腫瘍関連血管系を使用しての生体顕微鏡が背高度な蛍光トランスジェニック マウスの皮下脂肪のウィンドウの部屋

このプロトコルの全体的な目的は、高度な背側皮下窓（dorsal skinfold chamber）を用いて、マウスモデルにおける腫瘍関連血管系の発達を詳細に調べることです。この手法は、治療法の改善や腫瘍進行の理解など、がん研究分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、生体内の適切な環境においてプロセスを研究できること、およびそれらのプロセスを経時的に観察できることです。

この手順は、私の研究室のシニアリサーチャーであるAnn Seynhaeve博士によって実演されます。非トランスジェニックのドナーマウスから、レシピエントマウスの背側ウィンドウチャンバーに移植するための、直径10 mmの非壊死腫瘍断片を採取します。同種移植（syngeneic tumor）の場合は正常なマウスドナーを、異種移植（xenograft）の場合は免疫不全マウスドナーを使用してください。

レシピエントマウスは、週齢12週以上かつ体重20g以上である必要があります。すべての手術操作は無菌条件下で行ってください。例えば、手術器具やチャンバー材料はオートクレーブ滅菌してください。

レシピエントマウスを鎮静させた後、電気バリカンで背面全体の毛を除去し、続いて除毛ジェルを使用します。皮膚を洗浄してすすぎ、乾燥させます。最後に、除毛した皮膚をエタノールで洗浄します。

次に、脊椎に沿って水平方向の中心線に印を付けます。その後、ビューウィンドウをその線から少なくとも 2 mm 下に配置し、皮膚上にウィンドウの外周線を書き込みます。次に、メスと鋏を使用して、下層の筋膜を傷つけないように注意しながら、外周線内の皮膚を慎重に除去します。

次に、皮膚を吊り上げ、イヤーパンチャーを使用して、ウィンドウを固定するボルト用の1 mmの穴をウィンドウ領域の両側に開けます。マウスの上にバックフレームを配置し、ボルトにナットを取り付けてフレームを固定します。続いて、皮膚をフレームの上に2～3 mm引き寄せ、適切にフィットしていることを確認します。

その場合は、23ゲージの針をフレーム上部の2つの縫合孔に通します。ナットを締めてフレームを固定し、クランプ付き持針器で保持します。このとき、ナットを締めすぎないようにし、ボルトの周りで皮膚が回転しないようにしてください。次に、針を縫合糸に交換し、フレームを皮膚に固定します。

次に、マウスを横に向けます。この角度から、厚いフィラーガラスと標準的な12 mmのカバーガラスを挿入します。筋膜がガラスに密着するように、リテーニングリングで両方を固定してください。

次のステップは、0.9% sodium chlorideを用いてウィンドウを水和させることです。視野領域に数滴垂らし、余剰分を吸い取ります。次に、ウィンドウの直下で、90度に曲げた25ゲージの針を使用し、1立方ミリメートルの腫瘍組織を保持できる深いポケットを筋膜に作成します。

次に、腫瘍組織をポケットに挿入します。最後に、標準的な12 millimeterのカバーガラスと固定リングを使用して、観察窓を閉じます。気泡が生じた場合は、1時間以内に消失します。

マウスを鎮静させる前に、特製の温度制御プラットフォームを37 °Cに温めておきます。マウスを鎮静させた後、温めたプラットフォームの上に配置します。イソフルランを投与するためにノーズコーンを取り付け、評価に5分以上かかる場合は、眼用軟膏を塗布してください。

次に、ウィンドウのボルトを使用してチャンバーを特製ホルダーに固定し、ホルダーをプラットフォームにしっかりと固定します。続いて、ガラスウィンドウを水と綿で清掃します。その後、顕微鏡を用い、明視野および蛍光光の下で10倍対物レンズを使用して、腫瘍内の血管新生を確認します。

肉眼検査後、共焦点レーザーをオンにします。顕微鏡のコントロールパネルを、スマートゲイン 100 volts/turn、スマートオフセット 10%per turn、ズームおよびX・Yポジショニングをmedium、Zポジショニングを 100 microns/turn に設定します。

取得モードをXYZまたはXYZTに設定します。解像度を選択し、取得速度として2または400 Hertzを選択します。

ピンホールを1 airy unitに設定します。そして、双方向X（bidirectional X）オプションを選択します。スペクトル範囲が重複する可能性がある複数の蛍光色素を評価する場合は、ブリードスルーを防ぐためにフレーム間のシーケンシャルスキャンを選択し、適切なビームパスを設定してください。

ライン平均値を4に設定し、最後に、実験用の新しいデータセットを選択します。次に、関心のある組織に焦点を合わせます。その際は、開口数（NA）の高いドライレンズを使用するのが最適です。続いて、ファストライブスキャンを用い、過剰露光が起こらないようにゲインとオフセットを調整して、可能な限り最高の信号対雑音比（S/N比）を確保します。

次に、取得（acquire）タブでZスタックを選択します。高速Zスキャンを行い、その高速スキャンの結果に基づいて、フルスキャンの開始位置と終了位置を決定します。

次に、ピンホール径に合わせてZステップサイズを設定し、フルスキャンを行います。蛍光ラベルを発現するホストマウスは、上述のプロトコルを用いて腫瘍移植後にイメージングされました。eNOStag-GFPラベルは、内皮細胞のゴルジ体および細胞膜で発現します。

ROSAmT/mGラベルは、普遍的に赤色蛍光を発し、Creリコンビナーゼを発現している細胞では緑色蛍光を発します。この技術の応用例の一つに、腫瘍内で血管形成の全段階が観察されるため、血管系の発達に関する研究が挙げられます。例えば、血管のない領域へと出芽する血管内皮細胞のフロント（先端）を観察することが可能です。

腫瘍には損傷した血管や、成熟した分枝血管を持つ確立された血管床も存在します。別の応用例としては、蛍光ナノ粒子などのラベルを血液に導入することで、管腔形成、血流、および血管外漏出を研究することが挙げられます。これにより、血管管の管腔内や内皮チップ細胞近傍における血流を観察することが可能です。

チップ細胞において、ルーメンの形成が観察されます。また、生体内顕微鏡を用いて化学療法剤の影響を調べることも可能です。例えば、eNOStag-GFP動物にナノ粒子を注入して24時間後、ナノ粒子は血管内に留まっており、腫瘍の間質への漏出は最小限でした。

しかしながら、ナノ粒子をTNFと組み合わせて投与すると、腫瘍の間質への血管外漏出が観察されました。これは、腫瘍内への薬剤送達が増加したことを示す証拠となります。このビデオを視聴することで、背側皮下窓室（dorsal skinfold window chamber）の設置方法と、共焦点顕微鏡を用いて腫瘍関連プロセスを研究する方法について十分に理解できるはずです。