レシオメトリックpH指示薬を使用して好中球ファゴソームと細胞質のイメージング

この共焦点顕微鏡法の全体的な目的は、好中球の食細胞空胞および細胞質のpHと領域をイメージングすることです。本手法により、食細胞空胞および細胞質におけるpHの動的な変化のモニタリングと定量化、および食細胞空胞の体積の測定が可能になります。これらの測定値はNADPH酸化酵素の活性に伴って変化するため、その機能および食細胞空胞膜を介したイオンフラックスの代替マーカーとして利用できます。

この手法の主な利点は、広範囲のpHに対応した染料を用いることで、ファゴソームと細胞質の両方を同時にイメージングできることです。この手順を開始するには、50 µgのcarboxy-S-1 succinimidyl esterを100 µLの高純度DMSOで希釈し、分注量（アリコート）を調製します。ボルテックスミキサーで十分に混合してください。

次に、15 mLチューブを用いて、0.1 M重曹（炭酸水素ナトリウム）溶液中の10⁸個/mLの熱死（HK）Candidaを1 mL準備します。2,000 RPMでボルテックス撹拌しながら、carboxy-S-1を100 µL、1滴ずつHK Candidaに加えます。その後、チューブをアルミホイルで包み、室温のローラー上で1時間静置します。

1時間後、2,250 ×gで10分間、遠心分離による洗浄をHKC-S-1に対して3回行います。最初の2回の洗浄では、ペレットを15 mLの0.1 M炭酸水素ナトリウムに再懸濁します。3回目の洗浄後、1 mLのBSS緩衝液に再懸濁します。

HKC-S-1懸濁液を100 µLずつチューブに分注し、-20 °Cで保存します。ヒト好中球用にHKC-S-1をオプソニン化するには、融解したHKC-S-1 100 µLにヒトIgG血清100 µLを加えます。37 °C、1,000 RPMのヒートシェーカーで60〜90分間混合した後、ローラーを用いて4 °Cで2時間混合します。

その後、17,000 ×gで1分間ずつ遠心分離を行い、BSSバッファーでサンプルを3回洗浄します。続いて、サンプルを100 µLのBSSバッファーで再懸濁します。ヒト末梢血好中球については、健康なドナーから静脈穿刺により15 mLの血液を採取し、1,000 IU/mLのヘパリンナトリウム溶液を90 µL含む20 mLシリンジに移します。

ピペットチップを使用して、10%デキストラン溶液1.5 millilitersをシリンジに注入します。ゆっくりと3回反転させ、その後ベンチ上に直立させた状態で30から60分間放置します。30から60分後、血液はおよそ半分に分かれ、上層にストロー色のバフィーコート層が、下層に赤血球を含む層が形成されます。

上層を針で慎重に押し出すか、ピペットチップで取り除き、赤血球層を巻き込まないように注意しながら15 mLチューブに移します。5 mLピペットを用い、バフィーコート層の下のチューブ底部に密度勾配剤を3〜4 mL加え、2つの明確な層を作ります。その後、サンプルを900 ×gで10分間遠心分離します。

上清を捨て、赤色のペレットを残します。その後、穏やかにボルテックスしてペレットを分散させます。次に、ペレットに 7 mL の蒸留オートクレーブ滅菌水を加え、20 秒間転倒混和してペレットを再懸濁します。

その後、2x salineを7 mL加え、数回反転させて混合し、残りの赤血球を溶血させます。次に、サンプルを300 ×gで5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットをBSS緩衝液で約4 × 10⁶/mLに再懸濁します。この手順では、8ウェル顕微鏡用プレートの各ウェルに200 µLのpoly-L-lysineを加え、室温で40〜60分間前処理し、その後poly-L-lysineを除去して、各ウェルを200 µLの蒸留水で2回洗浄します。

次に、調製した細胞懸濁液を各ウェルに 200 microliters ずつ加え、室温で 30 ～ 60 分間インキュベートします。その後、チューブに high grade DMSO を 100 microliters 加えてボルテックスで混合し、S-1-AM エステルの分注量を用意します。小さなチューブに BSS buffer を 1.7 milliliters と S-1-AM を 20 microliters 加え、混合物をボルテックスします。

その後、各ウェルを200 µLのBSS緩衝液で2回洗浄し、緩衝液をS-1-AM溶液に交換します。ウェルの壁面に沿って緩やかにピペッティングし、ウェル底面に接着している細胞単層を乱さないように注意してください。続いて、サンプルを室温で少なくとも25分間インキュベートします。

その後、200 µLのBSSバッファーでウェルを2回洗浄します。阻害剤をテストする場合は、BSSバッファーを用いて適切な薬剤のマスターミックスを作成し、それでウェルを2回洗浄します。次に、オプソニン化したHKC-S-1を5 µmで約3秒間超音波処理し、各ウェルに10 µLずつ添加します。その後、プレートを37 °Cで15〜20分間インキュベートし、食作用のスナップショット画像を撮影できる状態にします。

共焦点顕微鏡を用い、細胞が555ナノメートルで励起され、560～600ナノメートルおよび610ナノメートル以上の波長の放出光が2つの検出器で検出されるようにレーザー波長を調整します。次に、63倍のオイル浸漬対物レンズを用いて細胞を観察します。タイルスキャン画像を連続設定で使用し、中心のタイルを観察します。

蛍光強度と検出器チャンネルのゲインを用いて、レーザーのフォーカスと強度、および2つのチャンネルのゲインを調整し、画像を最適化します。その後、設定を用いて画像を分割し、両方のチャンネルを確認します。実験を開始する前に、細胞質や液胞に蛍光強度の飽和（赤色の点で表示される）が生じていないことを確認してください。

その場合は、赤色のドットが最小限となりつつ、細胞およびファゴソームが十分に明るく鮮明に見えるまでレーザー強度を下げてください。この手順では、ImageJを開き、解析用に選択した画像ファイルをツールバーに読み込みます。2つのチャネルを統合するには、[Image]、[Color]、次に[Make Composite]を選択してください。

右クリックして、結果を保存するためのファイルを選択します。次に、ツールバーのラインツールをクリックし、ダブルクリックして幅を2に太くします。ファゴソームの幅に合わせて線を引き、右クリックしてpHを測定します。

細胞質のpHも同様に、細胞質を横切る線を引くことで測定できます。測定後、右クリックして「Save File」を選択してください。ファゴソームの面積を測定するには、ツールバーにある4番目のアイコンを使用して、領域の周囲をフリーハンドで囲んでください。

次に、右クリックして「Measure Area（面積測定）」を選択します。以下は、pHに対応するS-1染色されたファゴソームの近似色の定性的な視覚的指標です。黄色はより酸性であることを示し、赤色はより塩基性であることを示します。

この画像は、食作用から20分後のHvcn1チャネルを欠損したマウス骨髄好中球を示しています。ファゴソームは非常に赤く、アルカリ性で腫脹しています。ここの赤色の矢印は細胞内のCandidaを指しており、こちらの矢印は細胞外のCandidaを指しています。

この画像は、Candidaを貪食した野生型マウス骨髄好中球を示しています。これらはHvcn1ノックアウト好中球よりもアルカリ性が著しく低くなっています。また、この画像は、貪食後同じ時点におけるヒト末梢血好中球を示しています。

マウス野生型細胞よりもわずかにアルカリ性に寄っていますが、ファゴソームはHvcn1ノックアウト細胞ほど大きく赤くはありません。この画像は、5 µMのdiphenylene iodonium存在下でCandidaを貪食したヒト好中球を示しています。この手法に習熟すれば、適切に実施することで約4〜5時間で完了させることができます。この手順を行う際は、好中球が活性化されないよう、分離時に注意することが重要です。

液胞または細胞質のpH変化、あるいは液胞体積の変化に見られる影響が、呼吸バーストの変化によるものであるかを確認するためには、遊離ラジカルの生成や酸素消費量を直接測定する別の方法で、この呼吸バーストを測定することができます。このビデオを視聴することで、ヒト好中球を単離し、その後ファゴソームと細胞質を染色してイメージングする方法について十分に理解できるはずです。ヒト血液サンプルを用いた作業は非常に危険な場合があるため、この手順を行う際は、常に手袋や保護衣を着用するなどの予防措置を講じることを忘れないでください。