、50 µg/gの用量でマウスに腹腔内投与します。

マウスに1日1回、3日間連続で注射を行い、最後の注射から3時間後に組織を採取します。トレッドミル運動を行うマウスについては、3日目の注射から90分後に90分間の走行を開始し、走行が注射から3時間後に終了するようにします。その後、マウスを安楽死させ、直ちに組織を採取します。

固定液を準備し、動物に運動させてから90分以内に灌流できるように準備します。30 mLシリンジに、調製したばかりの4%パラホルムアルデヒドを15〜20 mL充填し、20ゲージのカテーテル針を接続します。充填したシリンジをポンプに取り付け、連続フローで90 mL/hに設定します。

動物を清潔な作業台の上に仰向けに置き、横隔膜を通して胸腔を切開し、心臓を露出させます。次に、右心室にカテーテル針を挿入します。続いて、肝臓に小さな切開を加えて血液を排出し、ポンプを作動させます。

肺と肝臓が完全に白くなるまで固定液を注入します。通常、15 millilitersの固定液で十分です。灌流後、針を取り除き、目的の組織を採取します。

骨格筋を採取するために、外側広筋を解剖します。脚の皮膚を後方に軽く引っ張り、筋肉を露出させて大腿四頭筋を特定します。次に、大腿骨の上部に付着している外側の筋肉である外側広筋を切り出します。

さらに固定および脱水を行うため、採取した組織を4%パラホルムアルデヒドに入れ、4 °Cで24時間保持します。翌日、組織を15%スクロースPBSに移し、4 °Cで一晩、または溶液の底に沈むまで浸漬させます。その後、組織を30%スクロースPBSに移し、4 °Cで一晩またはそれ以上の時間保持します。

これらの浸漬操作中は、組織を可能な限り暗所に保持してください。次に、組織をOCTなどの包埋剤に入れ、必要に応じて小さく切断します。その後、小さなペトリ皿の中で数分間静置し、馴化させます。

その後、試料をクライオモールドに移し、全体が浸るまで十分な量のOCTを加えます。モールド内では、切片作成面を下向きに配置し、気泡が入らないようにしてください。次に、OCTが白くなるまで、ドライアイスを入れた蓋付きのフォームクーラーの中で試料を凍結させます。

次に、個々のサンプルをラベルを貼ったホイルで包み、プラスチック袋に封入して、処理を行うまで-80°Cで保存します。GFPタグ付きLC3をリポーターシステムとして用いて、上述の通りに運動させたマウスにおいてオートファジーの誘導が観察されました。オートファジーの刺激後、LC3は細胞質からオートファゴソームへと移行し、点状の構造として観察されました。

安静状態のマウスと比較して、運動させたマウスでは骨格筋および大脳皮質の両方でGFP-LC3点状構造（puncta）が大幅に増加していました。LC3抗体を用いたウェスタンブロット解析により、運動によって脂質結合型LC3-IIの生成が有意に誘導されたことが示され、細胞質内のLC3-IからLC3-IIへの変換が増加したことが示唆されました。次に、オートファジー貨物レセプターであるp62の分解を測定しました。

90分間のトレッドミル運動により、骨格筋におけるp62の分解が安静時よりも促進されました。この効果は、運動前にクロロキンを投与することで消失しました。クロロキンはリソソーム分解の阻害剤であるため、これらのデータは、観察された現象がオートファゴソーム分解の停止ではなく、オートファジーフラックスの亢進によるものであることを示しています。

本手法の開発後、オートファジーの分野において、代謝の分解および動物行動における運動メカニズムへの影響を調査するための先駆的な研究が行われました。この手順を実施する際は、マウスの走行状態を監視することが重要です。本手順の後には、電子顕微鏡などの手法が続きます。

ミトファジーやリポファジーなどの選択的オートファジー経路における運動の影響など、さらなる疑問を解消するために、動物顕微鏡観察を行うことができます。