Name: マウスで有酸素運動によってオートファジーのアクティブ化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学ぶ マウスを用いた有酸素運動によるオートファジー活性化の手法。GFP-LC3トランスジェンを使い、特定組織でのオートファジー誘導を測定し、運動の生理学的効果を解明する。

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技術支援と支援を提供してくださったノースウェスタン大学のマウス組織学および表現型研究室、GFP-LC3トランスジェニックマウスを提供してくださった水島昇氏(東京大学)に感謝します。A.R.とC.H.は、ノースウェスタン大学のスタートアップ資金と国立衛生研究所（DK094980）からの助成金によって支援されました。

動物に関わるすべての手順は、ノースウェスタン大学施設内動物管理使用委員会（IACUC）により承認ガイドラインに従って行いました。 1.マウスモデル<ol><li>運動トレーニングに8-12週齢のマウスを使用してください。 生体内で行使により誘導されるオートファジーを検出するために、イメージング研究および生化学的分析のためのC57BL / 6マウスのためのGFP-LC3トランスジェニックマウス（C57BL / 6バックグラウンド）を使用します。 </li></ol> 2.運動誘発オートファジー<ol><li> トレッドミルのセットアップ-強制運動 <ol><li>順応し、2日間10℃上り坂オープントレッドミル上でマウスを訓練します。 1日目に8メートル/分で5分間、マウスを行使し、2日目に8 mでは5分間のマウス運動/分10m /分10でさらに5分間続きます。優しい手ナッジによって実行するために、マウスを奨励します。 </li><li> 3日目に、マウスが10°上り坂トレッドミル、startiで90分間実行して、単一の試合を受けてみましょう10m /分の速度でngの。 40分後、30分の合計は1メートル/ 10分毎分の速度で、トレッドミルの速度を増加させ、そしてその後17メートル/分に達するまで1メートル/ 5分毎分の速度で速度を増加させます、運動時間の90分と距離を実行しているの1070メートルの合計。 </li><li>低強度範囲（1.2ヘルツ）で電気刺激を設定し、繰り返し足の衝撃を回避するために実行するためにマウスを奨励します。 </li><li>組織収集のために、運動直後頸椎脱臼が続くイソフルラン吸入によってマウスを安楽死させます。他の承認された安楽死の方法はまた、二酸化炭素または他の麻酔薬のIP注射として使用することができます。オートファジーのレベルは、安楽死の方法によって影響されていないようです。 </li></ol></li><li> 自発運動-車輪のセットアップを実行します <ol><li>シングル収容されたマウスでケージの中にマウスランニングホイール（11.4センチメートル直径）を配置します。 </li><li>自転車の走行距離計を使用して、実行中の容量を確認してください。（π* 11.4）358で[ホイールの全回転当たりの距離（mm）]ホイールパラメータを設定します。 24時間後の走行距離を測定します。 </li><li>マウスは、走行輪と2週間自主的に実行してみましょう。組織収集のために、実行している期間の後、午前中にマウスを生け贄に捧げます。 </li></ol></li></ol> 3.オートファジーフラックスの評価<ol><li>安静時や運動条件下でのオートファジーフラックスを測定するために、3日間のオートファジー阻害剤クロロキンでマウスを治療し、PBSで処置したマウスと比較します。 <ol><li> PBSにクロロキンを溶解する（5 mg / mlで）、3日間連続して腹腔内に50mg / kg /日の用量でマウスにクロロキンを注入します。マウスを犠牲にし、組織を最後の注射後3時間を収集します。 </li><li>行使されたマウスは、50 mg / kg /日の用量で2日間連続クロロキンでそれらを前処理。三日目に、後クロロキンの同じ濃度でマウスを注入し、90分彼らは別の90分間のトレッドミル上で実行してみましょう。 </li><li>頸椎脱臼が続くイソフルラン吸入によってマウスを、安楽死させます。クロロキンの総インキュベーション時間は、コントロール（安静時）マウス（3時間）と同じになるように、すぐに実行した後の組織を収集します。 注：別の方法として、マウス組織におけるオートファジーフラックスを決定するためにクロロキンの単回注射を使用します。 </li></ol></li></ol> 4.組織の収穫と固定<ol><li> 7.4の最終pHで、PBS中：組織の収穫の前には、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、新鮮な4％パラホルムアルデヒド（必要な個人用保護機器PFA、注意を）準備します。 4℃で両方のソリューションを格納します。 </li><li> （GFP-LC3マウス用）4％PFAの20ミリリットル - 15と30ミリリットル注射器を埋めます。 20 Gカテーテル針で注射器を接続します。 </li><li>運動後、頸椎脱臼に続いて、イソフルラン吸入によりマウスを安楽死させます。 </li><li>そのBAに清潔な作業面に動物を置きますCK。カットし、心臓を露出するために、振動板を切断して胸腔を開きます。 </li><li>肺と肝臓が完全に青ざめるまで、血が出て来るように、カテーテルを介して心臓の右心室にゆっくりと15ミリリットル4％PFAの合計を注入するために肝臓に小さな切開を行います。 90ミリリットル/時の一定流量でシリンジポンプを使用して、すぐに運動セッションの後、マウスを灌流。 </li><li>灌流後、針を除去し、関心の組織（ 例えば脳 11と骨格筋）を収集。骨格筋の場合は、外側広筋を解剖。簡単に言えば、筋肉を露出させる12の大腿四頭筋をローカライズし、大腿骨の上部に接続された外部の筋肉である外側広筋を、ばらばらにするために、後方の脚の皮膚を引っ張ります。 </li><li>さらに固定および脱水のために、4℃で24時間、4％PFA中でGFP-LC3マウスの組織を配置し、その後15％に転送4℃でのスクロース-PBSで一晩または組織が安定するまで、その後、一晩4℃で30％のスクロース-PBSまたは長期保存のために。彼らは強い光に敏感であり得るとして、できるだけ多くの暗所でサンプルを保管してください。 </li><li>ウェスタンブロット分析のために液体窒素中で直接、C57BL / 6マウスからの組織を凍結し、-80℃で保管しスナップ。 </li></ol> GFP-LC3涙点の5イメージング解析<ol><li> 組織のプロセス <ol><li>そのような標識された小さなペトリ皿で数分間の「最適切削温度化合物」（10月）などの媒体を埋め込んで組織（以前はPFAで固定し、30％スクロース中に保存されている）を事前扱います。 </li><li>組織をカバーするのに十分な新鮮な10月を含む標識cryomoldに組織を転送します。オリエントcryomold（外側広筋の筋と半脳のための矢状断面のための断面）の底部に向かってセクショニング面。泡の形成を避けます。 </li><li> FRE10月が白くなるまで、ドライアイスで満たされた屋根付きの発泡クーラーで数分間cryomoldを配置することによって、サンプルをEZE。 、標識された箔で個々のサンプルを包むビニール袋にそれらを密封し、-80℃で一晩以上保管してください。 </li><li> 10μmの厚さでサンプルのセクションを切断し、スライド上のセクションをマウントするクライオスタットを使用してください。 -20℃でスライドを保存し、常に可能な限り光から離れてスライドを保ちます。 </li></ol></li><li> スライドの準備 <ol><li>冷凍庫からスライドを外し、室温でそれらを解凍。 DAPIでメディアのマウントの低下と組織切片をカバーしています。上に適切なサイズのカバーガラスを置き、気泡形成を回避します。 </li><li> 、カバーガラスの縁をシールマニキュアは、暗所で室温で乾燥させ、その後、4℃で光を通さない容器にスライドを保存する、またはGFP-LC3の涙点の撮像キャプチャを続行するためにマニキュアを使用してください。 </li></ol></li><li> &lt;GFPの強い&gt;定量 - 蛍光顕微鏡によるLC3の斑点<ol><li>すべてのサンプルについて同じ条件（露出と設定）で画像をキャプチャ、落射蛍光顕微鏡を実行します。 GFPは、525nmでの発光波長を使用します。 DAPIのために、490nmのを使用しています。外側広筋のための60X目的と脳の前頭皮質領域を用いて、サンプルあたり少なくとも10の画像を取得します。 </li><li>実験群のために盲目に統計分析のために各画像中の2500 平方 μmの組織領域にGFP-LC3の斑点の数を定量化します。 &quot;オブジェクト数&quot;の自動測定機能を用いて、各サンプルの10枚の平均値を計算します。外側広筋の筋肉の設定は次のとおりです。しきい値L = 10、H = 200; 2Xはスムーズ。 1Xきれいな、と脳の前頭皮質の設定は、次のとおりです。しきい値L = 11、H = 200; 2Xはスムーズ。 1Xきれい。 </li></ol></li></ol>オートファジーマーカー6.ウェスタンブロット分析<ol><li> &lt;強い&gt;組織プロセス<ol><li>溶解バッファー準備：50 mMトリス - 塩酸; 150mMのNaCl; 1 mMのEDTA; 1％トリトンX-100。プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（新たに追加されました）。 </li><li> Cストレージ-80℃からC57BL / 6マウスの組織を削除します。次の工程の前にカミソリの刃で小片に筋肉組織をカット。サンプルに冷溶解緩衝液（外側広筋の場合）（ヘミ脳用）800μlあるいは500μl添加します。中程度の速度でホモジナイザーを用いて4℃でサンプルをホモジナイズします。 </li><li>完全に回転させながら4℃で1時間にさらに30分間均質化混合物を溶解します。 </li><li> 、4℃で10分間12,000×gでホモジネートをスピンダウンし、ペレットを廃棄し、新しいチューブに上清を収集します。 </li></ol></li><li> オートファジー分析 <ol><li>製造業者の仕様書に従ってBCAタンパク質アッセイキットを使用して、組織溶解物のタンパク質濃度を決定します。各サンプルを正規化同じ濃度に。 </li><li> 、1比5 95℃でそれを沸騰- 10分、ならびにP62（抗P62抗体としてオートファジーマーカー13、14、上のウェスタンブロット分析を続行：1で2×Laemmliサンプル緩衝液で試料を結合1：500希釈）およびLC3（抗LC3抗体、1：500希釈）。氷の上でより長いインキュベーションは、LC3の複数の劣化バンドを生成することができるように、すぐにサンプル緩衝液を添加した後、サンプルを沸騰させます。 </li><li> ImageJのを使用してデンシトメトリー分析によってP62とLC3のバンドを定量化し、対応するアクチンバンドに値を正規化します。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).</li>
<li>Tracy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BNIP3+is+an+RB%2FE2F+target+gene+required+for+hypoxia-induced+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy.</a> Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).</li>
<li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+renovation+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li>
<li>Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+the+physiology+and+pathology+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system.</a> Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).</li>
<li>Rocchi, A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+autophagy+in+metabolism+and+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+biology%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders.</a> Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).</li>
<li>Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cancer.</a> Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).</li>
<li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+BCL2-regulated+autophagy+is+required+for+muscle+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis.</a> Nature. 481, 511-515 (2012).</li>
<li>He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+induces+autophagy+in+peripheral+tissues+and+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain.</a> Autophagy. 8, 4(2012).</li>
<li>Kuramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+activation+by+novel+inducers+prevents+BECN2-mediated+drug+tolerance+to+cannabinoids%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids.</a> Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).</li>
<li>Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Treadmill+Fatigue+Test%3A+A+Simple%2C+High-throughput+Assay+of+Fatigue-like+Behavior+for+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse.</a> JoVE. , (2016).</li>
<li>Navone, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+and+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells.</a> Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li>
<li>Bjørkøy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687908036124">Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1.</a> Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%283rd+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12, 1-222 (2016).</li>
<li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+the+Pathogenesis+of+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy in the Pathogenesis of Disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+rapamycin+treatment+has+differential+effects+on+metabolism+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice.</a> Cell Metab. 17, 456-462 (2013).</li>
<li>Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+functions+of+mTOR+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory functions of mTOR inhibition.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).</li>
<li>Miller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin-mediated+lifespan+increase+in+mice+is+dose+and+sex+dependent+and+metabolically+distinct+from+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction.</a> Aging Cell. 13, 10(2014).</li>
<li>Grumati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+exercise+stimulates+autophagy+in+normal+skeletal+muscles+but+is+detrimental+for+collagen+VI-deficient+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles.</a> Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).</li>
<li>Lira, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+required+for+exercise+training-induced+skeletal+muscle+adaptation+and+improvement+of+physical+performance%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal+%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).</li>
<li>Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25483961">Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity.</a> Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).</li>
<li>Kregel, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.the-aps.org/mm/SciencePolicy/AnimalResearch/Publications/Animal-Exercise-Protocols">Resource book for the design of animal exercise protocols.</a> American Physiological Society. , 152(2006).</li>
<li>Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11740298">Interstrain variation in murine aerobic capacity.</a> Med Sci Sports Exerc. 33, 5(2001).</li>
<li>Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximal+metabolic+rates+during+voluntary+exercise%2C+forced+exercise%2C+and+cold+exposure+in+house+mice+selectively+bred+for+high+wheel-running%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+biology%22%5BJournal%5D)">Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running.</a> The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).</li>
<li>Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sprint+exercise+on+oxidative+stress+in+skeletal+muscle+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver.</a> European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).</li>
<li>Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high-intensity+intermittent+swimming+on+glucose+transport+in+rat+epitrochlearis+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle.</a> J Appl Physiol. 84, 4(1998).</li>
<li>Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+submaximal+oxygen+consumption+during+treadmill+running+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice.</a> Can J Physiol Pharmacol. 71, 4(1993).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

オートファジーは、エネルギーを提供し、細胞質成分または損傷した細胞小器官のリソソーム分解により細胞毒性を減少させる異化プロセスです。オートファジーの研究は細胞の恒常性の調節およびストレス応答のメカニズムを理解することが重要です。新モデルと方法論は、多くの病理学的プロセス16、17にどのように寄与するかを損なわオートファジー研究し、研究分野15で浮上しています。 栄養欠乏（飢餓）および薬理学的誘導は、一般的に、インビトロおよびインビボでオートファジーを誘導するための方法を使用しています。特に、動物モデルのためのこれらの方法は、全体的な結果に影響を与え得る悪影響を示すことができます。それは飢餓の少なくとも48時間を必要とするため、例えば、オートファジーの検出可能なレベルを誘導するために、動物は、エネルギーは、通常の運動活動、のために必要としていない可能性があります多くの...

オートファジーは、飢餓および低酸素1,2のような種々のストレス条件に応答して誘導される進化的に保存された分解経路です。オートファジーの間、オートファゴソームと呼ばれる二重膜小胞は、不要なまたは損傷した細胞内のコンポーネントを組み込み、劣化3のためのリソソームにそれらを運びます。基底オートファジーは、細胞機能および生物の開発のために不可欠であり、障害のある基底オートファジーは神経変性、腫瘍形成および2型糖尿病4、5、6を含む多くの疾患に関与しています。 最もよく知られている生理的オートファジー誘導因子が飢餓です。しかし、それは、2つの主要な制限を有します。まず、飢餓は、 例えば 、効果的動物でオートファジーを誘導するために、マウスにおける食物制限の48時間を長い期間を要しますほとんどの臓器インチ第二に、飢餓はほとんど脳内で比較的安定した栄養供給に起因する脳のオートファジーを誘導します。実際には、多くの薬物は、血液脳関門を通過できないように、小分子誘導物質によってオートファジーの誘導を検出することも困難です。このように、より良い疾患の病因におけるオートファジーの活性化の機能を分析するために、我々は最近、運動は時間7、8、9の短い期間でオートファジーを誘導するために、より強力な生理的な方法であることを発見しました。飢餓と比較して、オートファジーを効果的に30分ほど速く実行トレッドミルによって誘導されます。このように、運動は健康上の利点を仲介し、疾患の予防にオートファジーのメカニズムを研究するための便利で強力な生理的なアプローチです。 LC3およびP62を含むオートファジー活性の検出のためのいくつかのタンパク質マーカーがあります。 LC3（微小管結合タンパク質1A / 1B-光Cヘイン3）は、オートファジーの誘導時にPE（ホスファチジルエタノールアミン）に結合しているサイトゾルタンパク質（LC3-I型）です。 PE脂質化LC3（LC3-II型）は、オートファゴソーム膜に動員され、GFPで標識したときオートファゴソームを可視化するために使用することができます。顕微鏡下でオートファゴソームの構造を点状にする細胞質ゾルからの転座は、オートファジー誘導の指標です。 P62は、（例えば、ユビキチン化タンパク質など）オートファジー基板のカーゴ受容体であり、同様にオートファゴソームに組み込まれます。タンパク質は、オートファゴソームとともにリソソームで分解されるので、そのレベルは、オートファジーフラックスを測定するために使用することができます。ここでは、強制運動（トレッドミル）と自発運動（車輪を実行している）などの有酸素運動によって誘発される異なるマウス組織でオートファジーを定量化するために、これらのマーカーを使用する方法を示しています。同じ手順は、他の誘導物質を処理した後、オートファジーのインビボ測定に適用することができます。

<table><tbody><tr><td>トレッドミル</td><td>コロンバスインスツルメンツ</td><td>150-RM エクサー 3/6</td><td></td></tr><tr><td>マウスランニングホイール</td><td>スーパーペット</td><td>100079365</td><td>径 11.4cm</td></tr><tr><td>走行距離計</td><td>ベル</td><td>ダッシュボード 100</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>KD サイエンティフィック</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>モデル:倒立顕微鏡 ECLIPSE</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>CM 1850UV</td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザー</td><td>IKA</td><td>003737001 / モデル: T10 ベーシック S1</td><td></td></tr><tr><td>クロロキン</td><td>ケイマン ケミカル カンパニー</td><td>14194</td><td></td></tr><tr><td>パラフォルマルデハイ</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P6148</td><td>個人用保護具が必要です。本製品は、がんの原因となることが知られている化学物質であるホルムアルデヒドガスを放出することがあります。</td></tr><tr><td>封入剤</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>p62 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610833</td><td></td></tr><tr><td>LC3 antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスで有酸素運動によってオートファジーのアクティブ化

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

>jove_content<オートファジーは、細胞の恒常性、機能、分化に不可欠なリソソーム分解経路です。ストレス条件下では、オートファジーが誘導され、バルクサイトゾル、損傷したオルガネラ、誤って折りたたまれたタンパク質などのさまざまなカーゴを標的にして、リソソームの分解を行います。得られた栄養素分子は、新しいタンパク質合成とATP産生のために細胞質にリサイクルされます。オートファジーのアップレギュレーションは、多くの疾患の病因に対して有益な効果をもたらし、オートファジーを活性化するための薬理学的および生理学的戦略が報告されています。有酸素運動は、最近、筋肉、肝臓、心臓、脳など、マウスの複数の臓器で効率的なオートファジー誘導物質として同定されています。ここでは、強制的なトレッドミル運動または自発的なホイールランニングのいずれかによってin vivoでオートファジーを誘導する手順を示します。また、オートファゴソームとともにリソソームに輸送され分解されるマーカータンパク質LC3およびp62を用いて、マウス組織のオートファジーレベルを定量的に解析する顕微鏡的および生化学的手法を実証しています。

このプロトコルは、有酸素運動によるマウス組織におけるオートファジーを誘導するために2つの異なる方法を説明します。順化の2日間進めマルチレーントレッドミル上の強制運動の90分の合計。またはシングル収容されたマウスで使用される走行輪に自発運動の2週間。各運動プロトコルでは、我々は、蛍光顕微鏡および様々な臓器におけるウェスタンブロット分析によってオートファジーフラックスを測定することができます。 私たちは運動1によりオートファジーを監視するためのレポーター系としてGFPタグLC3を発現するトランスジェニックマウスラインを使用しました。オートファジー誘導の際に、LC3は、点状の構造でオートファゴソームに細胞質ゾルから移動します。切片化後、GFP-LC3の斑点の形成が、直接蛍光顕微鏡（ 図1A）によって可視化することができます。また、オートファゴソーム構造はまたのためのLC3抗体に...

オートファジーの活性化は、多くの疾患の予防に有益です。 生体内でオートファジーを誘導する生理的なアプローチの一つは、物理的な運動です。ここでは、有酸素運動によってオートファジーを活性化し、マウスにおけるオートファジーのレベルを測定する方法を示しています。

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

この実験の全体的な目的は、強制走行または自発走行によってマウスのオートファジーを生理的に活性化し、特定の組織におけるオートファジーレベルを測定することです。この手法は、オートファジーに関する重要な疑問、特にオートファジーと身体活動が有酸素運動による有益な効果にどのように寄与しているかという問いへの回答に役立ちます。この手法の主な利点は、身体運動がマウスを用いたin vivoでのオートファジーを誘導する迅速な有酸素的手段となることです。本実験では、生体内での運動誘発性オートファジーを検出するためのトランス遺伝子（GFP-LC3）を保持する、生後8〜12週のC57BL/6マウスを使用します。マウス用トレッドミルの使用方法の詳細については、以下のJoVE論文を参照してください。トレッドミルの電気刺激は低強度に設定します。最初の2回のセッションで、マウスを傾斜10度のオープンランニングマシンに慣らします。1日目は、ランニングマシンを8 meters per minuteで動作させ、マウスを5分間運動させます。2日目は、最初は8 meters per minuteで、5分後に速度を10 meters per minuteまで上げ、合計10分間走らせます。3日目には、マウスを90分間全力で走らせます。トレッドミルの速度を分速10メートルで開始し、足への電気ショックが繰り返されないよう、軽く背中を押すなどしてマウスに走るよう促してください。90分間の走行中に、マウスが過度な電気ショックを受けないよう、注意深く観察し、適切に誘導することが極めて重要です。走行中は、指を使ってマウスがトレッドミルの上に留まるように促してください。40分後、速度を1 m/min上げます。50分後、さらに速度を1 m/min上げます。60分後、速度をさらに 1 meter per minute 上げます。70分後から5分ごとに速度を上げ、90分間の走行の最後の5分間が 17 meters per minute になるように調整します。試験終了後、必要に応じて組織回収のためにマウスを直ちに安楽死させます。この試験では、マウスを個別に飼育します。系統は前述のものを使用してください。自転車用走行距離計を取り付けた直径11.4 centimeterのマウス用ランニングホイールを用意します。1回転につき358 millimetersの走行距離となるように設定します。マウスをホイールの入ったケージに入れ、2週間自由に走行させます。24時間ごとに、オドメーターからマウスの走行距離を記録してください。2週間後、必要に応じて解析用の組織を採取します。オートファジーフラックスを測定するため、オートファジー阻害剤であるクロロキンを3日間マウスに投与します。クロロキンをPBSに溶解して5 mg/mLとし、50 µg/gの

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ショックグリッドを使用せずに実験用マウスの運動持久力を評価する方法が示されています。この方法は、実験パラメータに対するストレスの交絡効果を減らすことができる人道的な改良です。...

ショックグリッドを使用することなく、マウスの運動持久力の評価：強制運動への代替

アクティブなオートファジーは、筋肉幹細胞（MuSC）の活性化に不可欠な、筋肉の再生を促進します。ここでは、コントロールマウスおよび損傷マウスからの筋組織切片のMyoD陽性MuSCにおける自食作用マーカーであるLC3のin situ検出のためのプロトコールを提供する。...

筋幹細胞におけるオートファジーのin situ Immunofluorescent Staining

低酸素状態で高強度のトレーニングは、誘発血管適応可能性のある一部の患者に有益であるし、選手を改善する繰り返しスプリント能力が証明されているプロトコルです。ここでは、我々 は、プロトコルし、ex vivo...

激低酸素運動とマウスの血管機能評価

ショート セッション (≤10 分) 高強度インターバル トレーニング (HIIT) 長く運動療法に代わるものとして浮上しているけれどもより短いバリアントは、ほとんど動物実験でモデル化します。ここでは、3 日、週、上り坂トレッドミル HIIT プロトコル男性は身体能力を強化し、女性高齢マウス 10 分を述べる.

短いセッション高強度インターバル トレーニングと高齢マウスにおけるトレッドミルの評価

この手順では、マウスにおける平行移動可能なプログレッシブロードランニングホイール抵抗トレーニングモデルについて説明します。このレジスタンストレーニングモデルの主な利点は、それが完全に自発的であるため、動物のストレスと研究者の負担を軽減することです。...

マウスの漸進的レジスタンストレーニングのためのシンプルで安価なランニングホイールモデル

本プロトコルは、ショ ウジョウバエメラノガスター 幼虫の脂肪体における栄養素の枯渇 による...

ショウジョウバエメラノガスター幼虫脂肪体における飢餓誘発オートファジーの解析

この論文では、食事誘発性肥満のSprague-Dawleyラットモデルにおける高強度インターバルトレーニング(HIIT)プロトコルの形態測定応答とトレーニングパフォーマンスの結果を紹介します。このプロトコルの目的は、運動強度を最大化し、痩せたラットと肥満のラットにおけるHIITに対する生理学的反応を決定することでした。...

ラットの運動努力を最大化し、生理学的変化を誘発するための慢性高強度インターバルトレーニングと食事誘発性肥満モデル

このプロトコルは、マウス用の静的トレーニング機器を作成する簡単な方法を提供します。本装置は、マウスの四肢の筋等尺性収縮を維持することで、従来の運動による2型糖尿病(T2DM)への介入効果を検証し、2型糖尿病の臨床治療に新たな運動療法を提供します。...

2型糖尿病マウスに対する静的筋力トレーニング法

このビデオでは、好気性菌によるリグノセルロース植物組織の劣化を研究するために制御された環境のアプローチを示しています。栄養源と水分を制御する能力は、寒天ブロックの小宇宙の主な利点ですが、アプローチは、しばしば混合成功をもたらします。我々は、再現性、低ばらつきの結果を得るために重要な落とし穴に対処する。...

好気性菌による制御植物組織の分解のための寒天ブロックの小宇宙

このプロトコルは、運動やスポーツ科学に焦点を​​当てた研究者が演習の多種多様な中に総エネルギー消費量には3つの異なるエネルギーシステムの相対的な寄与を決定することができます。...

運動時のエネルギーシステムの貢献を決定する

学ぶ マウスを用いた有酸素運動によるオートファジー活性化の手法。GFP-LC3トランスジェンを使い、特定組織でのオートファジー誘導を測定し、運動の生理学的効果を解明する。

マウスで有酸素運動によってオートファジーのアクティブ化

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