マウスで有酸素運動によってオートファジーのアクティブ化

オートファジーの活性化は、多くの疾患の予防に有益です。 生体内でオートファジーを誘導する生理的なアプローチの一つは、物理的な運動です。ここでは、有酸素運動によってオートファジーを活性化し、マウスにおけるオートファジーのレベルを測定する方法を示しています。

この実験の全体的な目標は、強制的または自発的なランニングによってマウスのオートファジーを生理学的に活性化し、特定の組織におけるオートファジーのレベルを測定することです。この方法は、オートファジーに関する重要な問題、特にオートファジーと作用が有酸素運動による有益な効果にどのように寄与するかという疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マウスを用いたin vivoでのオートファジー間の有酸素運動が速い運動であることです。

この実験では、GFP-LC3として知られるin vivoで運動誘発性オートファジーを検出するトランス遺伝子を持つ、8〜12週齢のC57ブラックシックスマウスから始めます。マウストレッドミルの使用方法の詳細については、次のJoVEの出版物を参照してください。トレッドミルの電気刺激を低強度に設定します。

最初の2回のセッションで、マウスを10度上り坂のオープントレッドミルに順応させます。初日は、トレッドミルを毎分8メートルで動かしながら、マウスを5分間運動させます。2日目は、マウスを10分間、最初は毎分8メートルで実行し、5分後に速度を毎分10メートルに上げます。

3日目には、マウスを90分間完全に実行します。トレッドミルを毎分10メートルで始動し、マウスに優しくつまんで走らせるように促し、足への衝撃が繰り返されないようにします。マウスを観察して操作し、90分間の実行中にマウスがあまり多くの電気ショックを受けないようにすることが重要です。

ランニング中は、指を使ってマウスがトレッドミルに留まるように促します。40分後、6分ごとに1メートルずつ速度を上げます。50分後、再び1分ごとに1メートルずつ速度を上げます。

60分後、速度を毎分さらにメートル上げます。70分後、5分ごとに速度を上げ始めて、90分のランの最後の5分が毎分17メートルになるようにします。試験終了後、必要に応じて直ちにマウスを安楽死させて組織採取します。

このテストでは、マウスを個別に飼育します。前述したものと同じ株を使用してください。直径11.4センチのマウスランニングホイールと付属のバイク走行距離計を用意します。

各回転の移動距離は 358 mm です。マウスをホイールの入ったケージに移し、マウスが2週間自由に使えるようにします。24時間ごとに、走行距離計からマウスで走った距離を記録します。

2週間後、必要に応じて分析のために組織を採取します。オートファジーフラックスを測定するには、オートファジー阻害剤であるクロロキンをマウスに3日間投与します。クロロキンをPBSに5ミリグラム/ミリリットルで溶解し、50マイクログラム/グラムの用量でマウスに腹腔内に注射します。

マウスに1日1回の注射を3日間連続して行い、最後の注射から3時間後に組織を採取します。トレッドミル運動マウスの場合、3日目に注射の90分後に90分間のランニングを開始し、注射の3時間後にランが終了します。次に、マウスを安楽死させ、すぐに組織を採取します。

運動後90分以内に動物を大量に摂取する準備をします。30ミリリットルのシリンジに15〜20ミリリットルの新しく作られた4パーセントのパラホルムアルデヒドをロードし、シリンジを20ゲージのカテーテル針で接続します。装填したシリンジポンプを取り付け、連続流量を毎時90ミリリットルに設定します。

動物を清潔な作業面に置き、仰臥位にして、横隔膜を通して胸腔を切り開き、心臓を露出させます。次に、カテーテル針を右心室に挿入します。次に、肝臓に小さな切開をして血液を排出し、ポンプを開始します。

肺と肝臓が完全に青白くなるまで固定剤を注入します。.通常、15ミリリットルの固定剤で十分です。増殖後、針を取り外し、目的の組織を採取します。

骨格筋を採取するには、外側広筋を解剖します。脚の皮膚を少し後方に引っ張って筋肉を露出させ、大腿四頭筋の位置を特定します。次に、大腿骨の上部に付着している外部筋肉である外側広筋を解剖します。

さらなる固定と脱水のために、採取した組織を摂氏4度で24時間4パーセントのパラホルムアルデヒドに置きます。翌日、組織を15%のショ糖PBSに移し、一晩または溶液に落ち着くまで摂氏4度に浸します。次に、組織を摂氏4度で30%ショ糖PBSに一晩以上移します。

これらの入浴中は、組織をできるだけ暗く保ってください。次に、組織をOCTなどの埋め込み培地に入れ、必要に応じて細かく切ります。次に、小さなシャーレに数分間順応させます。

その後、覆うのに十分なOCTでそれらをクライオモールドに移します。金型では、切断面を底部に向け、気泡が形成されないようにします。次に、ドライアイスで満たされた蓋付きのフォームクーラーでサンプルを凍結し、OCTが白くなるまで凍結します。

次に、個々のサンプルをラベル付きのホイルで包み、ビニール袋に密封し、処理できるようになるまで摂氏マイナス80度で保管します。GFPタグ付きLC3をレポーターシステムとして用いると、記載したように運動したマウスでオートファジー誘導が観察されました。オートファジー刺激後、LC3は細胞質からオートファゴソームに穿通構造で移行しました。

運動マウスは、安静時マウスと比較して、骨格筋と大脳皮質の両方でGFP-LC3点がはるかに多かった。LC3抗体を用いたウェスタンブロット解析では、運動が脂質共役LC3-IIの生成を有意に誘導することが示され、細胞質LC3-IからLC3-IIへの変換が増加したことが示唆されました。次に、オートファジーカーゴ受容体p62の分解を測定しました。

90分間のトレッドミル活動は、安静時よりも骨格筋のp62の分解が高かった。この効果は、運動前にクロロキンを注射することで救われました。.クロロキンはリソソーム分解の阻害剤であるため、これらのデータは、観察された現象がオートファゴソーム分解のブロックではなく、オートフォガジームフラックスの上昇によるものであることを示しています。

開発後、この技術はオートファジーの分野に先駆けて、代謝の劣化や動物の行動の劣化における運動のメカニズムへの影響を探ることができました。この手順を試行するときは、マウスの実行中にマウスを監視することが重要です。この手順に続いて、電気顕微鏡のような方法があります。

動物顕微鏡検査は、マイトファジーや脂肪食などの特定のオートファジー経路での運動などの追加の質問に答えるために行うことができます。