Name: 血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学ぶ画像誘導レーザーによるPEGDAヒドロゲル内の三次元血管由来バイオミメティック微小流体ネットワークの作製法。組織工学や疾患モデリング、オンチップデバイス開発に応用可能です。

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著者は、共焦点顕微鏡法による支援に対して、デラウェアバイオテクノロジー研究所バイオイメージングセンターのジェフ・カプラン博士とマイケル・ムーア氏に感謝します。顕微鏡機器へのアクセスは、国立衛生研究所(NIH)の共有機器助成金(S10 RR0272773およびS10 OD016361)およびデラウェア州連邦研究開発助成金プログラム(16A00471)によってサポートされました。この研究は、NIH国立総合医科学研究所(P20GM103446)、米国がん協会(14-251-07-IRG)、デラウェア大学研究財団(14A00778)、テキサス州がん予防研究所(CPRIT)(RR140013)、およびNIH国立医学図書館(4 R00 LM011390-02)からのInstitutional Development Award(IDeA)からの助成金によって支援されました。

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著者らは開示するものは何もない。

画像誘導、レーザーベースの分解のための仮想マスクの使用を可能にするために、顕微鏡ソフトウェアの標準機能をオーバーライドする上で重要な、顕微鏡マクロが設定し、慎重に操作しなければなりません。どのように顕微鏡マクロで顕微鏡のソフトウェアインタフェースは時々直感に反することができ、多くの努力が、この方法を開発するために、両方のプログラムで最適な設定を決定する際に投資されました。基本的なレーザー走査型共焦点顕微鏡の使用の一般的な理解は、特に「ステージ」と発見し、正しくレーザーベースの分解を試みる前に、x、y、zの次元でヒドロゲルを位置決めするための「フォーカス」ウィンドウで、お勧めします。また、入口流路の作製は、プロトコルに重要です。中断蛍光種は、成功したイメージングおよびネットワークの特性評価のためのマイクロ流体システムを入力することができなければなりません。このプロトコルは、特定のに適用されることに留意することが重要であり、レーザー -顕微鏡ソフトウェアおよび顕微鏡マクロの特定のバージョンを実行している特定のフェムト秒パルスレーザーを用いて構成された走査型共焦点顕微鏡、（特定の材料/機器のリストの詳細を参照してください）。私たちは顕微鏡マクロの新しいバージョンは、画像誘導レーザ制御のために必要な必要な制御と機能性を欠いていることを発見しました。他の顕微鏡プラットフォームとパルスレーザ光源を用いることができるが、このプロトコルは、このシステムに特に適用され、プラットフォーム、レーザ源、およびソフトウェア実装に応じて変更が必要となります。このプロトコルを通して、基本的な原理はまだただし、適用されます。 このプロトコルへの潜在的な変更は、ハイドロゲル組成物を変化させることを含みます。ここで、我々は（脇マイクロ流体ネットワークの世代からの目的のために）5重量％、3.4 kDaのPEGDAヒドロゲルが、レーザーベースの分解を利用すると、PEG化フィブリンを含む合成および天然ヒドロゲル、両方を分解するために実装されました21,22フィブリノゲン、絹タンパク質ヒドロゲル23、及びコラーゲン24。レーザーパワー、走査速度、Zスライス間の間隔、及び繰り返し回数の調整は、他のヒドロゲル製剤に微小流体ネットワークを製造するために最適なパラメータを決定するのに役立つであろう。 技術の一つ電流制限は、時間の実現可能な量に分解することができるヒドロゲルの全体のボリュームです。 37.7 NJ /μm2でのレーザフルエンスを使用した場合、ヒドロゲル内にオープンボイドやマイクロ流体の特徴を作成するには、レーザー滞留時間は8.96マイクロ秒/ピクセル（または0.021ミクロン/μsでのレーザスキャン速度）で、またはより上でなければなりません。 （ 図1に見られるように）これらの設定では、0.014 mm 3でボリューム内の血管を分解するために1.4時間がかかります。下記の4.48マイクロ秒/ピクセルまたはのレーザー滞留時間を用いて、供給されるエネルギーは、ここで使用されるヒドロゲル製剤の完全分解に十分ではありません。異なるヒドロゲルの実装組成物は、この制限を克服することができます。光に敏感なコンポーネント34-36または大規模な多断面21-24を持つハイドロゲルが含まれている光不安定性ゲルの使用は、より少ないエネルギーの利用を可能にし、より高速な劣化につながる良いオプションです。次元の制限に関しては、特徴は、ヒドロゲル7の深い1.5ミリメートルまでに製造されています。深度達成は、対物レンズの作動距離の関数であり、in vivoイメージングのための最適化された超長作動距離対物レンズを使用して増大させることができます。最小の測定チャンネル7は、20X（NA1.0）水浸対物レンズは、 図1に発生した最小のチャンネルのサイズと同等の8.9ミクロンの3.3ミクロンの幅と深さを持っていた使用して作成しました。他のラボが低いNA対物レンズ21,23,24を使用しているが、我々はより小さな機能を備えたマイクロ流体ネットワークが高く使用して作製することができることを期待します縮小作動距離を犠牲にしてER NA対物レンズ。最終的に、しかし、技術の分解能は、集束レーザービーム、レーザ走査特性、レーザによって供給されるエネルギーの量の点広がり関数の関数であり、材料のレーザ吸収特性が劣化します。 また、レーザ特性が（速度、フルエンス、仮想のマスクとの間の間隔、及び繰り返し数）は、ヒドロゲル特性（架橋密度、マクロマー/モノマーの分子量、重量パーセント、及びヒドロゲルの種類に基づいて最適化されなければならない：合成対タンパク質ベース）、これらのように本質的にレーザー、したがって、プロセスの最終的な解決との相互作用が変更されます。供給されるエネルギーも使用目的によって影響されるように目標を切り替えたとき、追加の最適化が必要です。関連する費用に対して、パルスレーザと顕微鏡へのアクセスが要求され、多くの異なるOBJEC一方ティブは、高いNAおよび（in vivoイメージングのための）長い作動距離を有するものは高価であり、使用することができます。 上記およびここに詳述したプロトコルを越えて、この技術を用いて生成されたマイクロ流体ネットワークはまた、内皮細胞の接着および管腔形成7を誘導するために細胞接着性ペプチドポストチャネル加工で官能化することができます。また、劣化したチャネルに先立ってバルク材料9のセル分解性ペプチド配列の組み込みは、ヒドロゲルへと貫通細胞遊走の研究のために可能性があります。 図2及び図 3~7に示されているように、ヒドロゲル内の微小流体ネットワークの連続的な流動化のために、ヒドロゲルは、より大きな流体装置又はハウジング内に光重合することができます。 血管性または血管新生自己集合8-12を介した血管網の発生がVAを誘導するために直接的なアプローチを提供します比較的大きなヒドロゲルボリューム全体にscularization。このアプローチは、灌流流体ネットワークをもたらすが、直接サイズ、ねじれ、密度、および全体的なネットワークアーキテクチャを制御することは困難です。この制限により、血管系における流れプロファイルとせん断速度は、実験間で異なる場合があります。また、微細加工技術13-16は、ネットワーク・アーキテクチャを直接制御を可能にするが、多くの場合、小さな、キャピラリーサイズのチャネルまたはin vivoでの血管のアーキテクチャで模倣密なネットワークの製造を生成することができないことによって制限されています。ここで説明レーザーベースのヒドロゲルの分解技術は、新たにマイクロ流体生成のために再利用されてきたが、それは同時に、密度、ねじれを再現3次元生体模倣マイクロ流体ネットワークの作成を可能にすることによって建築制御、既存の微細加工法の大きさに基づく制限の両方を克服しますサイズ範囲、および全体的なarchitecturin vivoでの血管系の電子。さらに、複数の流体ネットワークは、ネットワーク間のトランスポート7の研究を可能にする、単一のヒドロゲルで生成することができます。より密接にin vitroでの 生体内輸送過程の中で複製するように努めています組織工学アプリケーションでは、ここで概説高分解能ハイドロゲル包埋マイクロ流体ネットワークは非常に適しています。我々は、このプロトコルは、薬物スクリーニング装置として使用するためおよびインビトロ疾患モデルにおいて、より正確に模倣する組織構築物のインビボ輸送の開発に有用であろうことを予想しています。

リンパ管および心臓血管の両方からなる血管系、フォーム栄養と酸素の輸送および代謝老廃物の除去のために不可欠である高密度のネットワークを。したがって、血管新生した組織に存在する細胞は、以上の50から100ミクロン離れて容器1からなることはありません。 in vitroで の生体内の血管構造を再現する能力は、正確に操作された構築物を用いてin vivoでの輸送過程をモデル化することが重要です。 3,4および疾患モデル5,6をハイスループットスクリーニングの薬剤のための臓器・オン・チップデバイス2を開発するための最近のドライブでは、この方法は、描画された合成または天然ヒドロゲルにおけるin vivo様の輸送を再現マイクロ流体ネットワークを作成します大きな関心。これらのデバイスで使用される微細組織のバイオミミクリーを強化するために、我々は、三dimensionaを用いる画像誘導レーザベースのヒドロゲルの分解法を開発しましたL（3D）天然の血管系の画像スタックをテンプレートはPEGDAヒドロゲル7に埋め込まれた血管由来微小流体ネットワークを生成します。このプロトコルは、画像誘導、レーザーベースの劣化を経てPEGDAヒドロゲルにおける血管由来、生体模倣マイクロ流体ネットワークを製造するフェムト秒パルスレーザーを搭載した市販のレーザー走査型共焦点顕微鏡の使用を概説します。 ヒドロゲルを流動化するための現在のアプローチは、内皮13-16用の事前定義されたチャネルを作成するには8-10脈管や血管新生10-12内皮細胞の自己組織化と微細加工技術の誘導が含まれます。自己組織化ネットワークは、微小血管の密度と複雑なアーキテクチャを再現しながら、彼らはしばしば、薬剤スクリーニングアプリケーションのためのモデリング輸送に問題となる可能性がin vivoでのネットワーク11,17,18、より透過性です。自己組織化ネットワークはphysiologから成り的には、関連する毛細血管サイズの船が、それらは、より大きな細動脈サイズの血管を生成する際の制限のために、バルク流体の流れとの統合が困難な場合があります。これらのネットワークの集合体の上に直接制御がないため、最終的なアーキテクチャは、繰り返し同じ流体の流れおよび輸送特性とのネットワークを生成することが困難になる、サンプル間で変化し得ます。 3D、反復ジオメトリと明確に定義されたアーキテクチャを有するヒドロゲル埋め込み微小流体ネットワークを生成するために、微細加工技術の数は、モジュールアセンブリ13、犠牲材料16、ダイレクトライトアセンブリ14と、全方位印刷15の3Dプリントなど、開発されてきました。これらの方法は、微小流体アーキテクチャ、したがって流体の流れと輸送特性を適用し、繰り返し多くの構築物を横切って製造することができます。これらのアプローチの主要な制限は、しかしながら、作成することができないことであるmicrof毛管サイズの特徴、4〜10μmの19とluidicネットワーク。ほとんどの微細加工技術は、多くの場合、直径13,16に150から650ミクロンまでの範囲の特徴に限定されています。いくつかの既存の技術には、直接書き込みアセンブリ14のために10〜300μmで、広い直径範囲にわたってチャンネルを階層的ネットワークを生成することが可能であり、かつ全方位印刷15 18へ600μmのは、それらは、密なネットワークまたはを生成する能力が制限されています単一の構築物7内に近接した複数のマイクロ流体ネットワークを生成します。 これらの制限のいくつかを克服するために、我々は、生体模倣の反復可能な製造を可能にする画像誘導、レーザーベースのヒドロゲル分解技術、in vivoでの微小血管系のアーキテクチャを再現階層型マイクロ流体ネットワークを開発しました。これを行うには、80 MHzで動作する790 nmで、140フェムト秒（fs）は、パルスレーザは、ラスタスキャンiはin vivoでの血管系の画像で定義されたように、n、ヒドロゲル内の3D位置を希望します。私たちは、水が20を拡張したように、分解プロセスは、水のレーザ誘起光学破壊、結果として得られるプラズマ形成、水のその後の急速な熱弾性膨張、およびヒドロゲルの局所的劣化を介して動作することを推測しています。この機構は、タンパク質ベースのヒドロゲル21-24のレーザーベースの分解から若干異なります。低多断面を有するPEGDAとは異なり、タンパク質は、しばしば大規模な多断面を有し、したがって、多光子吸収によって誘起される化学破断23を介して分解されます。画像誘導微小流体ネットワークを生成するために、レーザシャッタは、微小流体アーキテクチャを定義する関心9の領域のモザイクから成り画像誘導仮想マスクによって制御されます。このアプローチを用いて、3D血管由来のバイオミメティックマイクロ流体を製造する能力が実証されています局所的に分解中に送達されるエネルギーの量を変化させることによりヒドロゲルの多孔性を制御するために、 インビボでの脈管構造の緻密で蛇行アーキテクチャを再現ICネットワーク。また、近接（15ミクロン）に絡み合う二つの独立したマイクロ流体ネットワークを生成することができたが、直接7を接続したことがありません。我々はまた、内皮細胞の接着および管腔形成7を促進するために、インテグリン連結ペプチド配列、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸-セリン（RGDS）でポスト分解官能を通じてレーザー分解マイクロチャンネルを内皮化する能力を実証しました。 このプロトコルでは、PEGDAヒドロゲルにおける複雑なマイクロ流体ネットワークの世代は、多くの大学のキャンパスでアクセス可能な市販の顕微鏡を用いて画像誘導、レーザーベースの分解を経由して可能となります。分解プロセスは、デジタル、仮想マスクによって案内されるように、このファブリカション技術は、多種多様な用途での使用を可能にする、マイクロ流体ネットワークの創造的なデザインのために適しています。私たちは、ここで説明する方法は、バイオミメティック器官とモデリングの薬物輸送2における重要な生物学的輸送プロセスを複製することができる人間のオンチップデバイスを設計する際に最も有利になることを期待しています。この製造技術はまた、癌転移5,6及び血液脳関門モデル25を含む、 インビトロでの疾患モデルの生成のために関心のものであってもよいです。レーザーベースのヒドロゲルの分解は、以前に神経突起伸長21-23の誘導のためのトラックを作成するために使用されているように、この技術の画像誘導延長は、ユーザー定義の3D空間配置内のセルを配置するために、高度な組織工学戦略において有用であることが証明できました。

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2015a</td><td>はプロトコルで "programming software" と名付けられました。アルゴリズムの詳細については出典 9 を参照してください</td></tr><tr><td>FIJI (Fiji is Just Image J)NIH</td><td></td> <td>version 1.51a</td><td>named "image processing software" in protocols</td></tr><tr><td>LSM 780 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogelプロ</td></tr><tr><td>トコールで「顕微鏡ソフトウェア」と名付け</td>られた<td>Zen 2010B SP1</td><td>Zeiss</td><td>リリース バージョン 6.0</td> で使用、プロトコルで「顕微鏡マクロ」と名付けられた Zeiss</tr><tr>LSM-780 で使用、プロトコールで "microscope macro" と名付けられた<td>2010</td><td>Zeiss</td><td>v16.0</td> で使用<td>、ツァイス LSM-780 で使用 (Zen との組み合わせ)</td></tr><tr><td>Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm</td><td>Zeiss</td><td>421452-9880-000</td><td>で</td>使用</tr><tr><td>カメレオンビジョンIIモードロックTi:Sレーザー</td><td>コヒーレント</td><td></td><td>は、プロトコルで「高出力パルスレーザー」と名付けられました</td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>S5886-1KG</td><td></td></tr><tr><td>ヘープス</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>トリエタノールアミン(TEOA)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>90279-100ML</td><td>可燃性、皮膚と目の刺激性、ヒュームフードで作業</td></tr>ナトリウム<tr><td>水酸化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>150 mL真空ろ過カップ、0.2 &micro;社内で合成された PES 膜</td><td>VWR</td><td>10040-460</td><td></td></tr><tr><td>PEGDA</td><td></td><td>合成方法のソース33を参照してください; アルゴンの下に保存</td>エオシン Y 二ナトリウム塩 シグマ - アルドリッチ E6003-25G 1-ビニル-2-ピロリジノン (NVP) シグマ - アルドリッチ V3409-5G アルゴンの下に保存 ; 発がん性; ヒュームフード 3M ダブル コーティング テープ、9500PC、6.0 ミルで作業<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>トーマスGoldkamp</td><td>37728</td><td></td></tr><tr><td>Flexmark 90 PFWはさみ金</td><td>FLEXcon</td><td>FLX000620</td><td>二重コーティングテープモデル</td></tr><tr><td>SCプロッター(粘着カッター)</td>のハンドリングのための裏地 SCプロッター(粘着カッター)<td>USCutter</td><td>SC631E</td>は、<td>20</td></tr><tr><td>ミリメートルの穴MatTek</td><td>株式会社</td><td>P60-20-F-NON</td><td></td></tr><tr><td>高輝度イルミネーター(白色光源)</td><td>Fiber-Lite</td><td>4715MS-12WB10</td><td></td></tr><tr><td>パワーメーター</td><td>ニューポート</td><td>1916-R</td><td>白色光源使用時 524nmでパワーを検出</td></tr><tr><td>スリムプロファイルワンド検出器</td><td>ニューポート</td><td>918D-ST</td><td>パワーメーター用</td></tr><tr><td>シルガード 184 シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウ コーニング</td><td>3097358-1004</td><td>PDMS金型の製造に使用。方法についてはソース7を参照</td></tr><tr><td>TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round</td><td>syntheated in house</td><td></td><td></td></tr> は<tr><td>、デキストラン、フルオレセイン、2,000,000 MW、アニオン性、リジン固定可能な</td><td>ライフテクノロジー</td><td>D7137</td><td>は、代替のタグ付きデキストランを使用することができます。2,000 kDaは、5% 3.4 kDa PEGDA ハイドロゲル</td></tr><tr><td>1 mL シリンジ、Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr> <tr><td>に容易に拡散しません。Acrodiscシリングフィルター、0.2 &micro;m Supor Membrane, Low Protein Binding</td><td>Pall</td><td>PN 4602</td><td></td></tr><tr><td>スティッキースライド VI0.4&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>ハイドロゲルの収容に使用できるマイクロ流体デバイス</td></tr></tbody></table>

血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

この詳細なプロトコールは、PEGDAヒドロゲルに埋め込まれた血管由来のマイクロ流体ネットワークの製造のための画像誘導、レーザーベースのヒドロゲル分解の実装の概要を説明します。ここでは、画像誘導レーザ制御を可能にする仮想のマスクの作成について説明します。マイクロ流体ネットワークの製造及び圧力ヘッド駆動流に適したmicromolded PEGDAハイドロゲルの光重合;フェムト秒パルスのTiとペアになって、市販のレーザー走査型共焦点顕微鏡のセットアップと使用：ヒドロゲルの分解を誘導するSレーザー;蛍光種および共焦点顕微鏡を使用して製造、マイクロ流体ネットワークのイメージング。これらは複雑な数が含まれているマイクロ流体製造目的のための市販の顕微鏡を使用する際の重要なステップであるなどのプロトコルの多くは、顕微鏡ソフトウェアおよび顕微鏡マクロの適切な設定方法や実装に焦点を当てています。このtechniquの画像誘導成分eは、それによって創造的なマイクロ流体設計のため、事実上任意の構成の複雑なマイクロ流体システムの製造を可能にする、3D画像スタックまたはユーザーが生成した3Dモデルの実装を可能にします。組織工学における予想される影響で、このプロトコルで概説された方法は、臓器と人間のオンチップデバイスのための高度なバイオミメティックmicrotissue構築物の製造に役立つ可能性があります。 in vivoでの血管系の複雑なアーキテクチャ、屈曲度、サイズ、および密度を模倣することにより、本質的な生物学的輸送プロセスは、薬物動態及び疾患のより正確なin vitroでのモデリングにつながる、これらの構築物に複製することができます。

3D、血管由来のマイクロ流体ネットワークを生成するために、画像誘導、レーザーベースのヒドロゲル分解の実装を実証するために、我々は27、ナイフエッジの走査顕微鏡（KESM）26を介して取得されたマウスの脳血管系の3D画像スタックを利用しました。上記のように、より大きな微小血管データセットの選択された3次元領域が、画像誘導微小流体ネットワークを形成するための仮想のマスクのシリーズに変換しました。製造後、得られた微小流体ネットワークは、FITC標識、2000 kDaのデキストランの溶液で灌流し、共焦点顕微鏡を介して画像化しました。ネットワークアーキテクチャ（ 図1AおよびC）を定義して作製微小流体ネットワーク（ 図1BおよびD）は、Z-突起（ 図1AおよびB）と3Dレンダリングを生成するために使用されたインビボでの脈管構造（ 図1CのイメージスタックとD </strong&gt;）。画像の比較は、画像誘導、レーザーベースのヒドロゲル分解はサイズ、蛇行、およびin vivoでの血管系の複雑な構造を再現3Dバイオミメティックマイクロ流体ネットワークの製造を可能に示しています。技術は、直径の広い範囲を含むネットワークの製造に適しています。 図1内に、直径が3.3から28.8ミクロンの範囲のチャネルが生成しました。 図1Bの左上にあると、図1Dの左の隅に、より大きな長方形の構造がネットワークに流れを導入するための入口チャネルであることに注意してください。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig1.jpg" /> 図1：マイクロ流体ネットワークを血管由来。マウス脳血管系（AとC）の画像スタックから派生した仮想一連のマスクは、ファブリカに使用されました画像誘導、レーザーベースの劣化を経てPEGDAハイドロゲル（BおよびD）に埋め込まれたテ3Dバイオミメティックマイクロ流体ネットワーク。マイクロ流体ネットワークは、2000 kDaのFITC標識デキストランで灌流し、共焦点顕微鏡を経由して画像化しました。 Z-突起（A及びB）及び2つのネットワークの3Dレンダリング（C及びD）は密度、組織、およびインビボで脈管構造の全体的なアーキテクチャを再現微小流体ネットワークを生成する能力を示します。矢印（D）は 、デキストランを紹介するために作成した長方形の入口をマーク。スケールバーは50μmで表します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 我々は、流体Fを開始するために、二つの方法、圧力ヘッド、シリンジポンプを実装していますこれらの埋め込まれたマイクロ流体ネットワークにおける低いです。例えば、30〜30μmとすることにより、矩形チャンネルは圧力ヘッド7を介して駆動流体の流れで、micromolded PEGDAハイドロゲル（ 図2A）に2つの井戸を接続するために作製しました。マイクロチャネルを通って、右のウェルに流れを誘導された圧力水頭、よく左に生成されます。 図2A、テトラメチルローダミン（TRITC）の初期のフロントは標識では、70 kDaのデキストランは、タイムラプス顕微鏡を使用して、チャネルを通って移動が観察されました。その後、 図2（b）に、10μmの直径蛍光ポリスチレン球は、右のウェルに、チャネルを介して、よく左から流れました。入口でよくmicromolded内に存在する流体の体積によって制御された流れの持続時間、および入口との間に発生する静水圧勾配によって制御される流量ととよく出口、micromoldedヒドロゲル内の圧力ヘッド駆動流は、簡単な方法を提供し、流れのためにありますduction、外部ハウジングまたはシリンジポンプを必要としません。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig2.jpg" /> 図2：Micromolded PEGDAヒドロゲル中の圧力ヘッド駆動流。 PEGDAは、埋め込まれたマイクロチャネルによって接続された2つのウェルを含有するヒドロゲルを形成するmicromoldedました。圧力ヘッドは、1つのウェルから30μmで30による長方形のチャネルを介してTRITC標識、70 kDaのデキストラン（A1-A3）の流れと10μmのポリスチレン球（B1〜B3）を開始するためにも左で生成されましたその他。スケールバーは50μmで表します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 代替的に、マイクロ流体ネットワーク内で一定の流体の流れを生成するために、シリンジポンプ駆動F低は、シリンジポンプとのインタフェースのための入口および出口ポートと二マイクロ流体デバイスの内部にヒドロゲルを光重合することによって開始することができます。 図3Aに、市販の、予め製作マイクロ流体デバイスは、デバイス7の幅を横切って光重合ヒドロゲルの1 mmのバンドで示されています。レーザーベースの分解は、ヒドロゲル自立のために、ここで説明したのと同じプロトコルを使用して、収容されたヒドロゲル中のマイクロ流体チャネルとのネットワークを作製するために実装されました。シリンジポンプで生成流は、20ミクロンの直径の円筒形チャネルは、マイクロ流体デバイス内に収容されたヒドロゲルで作製された、図3Bに見ることができます。 5μL/ sの流量が印加されると、球は視野を移動に対しストリーキングによって証明されるように、この20ミクロンの直径のチャネルでは、個々の2ミクロン蛍光ポリスチレン球を容易に、流体流なし（ 図3B1）が解決されます（ 図3B2 &lt;/強いです&gt;）。この同じアプローチは、周囲のヒドロゲル（ 図3C）にネットワークおよび拡散を介しTRITC標識した、65kDaのデキストランの流れを監視するために、2D、血管由来のネットワークを介して流れを誘導するために使用しました。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig3.jpg" /> 図3：マイクロ流体ハウジング内PEGDAヒドロゲル重合中のシリンジポンプ駆動流。市販の、予め製作マイクロ流体装置（A）17×3.8のx 0.53ミリ（x、y、z）は、マイクロチャネルの家で示される光重合1×3.8のx 0.53ミリ（X、Y、Z）PEGDAヒドロゲルと黒い矢印。 20μmの直径の円筒形チャネルは、ヒドロゲルを介して分解された、および2ミクロンのポリスチレン球は、デバイス（B）を介してポンプ輸送しました。球は明らかに、流体の流れ（B1）せずに解決されていますが、5μL/ sの流量でスジとして表示されます（B2）。別の収容されたハイドロゲルでは、2Dの血管由来のネットワークを作製したとTRITC標識、65 kDaのデキストランは、ネットワーク（C）を介してポンピングしました。タイムラプス顕微鏡は、それがチャンネルを満たし、周囲のヒドロゲル中に拡散として蛍光デキストランをモニターするために使用しました。 （B）及び（C）の白矢印は流体の流れの方向を示しています。 （C）におけるキャリブレーションバーは、蛍光デキストランの強度を示します。スケールバーは、（B1）及び（B2）及び（C）が50μmで20ミクロンを表します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、ポリ(エチレングリコール)ジアクリレート(PEGDA)ハイドロゲルに埋め込まれた血管由来の生体模倣マイクロ流体ネットワークを製造するための、イメージ誘導レーザーベースのハイドロゲル分解の実装を概説しています。これらの生体模倣マイクロ流体システムは、組織工学アプリケーション、in vitro疾患モデルの作成、および高度な「オンチップ」デバイスの作製に役立つ可能性があります。

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

このプロトコルの全体的な目的は、フェムト秒パルスレーザーを備えた共焦点顕微鏡を使用し、画像誘導レーザー分解法を用いて、ポリエチレングリコールジアクリレートハイドロゲルに埋め込まれた血管由来の3次元バイオミメティック・マイクロ流体ネットワークを構築する方法を記述することです。この手法の大きな利点は、合成構造体において、生体内の血管系の密度、屈曲度、サイズ範囲、および全体的な構造を正確に再現した3次元バイオミメティック・マイクロ流体ネットワークを生成できることです。このマイクロ流体作製アプローチにより、より生体に近い組織工学構造体、バイオミメティックな疾患モデル、および超高密度オンチップデバイスを生成する能力が向上します。顕微鏡ソフトウェアの適切なセットアップと実装は直感的ではなく、しかし目的のマイクロ流体ネットワークを形成する上で極めて重要であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。バーチャルマスクの作成、顕微鏡の設定、およびバーチャルマスクの顕微鏡ソフトウェアへのアップロードを含む、多くの準備ステップについてはテキストプロトコルで説明しています。PEGDAハイドロゲルを光重合させるには、まず、底面に20 millimeterの穴が開いた60 millimeterのペトリ皿に、両面粘着テープのリングを取り付けてください。次に、ドラフトチャンバー内で、アルミ箔で覆った2 mLの褐色遠心チューブに、TEOA含有HBSを1 mL加えます。次に、1 mMのエオシンY二ナトリウム塩を10 µL、チューブに加えます。続いて、ガラスピペットを用いて、少量のNVPをガラスビーカーに分注します。この溶液から3.5 µLのNVPを分取し、混合液に加えます。次に、別のアルミホイルで覆ったチューブに10 mgの3.4 kDa PEGDAを加えます。その後、0.2 mLの混合液を加え、5% w/vのPEGDA前駆体溶液を調製します。次に、PEGDAが完全に溶解するまでプレポリマー溶液をボルテックスします。その後、気泡が入らないように注意しながら、PDMSモールド上に60 µLをピペッティングします。次に、PDMSスペーサー上の溶液の中央に、アクリレート化された40 mmの1.5番ガラスカバースリップを配置します。次に、アセンブリを95 milliwattsに校正された白色光源の下に配置します。ポリマーを3分間硬化させます。続いて、金型とカバーガラスの間に蒸留水を流して、ハイドロゲルをPDMSから分離させ、ハイドロゲルを洗い流します。次に、ハイドロゲルから水分を吸い出さないように注意しながら、カバーガラスの端を丁寧に吸い取って乾燥させます。そして、準備したペトリ皿にカバーガラスを密着させます。軽く圧力をかけると効果的です。次に、ハイドロゲルを蒸留水に浸します。テキストプロトコルに従って共焦点レーザー走査顕微鏡をセットアップし、ハイドロゲル可視化構成で開始します。その後、ハイドロゲルとペトリ皿をステージインサートに固定し、ステージ上に配置します。次に、ペトリ皿に5 mL以上の蒸留水を満たし、水浸対物レンズをハイドロゲルの直上まで、接触しないように降ろします。次に、「Live」をクリックしてアルゴンレーザー線をオンにします。その後、ハイドロゲルの上面にEosin Yのシグナルが見えるまでピントを合わせます。ハイドロゲルを見つけやすくするために、一時的にパワーのパーセント値を上げるか、ピンホールのサイズを大きくしてみてください。ハイドロゲルの上端と下端、およびウェルの底の位置にマークを付けます。次に、ジョイスティックを使用して横方向に移動し、ウェルの端を確認します。フォーカスウィンドウにおいて、Z位置ボックスの横にある下矢印を使用して、ハイドロゲル内の焦点面を150 µm下げます。次のステップが重要です。ステージウィンドウでXおよびYの位置をゼロに設定し、その後、他のすべてのマーク済み位置を削除して、ゼロに設定した位置のみをマークします。次に、入口チャネルの形成プロセスを開始するため、まず画像を撮影し、Regionsウィンドウにある矩形ボタンを使用して、血管ネットワークの入口となる領域を囲みます。その後、チャネル形成設定に移動します。詳細はテキストプロトコルに記載されています。そこへ移動したら、Zスタックウィンドウの上部にあるセンターボタンとオフセット上のボタンをクリックし、現在の位置でZスタックを中央に合わせます。次に、インレットの必要サイズに応じて、インターバルを1に設定してスライス数を決定します。ここで、速度が3に、パワーのパーセンテージが100%に設定されていることを確認してください。その後、設定を保存し、実験開始ボタンをクリックします。チャネルの分解中にハイドロゲルを可視化するには、視野内の領域が黒い場合はチャネルウィンドウのゲインマスターを上げ、領域が白い場合はゲインマスターを下げます。分解後、ハイドロゲルの可視化設定に戻り、「ライブ」をクリックして、インレットが形成されたことを確認してください。まず、regionsウィンドウで、仮想マスクのZスタックから任意のovlファイルを読み込み、矢印ボタンをクリックして視野内のROIを確認します。次に、liveをクリックしてハイドロゲルの視覚化構成をスキャンし、ジョイスティックまたはstageウィンドウを使用して、ハイドロゲルのインレットが血管ネットワーク内の正しい位置に接続されるように配置します。続いて、focusウィンドウのステップサイズを使用して下向き矢印をクリックし、顕微鏡マクロの最初のポジションである、以前の中心Z位置から50 µm下げた位置まで焦点面を移動させます。ここでも、XおよびYの位置を再ゼロ点合わせし、他のすべてのマーク済み位置を削除して、この位置のみを新しいゼロ点としてマークすることが極めて重要です。必ずこの新しい設定を保存してください。次に、チャンネル形成設定において、タイムシリーズとブリーチングウィンドウのみを選択します。次に、マクロを開き、「保存」タブを選択します。 previously作成したレシピを選択し、「適用」をクリックしてください。「保存」をクリックするとレシピが上書きされてしまうため、注意してください。設定を確認後、チャンネル形成構成を再度保存し、顕微鏡マクロの「update」をクリックします。「no」をクリックして現在のロケーションリストを上書きし、次に顕微鏡マクロの「start」をクリックしてレシピを開始します。分解プロセスが完了した後、ハイドロゲルのネイティブなEosin Y信号よりも明るい信号を持つFITC標識デキストランを観察するため、より低いレーザー出力でハイドロゲル可視化構成を使用します。蛍光標識デキストランを導入する前に、ハイドロゲル内のウェルから少量の水を吸い取ります。次に、フィルターろ過済みのFITC標識デキストランを10 µLピペッティングします。この手順を用いて、大量の微小血管画像を、画像誘導によるマイクロ流体ネットワーク構築のための仮想マスクシリーズに変換しました。得られたマイクロ流路ネットワークを、その基となった生体内の脈管系と比較しました。画像誘導下でのレーザーによるハイドロゲルの分解により、生体内脈管系のサイズ、屈曲度、および複雑な構造を再現した3Dバイオミメティック・マイクロ流路ネットワークの作製が可能となりました。これらの埋め込まれたマイクロ流路ネットワーク内に流体を導入させるため、圧力ヘッドとシリンジポンプの両方が使用されました。圧力ヘッドにより誘導された流れによって、蛍光標識した 70 kilodalton デキストランおよび 10 micron ポリスチレンビーズが左から右へ移動する様子が観察されました。あるいは、二次マイクロ流体デバイス内部でハイドロゲルを光重合させることにより、シリンジポンプ駆動の流れを開始させました。ここに記載したプロトコルを用いて、レーザーベースの分解を行い、シリンジポンプ駆動の流れおよび 65 kilodalton デキストランの灌流に向けた、封入されたハイドロゲル内の 2D 血管由来ネットワークを作製しました。このビデオを視聴することで、フェムト秒パルスレーザーを搭載した共焦点レーザー走査顕微鏡を用い、画像誘導レーザーベースのハイドロゲル分解によってバイオミメティックなマイクロ流体ネットワークを構築する方法を十分に理解できるはずです。この手法を習得し適切に実施すれば、2〜3時間で完了させることができます。この手順を行う際は、出力、波長、走査速度などのレーザーパラメータを、分解対象となるハイドロゲルの組成に基づいて調整し、最適化することが重要である点に注意してください。ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。

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Research

JoVE Journal

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血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作

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