Name: 生理的酸素条件に曝露されたヒト細胞におけるキャップ結合タンパク質の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学ぶ、m7GTPアガロースビーズを用いた低酸素条件下でのキャップ結合タンパク質の捕捉法。ヒト細胞における翻訳開始因子の酸素応答性を解析し、がん治療への応用可能性を示す。

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この作業は、カナダ自然科学工学評議会とオンタリオ研究イノベーション省の支援を受けました。

細胞培養のための1.準備<ol><li>ヒト細胞の市販の株式を購入します。 注：このプロトコルは、HCT116結腸直腸癌および初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞（HRPTEC）を利用します。 </li><li> HCT116の培養のための500ミリリットルの媒体を作る：ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/ 7.5％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）を補充した高グルコース培地。 </li><li> HRPTECの培養物を500 mlの培地を加える：5％FBS、1％の上皮細胞成長サプリメント、1％P / Sを補充した上皮細胞培地。 </li><li> 140mMのNaClを、3のKCl、10mMののNa 2 HPO 4、15mMのKH 2 PO 4：1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の500ミリリットルを準備します。 pHを7.4に調整し、121℃で40分間オートクレーブで滅菌します。 </li></ol>細胞培養の2開始<ol><li>慎重トンを乱すことなく、80〜90％のコンフルエント皿から培地を吸引彼は細胞。 </li><li>アリコート培養皿あたり1×PBS 3〜5mlの、静かにコーティングするために皿の表面積を各フラスコを揺らして、慎重に1×PBSを吸引します。第1×PBS洗浄のために繰り返します。 </li><li>各培養皿に小分けし、0.05％トリプシン - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）の3ミリリットルを、穏やかにトリプシンEDTAで均一にコート細胞をに揺すります。 2-3分間37℃でインキュベートします。 </li><li> 90秒間4000×gで15ミリリットルの遠心分離管と遠心分離機に剥がれた細胞を転送します。 </li><li>完全DMEM 1ml中に再懸濁細胞ペレット。 </li><li>血球計数器を用いて細胞数を計測します。 100mMの細胞培養皿は、1cm 2あたり約2,500〜5,000細胞の初期播種密度を達成するために必要とされるどのように多くの非発熱性及びポリスチレン計算します。 </li><li>ステップ30から45分間、37℃の水浴中で1.2または1.3で行われたプレ暖かい完全な細胞培養培地。 </li><li> 70％エタノールを含む培地ボトル細胞バイアルを除染。この点から前方すべて操作は無菌的に行われるべきです。 </li><li>ステップ2.6で述べた播種密度内で凍結細胞のボリューム全体を使用するために必要な限り多くの100mmの細胞培養皿にアリコート完全DMEM 6ミリリットル。 </li><li> 100mm培養皿のそれぞれに、ステップ2.6で算出された細胞懸濁液の量を転送します。均等にプレートの表面上に細胞を分配するために、手動で各プレートを揺らし。 </li><li> 5％CO 2雰囲気中で37℃のインキュベーター内でシードされた100ミリメートル細胞培養皿を置きます。細胞は、次のステップの前に、少なくとも24時間インキュベートすることを許可します。 </li></ol> 3.継代<ol><li>細胞集密度の割合（皿の面積をカバー％細胞）を決定するために、顕微鏡下で各細胞培養皿を表示します。インキュベーターとプリ暖かい完全培地および1×PBSに細胞を返します。細胞は、80から100までパーセントのコンフルエントであれば次のステップに進みます。 </li><li>慎重に乱すことなく、使用済み培地を吸引各培養皿中の細胞。 </li><li>アリコート培養皿あたり1×PBS 3〜5mlの、静かにコーティングするために皿の表面積を各フラスコを揺らして、慎重に1×PBSを吸引します。第1×PBS洗浄のために繰り返します。 </li><li>各培養皿に小分けし、0.05％トリプシン-EDTAの3ミリリットルを、穏やかにトリプシンEDTAで均一にコート細胞をに揺すります。 2-3分間37℃でインキュベートします。 </li><li>このインキュベーションの間に、多くの培養皿にアリコート完全培地10mlを1cm 2あたり2,500〜5,000の細胞の細胞密度を得るために必要とされます。 </li><li>細胞がプレートから剥離したら、すぐに1×定義されたトリプシンインヒビターの3ミリリットルを追加し、穏やかにトリプシンEDTAの全てが中和されていることを確認するために、1分間の皿を旋回。 </li><li>無菌の15mlの遠心管に剥がれた細胞を移し、脇に置きます。残りの細胞を収集し、同じ15ミリリットルの遠心管にそれを転送するために皿にPBS 1×3ミリリットルを追加します。 </li><li> 150 XGを遠心分離して細胞をペレット化5分間。 </li><li>上清を吸引し、完全培地3mlに細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>血球計を用いて細胞を計数し、1cm 2あたり2,500〜5,000の細胞の細胞密度を得るために完全培地15 mlを含むの150mm培養皿に播種。各キャップ結合アッセイのための2つの150ミリメートルを使用してください。 注：液体培地を介して細胞への酸素の拡散は、ボリューム36に依存しています。懸濁液中の接着細胞や細胞を使用するかどうかの実験の間で一貫性のメディアの容量を維持することが推奨されています。メディアが拡散でこれらの変動性を回避するために、（議論で説明したように24時間のワークステーションでインキュベート）予め調節することができます。 </li><li> 5％CO 2雰囲気中で37℃のインキュベーターで播種し、培養皿を置きます。細胞は、次のステップに進む前に、少なくとも24時間インキュベートすることを許可します。 </li></ol> 4. Physioxic露出<ol><li>顕微鏡下で細胞を見ます。 BESのためのトンの結果は、細胞が24時間の暴露70〜80％コンフルエント、48時間の暴露50〜60％コンフルエント、および72時間の暴露40〜50％コンフルエントであることを確認してください。 </li><li>所望の時間（24、48、または実験に応じて72時間）のための低酸素ワークステーションにセルを配置します。 </li><li>適切なphysioxiaにワークステーションを設定します。 注：たとえば、3％O 2設定は、5％のCO 2および92％N 2を伴うことになります。 注：ダイナミックレンジ内の酸素変動が機器内に特定のタイムライン、プログラムのスケジュールを超える希望するか、手動で任意の間隔で酸素の設定を調整している場合。 </li><li> 60％の湿度を設定します。ワークステーションの雰囲気は、それにもかかわらず、非常に乾燥している、とメディアが著しく長い実験（&gt; 48時間）の間に蒸発します。 （メディアは、ワークステーションの雰囲気で平衡化されるように）細胞培養DISのメディアを補充するためにワークステーション内の細胞培養フラスコ内のメディア予約を保ちます彼は。 注：溶存酸素は大気中の酸素36と均衡するような（例えば、PBSおよびトリプシンEDTAなど）、溶解前に細胞と相互作用する任意のソリューションは、低酸素ワークステーション内で使用する前に24時間事前に調整されなければなりません。 </li><li>溶解するまでワークステーション内の細胞を保管してください。 </li></ol>キャップ結合アッセイ5.準備バッファ<ol><li>調製1×トリス緩衝食塩水（TBS）。 <ol><li> dH 2 Oの800ミリリットルで、8.76グラムのNaClおよび6.05グラムトリス塩基を溶解します。 </li><li> 1 M HClを用いて7.4の最終pHに対する解決策をもたらします。 </li><li> dH 2 Oを使用して、1リットルに最終容量を持参</li></ol></li><li>非変性溶解バッファーを準備します。キャップ結合アッセイの日を緩衝溶解準備します。空白のアガロースビーズとγアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズ（7.9および7.13ステップ）を洗浄するために余分な溶解バッファーを作成します。 <ol><li> dH 2 Oの7ミリリットルで、160μlの5 MのNACを追加リットル、160μlの1 Mトリス塩酸pH7.4の、40μlの200mMのNaFを、40μlの1 MのMgCl 2、および40μlの1mMのオルトバナジウム酸ナトリウム。 </li><li> 7ミリリットル溶液にイゲパールの40μLを加えます。それは非常に粘性があるようイゲパルを取得支援するためにピペットの先端をカットします。 </li><li>イゲパルの全てが溶解するまで、ピペッティング、またはボルテックスによって7ミリリットルの溶液を混ぜます。 </li><li> 8ミリリットルの溶液の最終容量を上げ、氷上に保ちます。 </li></ol></li><li> 4xのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-PAGEサンプルバッファーを準備します。 <ol><li>ビーカーに、16ミリリットルの1MのTris-HCl pHが6.8、12.64ミリリットルグリセロール、および8ミリリットルジチオスレイトール（DTT）を組み合わせます。 </li><li> SDSの3.2グラムとブロモフェノールブルーの0.16グラムを追加します。粉末が完全に磁気攪拌棒を混合することにより溶解させます。 </li><li> -20℃で1.5 mlマイクロチューブに小分けし、店舗。 </li></ol></li></ol> 6.細胞溶解<ol><li>非変性溶解緩衝液を準備し、氷の上で目の日を保ちます電子キャップ結合アッセイ。 </li><li>前加温1×PBSと30分間37℃の水浴中でトリプシン。 </li><li>各キャップ結合アッセイ1.5 mlマイクロ遠心チューブに溶解緩衝液のアリコート980μlを行っています。 </li><li>溶解緩衝液980μlに、4-（2-アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩および100Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを10μlの10μLを加えます。氷の上に保管してください。 </li><li>低酸素ワークステーション内の廃棄物容器内の各150ミリメートル皿からメディアを破棄します。 </li><li>暖かい1×PBS 3-4 mlの細胞を洗浄し、液体のすべてを捨てます。 </li><li>各皿に暖かい0.05％トリプシンEDTAの1ミリリットルを加え、2分間、または細胞がもはやプレートに接着されるまで放置します。 </li><li>ピペットを用いて1.5 mlのマイクロ遠心チューブに1プレートの細胞を移します。必要に応じてセルの各プレートが別々の1.5mL微量遠心管に転送されるように繰り返します。 </li><li> 90秒tの6000×gで1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブを遠心O細胞をペレット。 </li><li>ペレットを乱すことなくピペットを用いてトリプシンを吸引します。ペレットを1.5 mlのマイクロ遠心チューブは、90秒間6000×gで再遠心分離、乱された場合。 </li><li>優しくちょうどペレット上記チューブに200μlのPBSをピペットで暖かい1×PBSで細胞を洗浄。再び遠心分離し、ペレットを乱されている場合。 </li><li>ペレットを乱すことなくPBSを吸引します。 </li><li> 1ミリリットルからピペット500μlを最初に携帯ペレットに溶解緩衝液を調製しました。ピペッティングにより完全にペレットを再懸濁。 </li><li>第二の細胞ペレットに再懸濁された細胞を組み合わせて、上下にピペッティングすることにより、第2のペレットを再懸濁。すべてのペレットを合わせ、各サンプルのために再懸濁されるまで、このプロセスを繰り返します。 </li><li> 1.5ミリリットルマイクロチューブに溶解バッファーの残りの500μlの溶解液を兼ね備えています。 </li><li>低酸素ワークステーションからのサンプルを削除します。 注：溶解緩衝液を添加した後、LL以降の工程は、低酸素ワークステーションを37℃に設定し、次のステップは、冷（4℃または氷上で）実行されるべきであるよう、周囲空気中で実施されます。 </li><li>溶解1.5-2時間、4℃でサンプルを回転させることにより、穏やかな攪拌を使用して細胞。 </li><li>細胞破片を除去するために、4℃で15分間12,000×gで溶解した細胞を遠心します。 </li><li>新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにライセートを移し、ペレットを捨てます。 </li><li>将来のウェスタンブロット分析のための全細胞溶解物の入力制御として使用される上清の一部（5~10％）を予約します。 </li></ol> 7.キャップ結合アッセイ<ol><li>各サンプルについて、1.5ミリリットルのマイクロチューブを分離するために、ブランクアガロースビーズ制御スラリー50μlのとγアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズスラリー50μlのを転送します。ビーズスラリーの収集を容易にするために、ピペットの先端を除去するために、はさみを使用してください。 </li><li>ビーズbをペレットyが30秒間500×gでスラリーを遠心分離します。 </li><li>慎重に上清を除去し、TBS500μlのビーズを再懸濁します。 </li><li>繰り返しは、7.2と7.3を繰り返します。 30秒間500×gでビーズをペレット化し、上清を除去します。 </li><li>空白のアガロースビーズを含む1.5 mlマイクロチューブにステップ6.19からの溶解物を含有する上清を移します。 注：空白のアガロースビーズは非特異的にビーズと相互作用する溶解物からタンパク質を除去するためのプレクリアステップとして機能します。 </li><li>穏やかに攪拌しながら4℃で10分間インキュベートします。 </li><li> 30秒間500×gで遠心分離することにより、ブランクのアガロースビーズをペレット化。 </li><li> γアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズを含む1.5 mlのマイクロチューブにライセートを移します。 </li><li> 30秒間500×gで遠心分離し、supernaを廃棄することによりビーズをペレット化し、溶解緩衝液500μlでビーズを再懸濁することにより、ブランクアガロースビーズを洗浄タント。 5回の洗浄の合計のために、この4回繰り返します。 </li><li> 1×SDS-PAGEサンプル緩衝液中でブランクアガロースビーズを再懸濁し、そして95℃で90秒間のビーズを沸騰させます。将来のウェスタンブロット分析のために-20℃で保存は、目的のタンパク質は、ビーズに非特異的に結合するかどうかを観察しました。 </li><li>キャップ結合タンパク質を捕捉するために4℃で1時間穏やかに攪拌しながらγアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズと溶解液をインキュベートします。 </li><li> 30秒間500×gで遠心分離することにより、γアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズをペレット化。上清を捨てます。 </li><li>ステップ7.9を繰り返して、γアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズを洗ってください。 </li><li>溶解緩衝液600μlの中でビーズを再懸濁します。 </li><li> 1mMの最終濃度にGTPを加えます。 </li><li> 4°Cで1時間穏やかに攪拌しながらγアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズ+ 1 mMのGTPをインキュベートします。注：このを非特異的（ すなわち、非メチル化GTPとの相互作用）は、m 7 GTPと相互作用するタンパク質の関連付けを解除します。 </li><li> 30秒間500×gで遠心分離することにより、γアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズをペレット化。 </li><li>新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移し、4×SDS-PAGE試料緩衝液（50mMのトリス-HCl、100mMのDTT、2％SDS、0.1％ブロモフェノールブルー、10％グリセロール）の200μLを加えます。将来のウェスタンブロット分析37のために-20℃でのGTPコントロールサンプルを保管してください。ステップ7.9を繰り返してビーズを洗浄します。 </li><li> 1×SDS-PAGE試料緩衝液（50mMのトリス-HCl、100mMのDTT、2％SDS、0.1％ブロモフェノールブルー、10％グリセロール）中でビーズを再懸濁し、90秒間、95℃で沸騰します。将来のウェスタンブロット分析37のために-20℃でメートル7 GTP結合画分を保管してください。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

生理的酸素条件に曝露したヒト細胞中でのキャップ結合タンパク質の分析は、新規な酸素調節翻訳開始因子の同定を可能にすることができます。 mRNA又は他のキャップ結合タンパク質の5 &#39;キャップのためのこれらの因子の親和性がm 7 GTP結合アガロースビーズへの関連の強さを測定することができます。この技術の一つの注意点は、それがタンパク質ポスト溶解のキャップ結合能を測定するが、それは、タンパク質 - タンパク質相互作用、および翻訳後修飾（PTMを）を維持し、非変性条件下で行われることです。いくつかのタンパク質 - タンパク質相互作用は、5 &#39;キャップへのeIF4Eファミリーの結合を媒介します。 4E-BPは結合してのeIF4Gとの相互作用を遮断し、38複雑な開始前43Sの動員を防止することによってのeIF4Eを抑制する。 eIF4E / 4E-BP複合体は、その転写物から任意の開始を阻止する、5 &#39;mRNAキャップに結合したままで、とすることができますM 7 GTPアフィニティーカラムでのeIF4Eの阻害のためのマーカーとして使用することができます。逆に、...

翻訳制御は、特に細胞ストレス1の期間中に、遺伝子発現の転写調節にも等しく重要なステップとして浮上しています。翻訳制御の焦点は、タンパク質合成の最初のステップは7-メチルに真核生物の開始因子4E（のeIF4E）の結合を伴う開始の律速段階（メートル7 GTP）のmRNA 2の5 &#39;キャップであります。 eIF4EはeIF4A、RNAヘリカーゼ、およびeIF4Gを、他の翻訳因子と40Sは3リボソームの募集に必要な足場タンパク質を含んでeIF4Fという名前の三量体複合体の一部です。正常な生理的条件下では、mRNAの大半はキャップ依存性機構を介して翻訳されていますが、細胞ストレスの期間の下で人間のmRNAの約10％が1,4- intiationキャップ非依存性翻訳される可能性があり5&#39;UTRを含まれています。キャップ依存性翻訳は、歴史的に同義語となっていますOUのeIF4Fで、しかし、eIF4Fのストレス固有のバリエーションが話題に5-8となっています。 様々な細胞ストレスはのeIF4E活性がラパマイシン複合体1（mTORC1）の哺乳類標的を介して抑制させます。このキナーゼは、その目標の一つ、4E結合タンパク質（4E-BP）の活性の増加をもたらすストレス、下損なわれる。非リン酸化4E-BPはのeIF4EとブロックのeIF4Gは、キャップ依存性翻訳9,10の抑制を引き起こすと相互作用する能力に特異的に結合します。興味深いことに、eIF4E2（または4EHP）という名前のeIF4Eのホモログは、おそらく、それがストレス媒介抑制を回避することができ、4E-BP 11のためのはるかに低い親和性を有します。確かに、最初は原因のeIF4G 12との相互作用の欠如への翻訳のリプレッサーとして特徴づけ、eIF4E2は、低酸素ストレス6,13の間にそれらの3 &#39;UTR中のRNAの低酸素応答エレメントを含むmRNAの何百もの翻訳を開始します。この活性化IeIF4G3、RNA結合タンパク質モチーフ4、および低酸素誘導因子、低酸素eIF4F複合体を構成する（HIF）2α、またはeIF4F H 6,13との相互作用を介して達成秒。通常の条件下ではリプレッサーとして、eIF4E2はGIGYF2とZNF598 14と結合します。これらの複合体は、部分的には、アガロース結合M 7 GTPの親和性樹脂を介して同定されました。この古典的な方法15は、翻訳の分野における標準であり、最高の、最も一般的にプルダウンでキャップ結合複合体を単離するための技術を使用し、in vitroでの結合アッセイ16-19です。キャップ依存性翻訳機構の間に変化する部分6-8,13のように柔軟で適応浮上しているように、この方法は急速にストレス応答に関与する新規キャップ結合タンパク質を同定するための強力なツールです。いくつかの真核生物のモデル系は、このようなストレス応答のためeIF4E2ホモログを使用するように見えるようさらに、eIF4Fの変動は、広い意味を持っている可能性がシロイヌナズナ 20として、S.ポンベ 21は 、Dは 22 ショウジョウバエ 、およびCは 23 エレガンス 。 証拠は、eIF4Fの変動がストレス条件に厳密に限定されないが、通常の生理24に関与することを示唆しています。 （微小電極を介して測定）（キャピラリー端で）または組織内の組織への酸素供給は、脳25で2から6パーセントから変化し、肺26内の百分の3から12まで、腸27、4％でで3.5から6パーセント肝臓28、腎臓29内の7から12までパーセント、筋肉30で4％、および骨髄31で6から7パーセント。細胞およびミトコンドリアは、1.3％未満の酸素32を含んでいます 。これらの値は、細胞が日常的に培養される周囲の空気よりも低酸素状態に非常に近いです。これは、どのような以前に低酸素症特異的な細胞過程であると考えられたが、生理的環境の中で関連するかもしれないことを示唆しています。興味深いことに、eIF4FとeIF4F H </suP&gt;積極的に生理学的な酸素または「physioxia」24に露出し、いくつかの異なるヒト細胞株におけるmRNAの異なるプールまたはクラスの翻訳開始に関与します。低酸素はまた、適切な胎児の発育33を駆動し、細胞は、一般physioxia 34においてより高い増殖速度、より長い寿命、より少ないDNA損傷の少ない一般的なストレス応答を持っています。したがって、eIF4F Hは、おそらく生理的条件下で、選択遺伝子の発現の重要な要因です。 ここでは、固定された生理的酸素条件や組織の微小環境の可能性が高い、より代表的であるダイナミック変動範囲内の培養細胞へのプロトコルを提供します。この方法の一つの利点は、細胞が低酸素ワークステーション内に溶解されることです。細胞溶解に低酸素細胞培養物からの遷移は、他のプロトコルで実行される頻度は明らかではありません。細胞は、多くの場合、最初の小さな低酸素培養器から除去されること酸素に対する細胞応答が速いようフォア溶解するが、酸素へのこの暴露は35（1または2分）生化学的経路に影響を与える可能性があります。特定のキャップ結合タンパク質が第2の基地との相互作用を必要とするか、またはメートル7 GTPを加水分解することができ、したがって、いくつかのキャップ相互作用は、精製プロセスにおいて見落とされる可能性があります。アガロース結合酵素耐性キャップ類似体には、このプロトコルで置換されていてもよいです。ここに記載の方法によりeIF4F HとeIF4Fの他のバリエーションの活性および組成を探ることは、細胞が生理的条件やストレス応答の際に利用する複雑な遺伝子発現機械に光を当てるます。

<table><tbody><tr><td>&gamma;-アミノフェニル-m7GTP アガロース C10結合ビーズ</td><td>イエナ バイオサイエンス</td><td>AC-1555</td><td>アガロース結合 m7GTP</td></tr><tr><td>100 mm 培養皿</td><td>コーニング</td><td>877222</td><td>10 cm 培養皿</td></tr><tr><td>150 mm 培養皿</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>130183 15 cm 培養皿</td></tr><tr><td>AEBSF 塩酸塩</td><td>ACROSOrganics</td><td>A0356829</td><td>AEBSF</td></tr><tr><td>アガロースビーズ</td><td>イエナ バイオサイエンス&nbsp;</td><td>AC-0015</td><td>アガロースビーズ制御</td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>フィッシャー</td><td>BP112-25</td><td>SDS-PAGEローディングバッファーの成分</td></tr><tr><td>1.5 ml 遠心分離管</td><td>FroggaBio</td><td>1210-00S</td><td>少量の遠心分離に使用</td></tr><tr><td>15 ml 円錐形遠心分離管</td><td>フィッシャー</td><td>1495970C</td><td>初代細胞の培養に使用</td></tr><tr><td>定義されたトリプシン阻害剤</td><td>フィッシャー</td><td>R007100</td><td>DTI</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>フィッシャー</td><td>BP172-25</td><td>DTT</td></tr><tr><td>上皮細胞培地 (コンプリートキット)</td><td>ScienCell</td><td>4101</td><td>血清と成長因子のサプリメントを含む)</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー</td><td>BP229-1</td><td>SDS-PAGEローディングバッファーの成分</td></tr><tr><td>100 mM グアノシン 5'-三リン酸、1 ml</td><td>イエナバイオサイエンス</td><td>272076-0251M</td><td>GTP</td></tr><tr><td>HCT116結腸直腸癌</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td>ヒト癌細胞株</td></tr><tr><td>ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-010</td><td>HRPTEC</td></tr><tr><td>ハイクロンDMEM/高グルコース</td><td>GEライフサイエンス</td><td>SH30022.01</td><td>ヒト細胞培養用標準培地</td></tr><tr><td>ハイクロンペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>GEライフサイエンス</td><td>SV30010</td><td>DMEM</td></tr><tr>の抗生物質成分<td>H35 HypOxystation</td><td>Hypoxygen</td><td>N/A</td><td>Hypoxia workstation</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>MP Biomedicals 2198596</td><td></td><td>溶解バッファーの洗剤成分</td></tr><tr><td>リン酸一カリウム</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td>MgCl<サブ>2</サブ>塩化</td></tr><tr><td>ナトリウム</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP358-10</td><td>NaCl</td></tr>フ<tr><td>ッ化ナトリウム</td><td>フィッシャー5299-100</td><td>NaF(溶解緩衝液のホスファターゼ阻害剤成分)</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム</td><td>フィッシャー5369-500</td><td>Na<サブ>2</サブ>HPO<サブ>4</サブ></td><td></td></tr><tr><td>プレミアムグレードウシ胎児血清</td><td>血清</td><td>1500-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル (100x)</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>58715</td><td>溶解バッファーの成分</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td>BP166-100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>オルトバナジン酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>56508</td><td>Na3VO4</sub</td></tr><tr><td>>Tris Base</td><td>フィッシャー</td><td>BP152-5</td><td>バッファー</td></tr><tr>の成分<td>0.05% トリプシン-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>2500-067</td><td>接着細胞の剥離に使用されるトリプシン</td></tr></tbody></table>

生理的酸素条件に曝露されたヒト細胞におけるキャップ結合タンパク質の解析

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

翻訳制御は、特に細胞ストレスの期間中の遺伝子調節の焦点です。eIF4F複合体を介したキャップ依存性翻訳は、真核細胞でタンパク質合成を開始する最も一般的な経路ですが、この複合体のストレス特異的な変異が現在出現しています。アガロース結合m7GTP(5' mRNAキャップアナログ)からなるアフィニティー樹脂でキャップ結合タンパク質を精製することは、翻訳開始の制御に関与する因子を同定するための有用なツールです。低酸素症(低酸素)は、胎児の発育や腫瘍の進行時に遭遇する細胞ストレスであり、翻訳調節に大きく依存します。さらに、最近、ヒトの成体臓器は、細胞が日常的に培養される周囲の空気よりも低酸素に近い低酸素含有量(フィジオクシア1〜9%酸素)を持っていることが報告されました。低酸素eIF4F複合体(eIF4FH)の特性評価が進む中、5' mRNAキャップを介した酸素依存性翻訳開始の理解への関心が高まっています。私たちは最近、酸素の利用可能性によって制御されるキャップ結合タンパク質を解析するためのヒト細胞培養法を開発しました。このプロトコルは、酸素への曝露を排除するために、細胞培養と溶解を低酸素ワークステーションで行うことを強調しています。液体培地がワークステーション内の雰囲気と平衡化するために、細胞を少なくとも24時間インキュベートする必要があります。この制限を回避するために、より短い時点が必要な場合は、事前に調整された培地(脱酸素化)を細胞に添加することができます。特定のキャップ結合タンパク質は、第2塩基との相互作用を必要とするか、またはm7GTPを加水分解する可能性があるため、精製プロセスで一部のキャップ相互作用器が見逃される可能性があります。酵素耐性キャップアナログに結合したアガロースをこのプロトコルで置換できます。この方法により、ユーザーはキャップ依存性翻訳に関与する新しい酸素調節翻訳因子を特定できます。

メートル7 GTPアフィニティーカラムでのeIF4EとeIF4E2の酸素に応答したキャップ結合能の解析 Fのigure 1及び結腸直腸癌において、初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞（HRPTEC）（： 図1および2は、2つのヒト細胞株中での酸素の変動に応じて二つの主要なキャップ結合タンパク質の典型的なM 7 GTPアフィニティ精製のウエスタンブロットを表します図2のHCT116）。細胞は、液体培地中の溶存酸素は、低酸素ワークステーション内の空気で平衡化したことを確認するために、24時間指示された酸素の可用性に維持されています。 M 7 GTP結合アガロースビーズは、キャップ結合タンパク質を捕捉するために添加される前の入力レーン（IN...

ここでは、生理的酸素条件下でmRNAの5'キャップに結合する翻訳開始因子を分析するためのヒト細胞培養プロトコルを紹介します。この方法は、アガロース結合m7GTPキャップアナログを利用しており、キャップ結合因子とその相互作用パートナーの研究に適しています。

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

この実験の全体的な目標は、低酸素条件下でキャップ結合タンパク質を捕捉することです。この方法では、アガロース結合した7つのメチル-グアノシンキャップアナログを利用して、キャップ結合因子とその相互作用パートナーを調査します。この方法は、キャップ依存性翻訳に関与する新規の酸素調節因子の同定など、タンパク質合成の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞が溶解点まで低酸素ワークステーションに保持されることです。この技術の意味は、腫瘍内のがん細胞が非常に低レベルの酸素にさらされ、並進制御が腫瘍の進行に重要な役割を果たすため、がん治療にまで及びます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、Coronaの同僚が最近発表した論文で、組織の酸素化は、細胞が日常的に培養される正常酸素症ではなく、実際には低酸素症と呼ばれるものに近いと報告しているのを読んだときでした。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように細胞培養を開始します。血球計算盤を用いて細胞をカウントした後、150ミリメートルの培養皿に15ミリリットルの完全培地を含ませて、1平方センチメートル当たり2500〜5000細胞の細胞密度を得る。各キャップ結合アッセイに2つの150mmディッシュを使用します。播種した培養皿をインキュベーターに摂氏37度、二酸化炭素5%の雰囲気に置きます。細胞を少なくとも24時間インキュベートした後、細胞を低酸素ワークステーションに所望の時間置きます。次に、ワークステーションを適切な生理学に設定します。1つのXリン酸緩衝生理食塩水(PBS)とトリプシンを摂氏37度の水浴で30分間予温します。980マイクロリットルの溶解バッファーを1.5マイクロリットルの遠心分離チューブに分注し、各キャップ結合アッセイを行います。10マイクロリットルの100Xプロテアーゼ阻害剤カクテルと10マイクロリットルの4-ベンゼンスルホニルフッ化物ヒドロクロライドを氷上の980マイクロリットルの溶解バッファーに。各150mmディッシュからメディアを低酸素ワークステーション内の廃棄物容器に捨てます。次に、3〜4ミリリットルの温かい1X PBSで細胞を洗浄し、液体を捨てます。各皿に1ミリリットルの温かい05パーセントトリプシンEDTAを加え、皿を2分間、または細胞がプレートに付着しなくなるまで放置します。ピペットを使用して、1つのプレートの細胞を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。必要に応じて繰り返して、細胞の各プレートを別々の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。マイクロ遠心チューブを6000倍gで90秒間遠心分離し、細胞をペレット化します。遠心分離後、ペレットを乱さずにピペットを使用してトリプシンを吸引します。200マイクロリットルのPBSをペレットのすぐ上のチューブに優しくピペッティングすることにより、温かい1つのX PBSで細胞を洗浄します。次に、ペレットを乱さずにPBSを吸引します。次に、調製した1ミリリットルの溶解緩衝液から500マイクロリットルを第1の細胞ペレットにピペットで移します。ピペッティングを上下させて、ペレットを完全に再懸濁します。再懸濁した細胞を第2の細胞ペレットと結合し、ピペッティングで上下させて第2のペレットを再懸濁します。このプロセスを繰り返して、すべてのペレットを結合し、各サンプルに再懸濁します。次に、ライセートを残りの500マイクロリットルの溶解バッファーと1.5リットルのマイクロ遠心チューブに混ぜ合わせます。低酸素ワークステーションからサンプルを取り出します。サンプルを摂氏4度で1.5〜2時間回転させることにより、穏やかに攪拌して細胞を溶解します。インキュベーション後、溶解した細胞を1200倍gで摂氏4度で15分間遠心分離し、細胞の破片を除去します。ライセートを新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、ペレットを廃棄します。上清の一部をウェスタンブロット解析の全細胞ライセートインプットコントロールとして使用するために予約します。キャップ結合アッセイの準備には、ハサミを使用してピペットの先端を取り外し、ビーズスラリーの収集を容易にします。各サンプルについて、50マイクロリットルのブランクアガロースビーズコントロールスラリーと50マイクロリットルのm7GTPアガロースC10リンクビーズスラリーを別々の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。次に、スラリーを500倍gで30秒間遠心分離することにより、ビーズをペレット化します。上清を慎重に取り除き、ビーズをTBSの500マイクロリットルに再懸濁します。これらの手順を繰り返した後、ビーズを500倍gで30秒間ペレット化し、上清を取り除きます。次に、ライセートを含む上清をブランクアガロースビーズを含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。穏やかに攪拌しながら、摂氏4度で10分間インキュベートします。10分後、ブランクアガロースビーズを500倍gで30秒間遠心分離してペレット化します。遠心分離後、ビーズに結合しないライセートを、m7GTPアガロースC10結合ビーズが入った1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。ブランクのアガロースビーズを500マイクロリットルの溶解緩衝液に再懸濁し、500時間gで30秒間遠心分離してビーズをペレット化し、上清を廃棄します。これを4回繰り返して、合計5回の洗浄を行います。ブランクのアガロースビーズを1つのX SDS-PAGEサンプルバッファーに再懸濁します。そして、ビーズを摂氏95度で90秒間茹でます。サンプルを摂氏20度で保存し、将来のウェスタンブロット分析で、目的のタンパク質がビーズに非特異的に結合する天候を観察します。ライセートをm7GTPアガロースC10結合ビーズとインキュベートし、摂氏4度で1時間穏やかに攪拌し、キャップ結合タンパク質を捕捉します。攪拌後、m7GTPアガロースC10結合ビーズを500倍gで30秒間遠心分離してペレット化します。上清を捨てた後、前回と同様にm7GTPアガロースC10結合ビーズを洗浄します。ビーズを600マイクロリットルの溶解バッファーに再懸濁し、GTPを最終濃度1ミリモルまで添加します。m7GTPアガロースC10結合ビーズと1ミリモルGTPをインキュベートし、摂氏4度で1時間穏やかに攪拌します。これにより、m7GTPと非特異的に相互作用するタンパク質が解離します。m7GTPアガロースC10結合ビーズを500時間gで30秒間遠心分離してペレット化します。上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、200マイクロリットルの4つのXDS-PAGEサンプルバッファーを追加します。前回と同様にビーズを洗浄した後、ビーズを1つのX SDS-PAGEサンプルバッファーに再懸濁し、摂氏95度で90秒間煮沸します。ここに示されているのは、初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞の酸素変動に応答した2つの主要なキャップ結合タンパク質の典型的なm7GTPアフィニティー精製の代表的なウェスタンブロットです。細胞ライセートを8%、5%、3%、または1%の酸素に24時間ばく露しました。レーンには、全細胞ライセートの10%をインプットとして、m7GTPの特異性を測定するために洗浄されたGTP、およびGTP洗浄後にm7GTPビーズに結合したタンパク質が含まれます。少なくとも 3 つの独立した実験のデータを Image J によって定量し、全細胞ライセートの 10% のインプットに対する相対密度の単位として表しました。その結果、生理的酸素下で培養したヒト細胞は、2つのキャップ結合タンパク質を利用して、翻訳のために異なるmRNAを動員することが示されています。このビデオを見れば、低酸素条件下でキャップ結合タンパク質を捕捉する方法を十分に理解できるはずです。この手順を試みる際には、酸素がこれらの翻訳開始因子の生化学的特性を急速に変化させる可能性があるため、細胞を溶解点まで低酸素ワークステーションに保持することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、ポリソーム分画などの他の方法を実行して、低酸素条件下で活性翻訳と結合するキャップ結合タンパク質などの追加の質問に答えることができます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

呼吸計測の酸化的リン酸化の解析と組み合わせてサポニン透過処理繊維の調製物は、ミトコンドリアの機能の統合的な評価を提供します。生理的および病的状態におけるミトコンドリア呼吸はミトコンドリアの相互作用、形態および生化学を含む様​​々な規制の影響を反映することができます。...

サポニン透過性心臓繊維の呼吸計測の酸化的リン酸化の評価

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細胞培養で誘導し、低酸素のテスト

源：エレトラ・レオ1、ルイザ・H.D.カルドーゾ1、サビーヌ・シュミット1、エーリッヒ・グナイガー11オロボロス機器このビデオでは、酸素フラックスを使用して、生きているおよび透過処理された哺乳類細胞のミトコンドリア呼吸を評価する方法について説明します。これは、さまざまな呼吸状態を特徴付けるために、ジギトニン、代謝基質、ADP、アンカプラー、および阻害剤を順次使用することを実証しています。得られた酸素フラックスプロファイルは、定義された条件下でのミトコンドリア機能とエネルギー結合効率を明らかにします。...

生細胞および透過処理細胞におけるミトコンドリア呼吸を評価するための酸素フラックス測定

我々は、イメージングを用いて低酸素症のグローバルRNA合成の分析のための手法を記載している。 RNAのクリック化学標識は、以前は、低酸素下で実施し、単一細胞レベルでのグローバルRNAの変化の視覚化を可能にされていない。このアプローチは、世界的なRNA合成における細胞間の変更の直接可視化を可能にし、既存の平均化されたRNAの技術を補完します。...

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

ここで低酸素の条件の下で内因性の核蛋白質間蛋白質蛋白質の相互作用を研究する co...

低酸素の条件の下で培養された細胞から内因性の核蛋白質を用いた Co 免疫沈降試験

人間の大食細胞のプロテオーム署名を取得し、これをマクロファージ偏波に低酸素環境の影響の定量に適用するためのプロトコルを提案します。...

低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析

ここでは、心壁全体で吸光度分光法を行うために、心内光カテーテルを通して心臓に注入された心臓に使用する方法を紹介する。得られたデータは、組織の酸素張力に関する堅牢な情報だけでなく、基板利用と膜電位に関する堅牢な情報を、このユビキタスな調製における心臓性能測定と同時に提供します。...

浸透哺乳動物の心臓のトランスムラル吸光分光法を用いた細胞代謝モニタリングのための心臓内側発射光カテーテル

ここでは、分子状酸素を消費する能力とは無関係に、哺乳類細胞のミトコンドリア機能を直接測定するためのアッセイをまとめたものです。...

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

このプロトコルは、酸素供給のために設計された階層的に多孔質なUiO-66ナノ粒子の合成、ヘモグロビン封閉、表面PEG化について詳述しています。この手法は欠陥工学とひずみ促進バイオルソゴナル共役を組み合わせ、生物医学応用に適した透過性が高く生理学的に安定したキャリアを生成します。...

酸素供給用途における階層的多孔質UiO-66ナノ粒子における合成、ヘモグロビン封装および双直交PEG化

このプロトコルは、効率的に新たに単離されたヒト絨毛細胞栄養芽層でのsiRNAのトランスフェクションマイクロポを使用して、これらの細胞におけるDNA-タンパク質複合体を同定するための方法が記載されています。トランスフェクトされた細胞は、ウェスタンブロットによりモニターすることができ、EMSAは、4日間の培養期間中に分析します。...

新たに単離したヒト絨毛細胞栄養芽層に対するsiRNAトランスフェクションおよびEMSA分析

学ぶ、m7GTPアガロースビーズを用いた低酸素条件下でのキャップ結合タンパク質の捕捉法。ヒト細胞における翻訳開始因子の酸素応答性を解析し、がん治療への応用可能性を示す。

生理的酸素条件に曝露されたヒト細胞におけるキャップ結合タンパク質の解析

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