腫瘍関連血管系を使用しての生体顕微鏡が背高度な蛍光トランスジェニック マウスの皮下脂肪のウィンドウの部屋

このプロトコルの全体的な目標は、高度な背側スキンフォールドチャンバーを使用して、マウスモデルで腫瘍関連血管系の発達を詳細に調べることです。この方法は、治療法の改善や腫瘍の進行の理解など、がん分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、プロセスが適切なコンテキストで、実際の生活で研究され、これらのプロセスを時間の経過とともに研究できることです。

この手順は、私の研究室の主任研究員であるAnn Seynhaeve博士によって実演されます。非トランスジェニックドナーマウスから、レシピエントマウスの背側窓室に移植するために、直径10mmの非壊死性腫瘍断片を採取します。同系腫瘍には正常なマウスドナーを、異種移植片には免疫不全マウスドナーを使用します。

レシピエントマウスは、生後12週間以上で、体重が20グラム以上である必要があります。すべての外科的処置を無菌条件下で実施します。たとえば、手術器具やチャンバー材料をオートクレーブします。

レシピエントマウスを鎮静した後、電動トリマーを使用して背側全体から脱毛し、脱毛ジェルを使用します。肌をきれいに洗い流し、乾かします。最後に、脱毛した皮膚をエタノールできれいにこすります。

次に、背骨に沿って水平の中心線をマークします。次に、ビューウィンドウを線から少なくとも2 mm下に配置して、ウィンドウの周囲にスキンに印を付けます。次に、メスとハサミを使用して、下にある筋膜を傷つけずに、周囲線内の皮膚を慎重に取り除きます。

次に、スキンフォールドを引き上げ、イヤーパンチャーを使用して、ウィンドウを所定の位置に保持するボルト用のウィンドウ領域の両側に1mmの穴を挿入します。背面フレームをマウスに置き、ナットをボルトに取り付けてフレームを固定します。次に、スキンをフレームの上で2〜3ミリメートル引っ張って、フィットすることを確認します。

その場合は、フレームの上部にある2つの縫合穴に23ゲージの針を突き刺します。ナットを締めてフレームを固定し、クランプニードルホルダーで保持し、ナットを締めすぎたり、皮膚がボルトの周りを回るのを防いだりしないでください。次に、針を縫合糸に交換して、フレームを皮膚に固定します。

次に、マウスを横に向けます。この角度から、厚いフィラーガラスと標準的な12mmカバーガラスを導入します。両方をリテンションリングで固定し、鼻隠しがガラスにしっかりと密着するようにします。

次のステップは、0.9%塩化ナトリウムを使用してウィンドウをハイドレートすることです。数滴がビューエリアに落ちるのを待って、余分なものを吸収します。次に、窓のすぐ下に、90度に曲がった25ゲージの針を使用して、筋膜に1立方ミリメートルの腫瘍組織を保持できる深いポケットを作ります。

次に、腫瘍組織をポケットに挿入します。最後に、標準の12ミリメートルカバーガラスとリテーニングリングを使用して、ウィンドウビューエリアを閉じます。気泡は1時間以内に消えます。

マウスを鎮静する前に、カスタムメイドの温度制御されたプラットフォームを摂氏37度に温めます。マウスを鎮静させた後、温めたプラットフォームに置きます。イソフルランを送達するためにノーズコーンを取り付け、評価に5分以上かかる場合は、眼科の予約を申請してください。

次に、窓のボルトを使用してチャンバーをカスタムメイドのホルダーにボルトで固定し、ホルダーをプラットフォームに固定します。次に、ガラス窓を水と綿で掃除します。次に、顕微鏡で、明視野光と蛍光灯の下で、10倍の対物レンズを使用して腫瘍の血管の発達を確認します。

肉眼検査の後、共焦点レーザーをオンにします。顕微鏡のコントロールパネルを1ターンあたり100ボルトのスマートゲインに設定します。1ターンあたり10%のスマートオフセット、ミディアムズームのXとYの位置、1ターンあたり100ミクロンのZ位置。

取得モードを XYZ または XYZT に設定します。解像度を選択します。取得速度は 2 ヘルツまたは 400 ヘルツから選択します。

ピンホールをエアリーユニット1台にセットします。そして、双方向Xオプションを選択します。スペクトル範囲が重複する可能性のある複数の蛍光色素を評価する場合は、フレーム間のシーケンシャルスキャンを選択してブリードスルーを防ぎ、正しいビームパスを設定します。

線の平均を 4 に設定し、最後に実験用の新しいデータセットを選択します。さて、そうすることに興味がある組織に焦点を当て、より高い開口数を持つドライレンズを使用するのが最善です。次に、高速ライブスキャンを使用して、ゲインとオフセットを露出オーバーのない場所に調整することにより、可能な限り最高の信号対雑音比を取得します。

次に、取得タブでZスタックを選択し、高速Zスキャンを行います。高速スキャンから、フルスキャンの開始位置と終了位置を決定します。

次いで、ピンホールサイズに従ってZステップサイズを設定し、フルスキャンを進める。蛍光標識を発現する宿主マウスを、記載のプロトコルを用いて腫瘍移植後に画像化した。eNOStag-GFP標識は、ゴルジ体および内皮細胞の細胞膜に発現します。

ROSAmT/mG標識は、Cre Recombinase発現細胞において赤色蛍光を遍在的に発現し、緑色蛍光を発現します。この技術の応用の1つは、腫瘍にすべての病期が見られるため、血管の発達の研究です。例えば、内皮前部が血管新生していない領域に発芽しているのが見られます。

腫瘍には血管が損傷し、成熟した分岐血管を持つ血管床が確立されています。別のアプリケーションは、蛍光を発するナノ粒子などの標識を血液に適用することにより、内腔形成、血流、および血管外漏出を研究することです。したがって、血流は血管管の内腔内および内皮先端細胞の近くで観察できます。

先端細胞では、ストックの内腔の形成が観察可能である。生体内顕微鏡検査は、化学療法剤の効果を調査するためにも使用できます。例えば、eNOStag-GFP動物にナノ粒子を注入してから24時間後、ナノ粒子は血管系内に留まり、腫瘍間質への血管外漏出は最小限に抑えられました。

しかし、ナノ粒子をTNFと組み合わせて投与すると、腫瘍間質への血管外漏出が観察されました。これは、腫瘍間薬物送達の増加の証拠です。このビデオを見れば、背側スキンフォールドウィンドウチャンバーの取り付け方法と、共焦点顕微鏡を使用して腫瘍関連プロセスを研究する方法を十分に理解できるはずです。