血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作
2017年1月3日
このプロトコルは、ポリ(エチレングリコール)ジアクリレート(PEGDA)ハイドロゲルに埋め込まれた血管由来の生体模倣マイクロ流体ネットワークを製造するための、イメージ誘導レーザーベースのハイドロゲル分解の実装を概説しています。これらの生体模倣マイクロ流体システムは、組織工学アプリケーション、in vitro疾患モデルの作成、および高度な「オンチップ」デバイスの作製に役立つ可能性があります。
このプロトコルの全体的な目標は、フェムト秒パルスレーザーを備えた共焦点顕微鏡を使用して、ポリエチレングリコールジアクリレートハイドロゲルに埋め込まれた3次元血管由来の生体模倣マイクロ流体ネットワークを画像誘導レーザーベースの分解を使用して生成する方法を説明することです。この技術の大きな利点は、合成コンストラクトにおけるin vivo血管系の密度、ねじれ、サイズ範囲、および全体的な構造を正確に再現する3次元の生体模倣マイクロ流体ネットワークを生成できることです。このマイクロ流体製造アプローチは、組織工学コンストラクト、生体模倣疾患モデル、超高密度オンチップデバイスなど、in vivoでより多くのものを生成する能力を進歩させます。
顕微鏡ソフトウェアの適切なセットアップと実装は直感的ではなく、目的のマイクロ流体ネットワークを形成するために重要であるため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。テキストプロトコルでは、仮想マスクの生成、顕微鏡の設定、顕微鏡ソフトウェアへの仮想マスクのアップロードなど、多くの準備手順が説明されています。PEGDAハイドロゲルを光重合するには、まず、底部に20mmの穴が空いた60mmのシャーレに両面接着剤のリングを取り付けます。
次に、ヒュームフードで、ホイルで覆われた2ミリリットルの琥珀色の遠心分離管に、TEOAを含むHBSの1ミリリットルを追加します。次に、10マイクロリットルの1ミリモルのEosin Y二ナトリウム塩をチューブに加えます。次に、ガラスピペットを使用して、少量のNVPをガラスビーカーにピペットで入れます。
この容量から、3.5マイクロリットルのNVPを取り、それを混合物に移します。次に、10ミリグラムの3.4キロダルトンのPEGdaを2番目のホイルで覆われたチューブに追加します。次に、0.2ミリリットルの混合物を加えて、体積で5%の重量のPEGdaプレポリマー溶液を作ります。
次に、PEGdaが完全に溶解するまでプレポリマー溶液をボルテックスします。次に、気泡を導入せずに60マイクロリットルをPDMS型にピペットで移します。次に、アクリル処理された40ミリメートルの1.5ガラスカバースリップをPDMSスペーサー上の溶液の中央に配置します。
次に、アセンブリを95ミリワットを供給するように調整された白色光源の下に置きます。ポリマーを3分間硬化させます。次に、金型とカバーガラスの間に蒸留水を流して、ハイドロゲルをPDMSから分離し、ハイドロゲルを洗い流します。
次に、ハイドロゲルから水を逃がさないように、カバーガラスの端を慎重に軽くたたいて乾かします。次に、準備したシャーレにカバースリップを接着します。少しの圧力が役立ちます。
次に、ハイドロゲルを蒸留水に浸します。テキストプロトコルの説明に従ってレーザー走査型共焦点顕微鏡をセットアップし、ハイドロゲル可視化構成で開始します。次に、ハイドロゲルとシャーレをステージインサートに取り付けてステージに置きます。
次に、ペトリ皿に少なくとも5ミリリットルの蒸留水を入れ、水浸対物レンズをハイドロゲルと接触せずにハイドロゲルのすぐ上まで下げます。次に、ライブをクリックしてアルゴンレーザーラインをオンにします。次に、ハイドロゲルの上面にEosin Yシグナルが見えるまで、ハイドロゲルに焦点を合わせます。
ハイドロゲルを見つけるには、一時的に電力の割合またはピンホールのサイズを増やしてみてください。ハイドロゲルの上部と下部、およびウェルの底の位置に印を付けます。次に、ジョイスティックを使用して横方向に移動し、ウェルの端を見つけます。
フォーカスウィンドウで、Z 位置ボックスの横にある下矢印を使用して、フォーカス平面をハイドロゲル内で 150 ミクロン下にドロップします。次のステップは非常に重要です。ステージ ウィンドウで X と Y の位置をゼロにしてから、マークされた他のすべての位置を削除して、ゼロにされた位置のみをマークします。
ここで、インレットチャネルを形成するプロセスを開始するには、最初に画像をスナップし、次に領域ウィンドウの長方形ボタンを使用して、血管ネットワークへのインレットとなる領域の輪郭を描きます。次に、チャネル形成構成に移動します。詳細はテキストプロトコルで提供されます。
そこで、Z スタック ウィンドウで、上部と上のオフセットの中央ボタンをクリックして、Z スタックを現在の位置の中央に配置します。次に、入口の大きさに応じて、スライスの数を1つの間隔で設定します。次に、速度が 3 に設定され、電力の割合が 100 に設定されていることを確認します。
次に、構成の保存を続行し、[実験の開始]ボタンをクリックします。チャネルの劣化中のハイドロゲルを視覚化するには、視野内の領域が黒の場合はチャネルウィンドウでゲインマスターを増やし、領域が白の場合はゲインマスターを下げます。劣化後、ハイドロゲルの可視化設定に戻り、ライブをクリックして、入口が形成されたことを確認します。
まず、regions ウィンドウで、仮想マスクの Z スタックから任意の ovl ファイルを読み込み、矢印ボタンをクリックして視野内の ROI を確認します。次に、「ライブ」をクリックしてハイドロゲルの可視化設定をスキャンし、ジョイスティックまたはステージウィンドウを使用してハイドロゲルを配置し、インレットが血管ネットワーク内の正しい位置に接続するようにします。次に、フォーカス ウィンドウのステップ サイズを使用して、フォーカス スケールを下矢印をクリックして、フォーカス平面を顕微鏡マクロの最初の位置にドロップします。これは、前の中央に配置された Z 位置から 50 ミクロン下にあります。
ここでも、X と Y の位置を再ゼロ化し、マークされた他のすべての位置を削除して、この位置のみを新しいゼロ点としてマークすることが重要です。この新しい構成を必ず保存してください。次に、チャネル形成設定の下で、時系列ウィンドウと漂白ウィンドウのみを選択します。
次に、マクロを開き、保存タブを選択します。以前に作成したレシピを選択して、[適用] をクリックします。ストアをクリックしないように注意してください、そうしないとレシピが上書きされます。
設定を確認したら、チャンネル形成設定を再度保存し、顕微鏡マクロで[更新]をクリックします。[いいえ] をクリックして現在の場所のリストを上書きし、顕微鏡マクロで [開始] をクリックしてレシピを開始します。分解プロセスが完了したら、より低いレーザー出力でハイドロゲル可視化構成を使用して、ハイドロゲルのネイティブEosin Yシグナルよりも明るいシグナルを持つFITC標識デキストランの表示を可能にします。
蛍光標識されたデキストランを導入する前に、ハイドロゲル内のウェルから水を吸い上げます。次に、ろ過されたFITC標識デキストランの10マイクロリットルをピペットで挟みます。記載された手順を用いて、大量の微小血管画像を、画像誘導マイクロ流体ネットワーク形成のための一連の仮想マスクに変換した。
得られたマイクロ流体ネットワークを、それが由来するin vivo血管系と比較しました。画像誘導レーザーベースのハイドロゲル分解により、in vivo血管系のサイズ、曲がりくねり、複雑な構造を再現する3Dバイオミメティックマイクロ流体ネットワークの構築が可能になりました。圧力ヘッドとシリンジポンプはどちらも、これらの埋め込まれたマイクロ流体ネットワークで流体の流れを開始するために使用されました。
蛍光標識された70キロダルトンのデキストランと10ミクロンのポリスチレンビーズが、圧力ヘッド誘起流によって左から右に移動することが観察されました。あるいは、シリンジポンプ駆動の流れは、二次マイクロ流体デバイスの内部でヒドロゲルを光重合することによって開始されました。ここで説明したのと同じプロトコルを使用して、レーザーベースの分解を実装し、シリンジポンプ駆動の流れと65キロダルトンのデキストランの大量供給のためのハウジング付きヒドロゲルに2D血管由来ネットワークを作製しました。
このビデオを見れば、フェムト秒パルスレーザーを搭載したレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して、画像誘導レーザーベースのハイドロゲル劣化を使用して生体模倣マイクロ流体ネットワークを生成する方法について十分に理解できるはずです。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2〜3時間で完了します。この手順を試行する際には、パワー、波長、スキャン速度などのレーザーパラメータを、劣化するハイドロゲルの配合に基づいて調整および最適化する必要があることを覚えておくことが重要です。
あなたの実験に感謝し、頑張ってください。
概要
本プロトコルでは、画像誘導下レーザーによるハイドロゲル分解を用いて、PEGDAハイドロゲル内に血管由来のバイオミメティック（生体模倣）マイクロ流体ネットワークを作製する方法について解説します。この手法は、組織工学、in vitroでの疾患モデリング、および高度なチップ上のデバイス（on-a-chip devices）の開発を促進することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- バイオマテリアル
- 組織工学
背景
- マイクロ流路ネットワークは、生体内の血管系を模倣できる。
- PEGDAハイドロゲルは、組織工学において一般的に使用されている。
- 画像誘導技術により、マイクロ流路作製における精度が向上する。
- ハイドロゲル構造を可視化するには、共焦点顕微鏡が不可欠である。
研究の目的
- 血管構造を再現したバイオミメティックなマイクロ流体ネットワークを構築すること。
- 組織工学構築物の開発を推進すること。
- 疾患研究のためのin vitroモデルを構築すること。
使用した手法
- フェムト秒パルスレーザーを用いた共焦点顕微鏡によるハイドロゲルの分解観察。
- PEGDAハイドロゲルの調製および光重合。
- 精密なイメージングのための顕微鏡ソフトウェアの設定。
- 制御された分解による血管ネットワークの形成。
主な結果
- 三次元マイクロフルイディックネットワークの構築に成功した。
- 血管密度と構造を正確に再現した。
- 組織工学への応用における潜在的な有用性が示された。
- 視覚的なガイダンスにより、プロトコルのセットアップと実行が改善された。
結論
- 本手法は、バイオミメティック構造を構築するための信頼性の高いアプローチを提供します。
- 望ましい結果を得るためには、画像誘導技術が不可欠です。
- このプロトコルは、疾患モデリングやオンチップデバイスの進展を促進させることが可能です。
よくある質問
産業界における重要性
本プロトコルでは、生体内の血管構造を再現したバイオミメティックなマイクロ流路ネットワークの作製を可能にし、薬物動態や疾患メカニズムのより正確なin vitroモデリングを支援します。合成構造物において血管密度、蛇行度、および構築を再現することで、前臨床試験に向けたヒト・オン・ア・チッププラットフォームの開発を促進します。画像誘導によるレーザーベースのアプローチは、化合物スクリーニングやメカニズム研究に生理学的に適切な流体環境を提供し、標的検証およびリード化合物同定における予測の信頼性を向上させます。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：生体内の血液動態および物質輸送を再現した血管模倣環境における、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値：生理的に適切な血流条件下で化合物の効果を観察できるため、機能的な標的バリデーションをサポートする。
- 予測的価値：静置培養システムにおけるメカニズムの曖昧さを軽減することで、標的への結合（ターゲットエンゲージメント）およびパスウェイ調節への信頼性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 制御されたフロー条件下で、化合物の透過性、拡散、および細胞応答を定量的に評価するための、標準化され再現性のあるマイクロ流体プラットフォームを提供します。
- 運用的価値： 創薬パイプラインにおけるハイコンテントスクリーニングへの応用に向け、血管由来ネットワークのスケールアップ可能な調製を可能にします。
- アッセイの即応性： 複雑な3D血管構造の安定した画像ガイド付き作製により、複数のキャンペーンにわたるプラットフォームの再利用を容易にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性： 薬物動態（PK）および薬力学（PD）プロファイリングのために、ヒトの血管ネットワークを模倣した疾患関連マイクロ流体システムを構築し、基礎研究と前臨床段階を橋渡しします。
- バイオマーカーの整合性： 加圧またはポンプ駆動の流れの下で、蛍光トレーサーやビーズの輸送をリアルタイムイメージングすることで、トランスレーショナルバイオマーカーの同定と検証を支援します。
- リスク調整後の進展： ヒト模倣マイクロ組織構築物を用いて血管標的療法のメカニズム的なリスク低減を可能にし、Go/No-go決定に寄与します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期のターゲット検証からリード化合物の同定、そして前臨床評価に至る創薬の連続的なプロセスに統合されており、各段階における生理学的妥当性を高める血管模倣環境を構築するための再利用可能な機能を提供します。
- 探索生物学： フロー条件下での3D脈管ネットワーク内における生物学的プロセスのリアルタイム観察を可能にし、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 標準化されたジオメトリと再現性のある分解パターンを備えた、アッセイ準備済みのマイクロ流体システムを提供し、信頼性の高い化合物スクリーニングを実現します。
- 分析： 蛍光デキストランおよびビーズトラッキングによる定量的リードアウトを生成し、制御された条件下で流体力学、透過性、および細胞輸送を評価します。
- トランスレーショナルリサーチ： ヒトの血管構造を模倣することで、in vivo での薬物挙動の予測精度を向上させ、前臨床検証へと繋げます。
- エンタープライズでの再利用： 構成可能な画像誘導型作製ワークフローを確立し、プロジェクトをまたいで多様な血管モデルや実験デザインに適応させることができます。
運用および企業への影響
- 科学的価値：生理学的に適切な流体環境を用いることで、ターゲット検証における偽陽性を低減し、予測の信頼性を向上させます。
- 運用的価値：画像誘導レーザー制御と仮想マスクベースの作製により、標準化と再現性を確保します。
- 戦略的価値：血管標的候補物質の早期段階でのリスク低減を可能にし、後期段階での失敗を減らすことで、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：ヒトに近いマイクロフルイディクスシステムにおける化合物の挙動に関するデータを提供し、リスク調整後の優先順位付けをサポートします。
実施上の検討事項
- セットアップと実行を成功させるには、共焦点顕微鏡、レーザー安全性、およびハイドロゲルの光化学に関する専門知識が必要です。
- フェムト秒パルス機能を備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡と、マクロベースの制御が可能な互換ソフトウェアに依存します。
- 再現性のあるネットワーク作製のためには、バーチャルマスクの生成および顕微鏡構成について、チーム間での標準化が必要です。
- 異なるハイドロゲル組成や血管テンプレートに本プロトコルを適用する場合、適応のための検討事項が含まれます。
- ハイドロゲルの組成および分解閾値に基づいた、レーザー出力、波長、走査速度の慎重な最適化が必要であるという制約があります。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Preparation and Photopolymerization of a PEGDA Hydrogel
3:23
Preparing a Hydrogel for Microfluidic Network Formation via Laser-based Degradation
6:25
Generating and Visualizing the Microfluidic Network
8:40
Results: Comparing Fabricated Networks with Their In Vivo Counterparts and Initiating Fluid Flow
10:05
Conclusion
