レシオメトリックpH指示薬を使用して好中球ファゴソームと細胞質のイメージング

この原稿は、レシオメトリック指標であるセミナフトロダフルーア(SNARF)-1またはS-1を使用して、ヒトおよびマウスの好中球のファゴソームpHと面積、および細胞質pHを測定する簡単な方法について説明しています。これは、生細胞共焦点蛍光顕微鏡法と画像解析を使用して達成されます。

この共焦点顕微鏡法の全体的な目標は、好中球食細胞液胞と細胞質のpHと面積を画像化することです。この方法により、食細胞液胞および細胞質内のpHの動的変化、および食細胞液胞の体積の動的変化のモニタリングと定量化が可能になります。これらの測定値は、NADPHオキシダーゼの活性によって変化し、その機能および食作用液胞の膜を横切るイオンフラックスの代理マーカーとして使用できます。

この手法の主な利点は、ファゴソームと細胞質の両方を、広いpH範囲を持つ色素で同時にイメージングできることです。この手順を開始するには、カルボキシ-S-1スクシンイミジルエステルのアリコートを100マイクロリットルの高品位DMSOで50マイクログラムに希釈して調製します。よく渦を巻いて混ぜます。

次に、15ミリリットルのチューブに0.1モルの重曹で10〜8番目のヒートキルまたはHKカンジダの1ミリリットルを準備します。100マイクロリットルのカルボキシ-S-1を一度に1滴ずつHKカンジダに加え、2, 000 RPMで渦で混合します。その後、チューブをアルミホイルで包み、室温でローラーに1時間置きます。

1時間後、HKC-S-1を2、250回gで遠心分離することにより、毎回10分間3回洗浄します。最初の2回の洗浄では、ペレットを15ミリリットルの0.1モル重炭酸ナトリウムに再懸濁します。3回目の洗浄後、1ミリリットルのBSSバッファーに再懸濁します。

HKC-S-1懸濁液を100マイクロリットルアリコートのチューブに移し、マイナス20°Cで保管します。ヒト好中球のHKC-S-1をオプソナイズするには、解凍したHKC-S-1の100マイクロリットルに100マイクロリットルのヒトIGG血清を追加します。37°Cと1,1000 RPMのヒートシェーカーで60〜90分間混合し、次にローラーで4°Cで2時間混合します。

その後、BSS緩衝液中で試料を17,000回gで遠心分離することにより、それぞれ1分間試料を3回洗浄する。その後、サンプルを100マイクロリットルのBSSバッファーに再懸濁します。ヒト末梢血好中球の場合、健康なドナーから静脈穿刺によって15ミリリットルの血液を採取し、それを1,000IU/ミリリットルで90マイクロリットルのヘパリンナトリウム溶液を含む20ミリリットルの注射器に移します。

ピペットチップを使用して、1.5ミリリットルの10%デキストラン溶液をシリンジに注入します。そっと3回ひっくり返し、ベンチに30〜60分間直立させます。30〜60分後、血液はほぼ半分に分割され、麦わら色のバフィーコート層と赤血球を含む下部層になります。

最上層を針で慎重に押し出すか、ピペットチップで取り除いてから、15ミリリットルのチューブに移し、赤い層を取り出さないようにします。5ミリリットルのピペットを使用して、チューブの底、バフィーコート層の下に3〜4ミリリットルの密度勾配培地を加え、2つの異なる層を取得します。その後、サンプルを900倍gで10分間遠心分離します。

上澄みを注ぎ、赤いペレットを残します。その後、ペレットを乱すために穏やかに渦を巻きます。次に、7ミリリットルの蒸留オートクレーブ水をペレットに加え、20秒間反転させてペレットを再懸濁します。

その後、7ミリリットルの2倍生理食塩水を加え、数回反転させて混合し、残りの赤血球を溶解し、サンプルを300倍gで5分間遠心分離します。上清を注ぎ、ペレットをBSSバッファーに再懸濁し、10〜6ミリリットルあたり約4倍にします。この手順では、各ウェルに200マイクロリットルのポリ-L-リジンを入れた8ウェル顕微鏡プレートを室温で40〜60分間前処理し、次にポリ-L-リジンを取り外し、ウェルを200マイクロリットルの蒸留水で2回洗浄します。

次に、調製した細胞懸濁液200マイクロリットルを各ウェルに加え、室温で30〜60分間インキュベートします。その後、チューブに100マイクロリットルの高品位DMSOを加えて渦巻き混ぜてS-1-AMエステルのアリコートを調製します。小さなチューブに、1.7ミリリットルのBSSバッファーと20マイクロリットルのS-1-AMを加え、混合物をボルテックスします。

その後、ウェルを200マイクロリットルのBSSバッファーで2回洗浄し、バッファーをS-1-AM溶液と交換します。ウェルの底に付着したセル単層を乱さないように、ウェルの壁に液体を静かにピペッティングします。その後、サンプルを室温で少なくとも25分間インキュベートします。

その後、200マイクロリットルのBSSバッファーでウェルを2回洗浄します。阻害剤をテストするには、BSSバッファーで適切な薬物のマスターミックスを作り、それでウェルを2回洗浄します。次に、オプソニン化したHKC-S-1を5ミクロンで約3秒間超音波処理し、各ウェルに10マイクロリットルを加え、次いでプレートを摂氏37度で15〜20分間インキュベートし、細胞を食作用のスナップショットのためにイメージングする準備を整える。

共焦点顕微鏡を使用して、細胞が555ナノメートルで励起され、発光が560〜600ナノメートルと610ナノメートルを超える2つの検出器によって検出されるようにレーザー波長を調整します。次に、63倍油浸レンズを使用して細胞を観察します。連続設定でタイルスキャン画像を使用して、中央のタイルを表示します。

蛍光強度と検出器チャネルのゲインを使用して、レーザーの焦点と強度、および2つのチャネルのゲインを調整して、画像を最適化します。その後、設定を使用して画像を分割し、両方のチャンネルを表示します。実験を開始する前に、細胞質または液胞に蛍光強度の飽和がなく、赤い点として表示されることを確認してください。

その場合は、レーザー強度を下げて、赤い点の数を最小限に抑えますが、細胞とファゴソームは明るく、見るのに十分な鮮明さになります。この手順では、ImageJ を開き、分析用に選択した画像ファイルをツールバーに読み込みます。2 つのチャネルを組み合わせるには、[イメージ]、[カラー]、[合成を作成]の順に使用します。

結果を保存するファイルを右クリックして選択します。次に、ツールバーのラインツールをクリックし、ダブルクリックして幅を2つに増やします。ファゴソームの幅に線を引き、右クリックしてpHを測定します。

細胞質のpHは、細胞質を横切る線を引くことで同じ方法で測定できます。測定が終了したら、右クリックして[ファイルを保存]を選択します。ファゴソーム領域を測定するには、ツールバーの4番目のアイコンを使用して、領域の周りにフリーハンドで描画します。

続いて、右クリックして[エリアの測定]を選択します。これは、pHに対応するS-1染色ファゴソームのおおよその色の定性的な視覚的キーです。黄色は酸性度が高いことを示し、赤はアルカリ度が高いことを示します。

この画像は、食作用の20分後にHvcn1チャネルを欠くマウス結合骨髄好中球を示しています。ファゴソームは非常に赤く、アルカリ性で腫れています。ここでの赤い矢印は細胞内カンジダを指し、この矢印は細胞外カンジダを指しています。

この画像は、カンジダ菌を摂取した野生型マウス骨髄好中球を示しています。それらはHvcn1ノックアウト好中球よりもはるかにアルカリ性が低いです。この画像は、食作用後の同時点におけるヒト末梢血好中球を示しています。

それらはマウスの野生型細胞よりもわずかにアルカリ性に見えますが、ファゴソームはまだHvcn1ノックアウト細胞ほど大きくて赤くはなく、この画像は、5マイクロモルのジフェニレンヨードニウムの存在下でカンジダを食作用させたヒト好中球を示しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約4〜5時間で完了します。この手順を試みる際には、好中球を分離する際には、好中球が活性化されないように注意することが重要です。

液胞または細胞質のpHまたは液胞体積の変化に見られる影響が呼吸バーストの変化によるものかどうかを判断するために、この呼吸バーストは、フリーラジカルの生成または酸素消費量を直接測定する他の方法で測定できます。このビデオを見れば、ヒト好中球を単離し、ファゴソームと細胞質を染色して画像化する方法について十分に理解できるはずです。人間の血液サンプルを扱う作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、手袋や防護服の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。