カエルの神経筋終末へのカルシウム色素の神経切片への積載：カエル神経筋接合部におけるカルシウムの一時的な位置合わせ

こんにちは、私の名前はDimitry Samigullinです私は、ロシア科学アカデミーのカザン生化学生物物理学研究所のシナプス過程の生物物理学研究室で働いています。私たちの研究室では、神経筋接合部におけるカルシウムシグナル伝達の広範な方法を研究しています。カルシウムのシナプスレベルを測定するための最も親しみやすい方法の1つは、光学記録です。

ここでは、カルシウム感受性染料を神経断端を介してカエルの神経終末にロードする方法について説明します。また、カエル末端の膨大なカルシウム過渡現象を測定し、分析するためのプロトコルを提示します。この方法を用いて、シナプス活動中のカルシウムのシナプス前レベルに対する活性薬物の影響を研究することが可能である。

染料ローディング溶液の調製。フルオレセインのカルシウム染料オレゴングリーンBAPTAは、少量の500マイクログラムの粉末を介して500マイクロリットルで提供されます。HEPESを含む14マイクロリットルの溶液を粉末に加えます。

ボルテックスローディング溶液を充填し、スピンダウンして完全に混合します。光の露出を避けるために、バイアルをローディング溶液でホイルで包みます。ローディング溶液はマイナス20°Cで冷凍庫に保管してください。

染料のローディング手順。動物から皮膚胸筋を解剖します。解剖した組織を銀の裏地付きペトリ皿に取り付けます。

細いステンレス鋼のピンでティッシュを伸ばします。リンガー溶液をペトリ皿に加えます。かみそりの刃を使用して、細い端から10マイクロリットルのピペットチューブの約2ミリメートルの小さな部分を切り取ります。

ペトリ皿に充填ピペットを保持するための粘土を準備します。充填ピペットをプラスチックシリンジでシリコンチューブとピペットチューブで作られたアダプターを介して接続します。プラスチック製のピペットでペトリ皿から一時的なリンガー溶液を取り除きます。.

シリンジで乾式調製します。これにより、充填ピペット内の溶液が吸引されるのを防ぐことができます。ローディング溶液を入れたバイアルを冷凍庫から取り出し、暗所で室温で解凍します。

細かいピンセットとはさみを使用して、目視制御の下で、滅菌顕微鏡を使用して、筋肉に近い神経を切断します。神経断端を約2ミリメートル残します。充填ピペットをチューブとシリンジで、粘土を使用してペトリ皿に固定します。

神経枝に近づけます。充填ピペットの神経断端を静かに吸引します。充填ピペットの鈍い端から吸引チューブを取り外します。

充填ピペットの神経断端を注射器で乾かします。神経断端で充填ピペットを上に移動します。ワセリンで神経断端を外側から分離します。

もう一度、シリンジで充填ピペットの神経断端を乾かします。長いピペットチップ付きのピペットを使用して、ローディング溶液のゼロ点5マイクロリットルを描画します。ローディング溶液を入れたピペットチップを充填ピペットにそっと挿入します。

混合物を直接神経断端に排出します。充填ピペットの開放端をワセリンで密封します。ペトリ皿に少量の溶液を加えます。

調製物を室温で暗く湿った場所で5時間インキュベートします。インキュベーション手順の後、調製物を取り、ローディング溶液の入った充填ピペットを取り出します。調製物を浴槽に入れ、リンガー溶液で洗い流します。

準備した状態でお風呂に入れ、摂氏8度の冷蔵庫で一晩保管します。顕微鏡検査用の組織を準備します。お風呂から準備を取ります。

銀色の裏地付きチャンバーに調製物をマウントし、組織をわずかに伸ばします。ティッシュを新しいリンガー液ですすいでください。吸引刺激電極を取ります。

刺激吸引電極をチャンバー内に配置し、その先端を神経の切断端に近づけます。神経を電極に引き寄せます。電極の構造はKhazokoffの記事で説明されており、記事へのリンクは資料にあります。

調製チャンバーを顕微鏡ステージに固定します。温度プローブを置きます。インフローチューブを準備チャンバー内のペルチェ素子用の電源コードで接続します。

アウトフローチューブを調製チャンバーに入れます。灌流ポンプをオンにします。コントローラーユニットという用語をオンにします。

コントローラーユニットの温度を摂氏20度に設定します。紫外線保護シールドを取り付けます。スティミュレーターの遅延時間と期間を設定します。

吸引電極からのワイヤーを刺激装置に接続します。オンにします。低倍率の対物レンズの下で、刺激をオンにして筋肉の収縮を確認します。

低カルシウムと高マグネシウムのリンガー液で灌流システムを満たします。灌流速度を毎分約2ミリリットルに設定します。対物レンズを40倍の倍率で交換します。

ポリクロームV.Select発光波長と連続モード照明をオンにします。シャッターを開ける対物レンズの倍率40倍以下では、蛍光モードでは、照明が端子に負荷がかかっていることを確認します。

ターミナルを見つけて、それに焦点を合わせます。負荷がかかった神経と十分に負荷がかかった運動神経終末が図に表されています。Red-Short Neuro CCDカメラによるビデオキャプチャ。

Turbo-SMソフトウェアを実行します。[設定の変更] を選択します。入力フレーム数は500です。

実験の名前を入力します。基本構成は 1000 フレーム/秒です。80 x 80。

外部トリガーを選択します。プリトリガー時間を入力します。マイナス 10 ミリ秒。

繰り返し回数 20 を入力します。Polychromeソフトウェアで、外部トリガー照明モードを選択します。Clampexソフトウェアを実行します。

負荷刺激プロトコル。このプロトコルは、カザン連邦大学のウェブサイトの研究室ページからダウンロードできます。録画する前に、Turbo-SMソフトウェアで暗いフレームをキャプチャします。

三眼キューブで、光路交換レベルを選択します。カメラの場合は 100%。刺激プロトコルを実行します。

関心領域を選択し、信号を確認します。神経刺激に応答して、神経終末へのカルシウムの侵入を反映した蛍光強度の変化を記録します。データ分析。

Turbo-SMソフトウェアで、ファイルを選択します。次に、平均ファイルを選択します。ファイルを選択します。

平均的なファイルの名前を入力し、それらを平均化します。平均ファイルをフィットファイルとして保存します。選択し、フィットファイルとして保存します。

ファイル名を入力して保存します。Image Jを実行し、以下の機器を開きます。分析、ツール、ROIマネージャー。

保存された平均ファイルを適切な形式で見つけます。Image Jにドラッグアンドドロップして、ウィンドウをズームして見やすくします。背景と思われるものよりも長方形の関心領域を選択します。

ROI マネージャーに追加します。ROI マネージャーで、 [その他] を選択します。マルチメジャー。ロードダウン平均。

データをコピーし、Excelにエクスポートします。Excelでは、平均関数を使用して、比率の背景の平均値を計算します。Excelを閉じずに、画像J.保存せずにバックグラウンド計算でウィンドウを閉じます。

ROIマネージャーを使用して、長方形の背景図面を削除します。インストゥルメントプロセス、数学、減算を開きます。Excelから計算された閾値の平均値を入力し、スタックから地盤を差し引きます。

神経終末の周囲の長方形の関心領域を選択します。ROI マネージャーに追加します。ROI マネージャーで、さらに、マルチメジャー、ロードダウン、平均を選択します。

Excelウィンドウにコピーして貼り付けます。Excelのインストルメントプロットグラフを使用します。信号を開始する前に、フラットな領域を選択します。

残りの蛍光の最初の値から信号の開始までの詳細をグラフに読み込みます。次に、平均静止蛍光値に対するポイント数を決定します。これらの値を平均化し、残りの蛍光の平均数を求めます。

残りの部分で信号を蛍光で除算します。1 を引いて 100% を掛けます。信号をプロットし、カルシウム過渡現象の振幅を計算します。

蛍光シグナルの時間パラメータは、カルシウム-色素-錯体形成の順反応およびまたは逆反応の速度に依存します。カルシウムシグナルの立ち上がり時間は、カルシウム入力のダイナミクスを表しています。それは末端での拡散、およびカルシウムと染料との相互作用です。

カルシウムトランジェントの崩壊は、色素の親和性とカルシウム緩衝剤の速度、およびその回収に依存します。カルシウムの過渡振幅の分析は、神経伝達物質の放出に関与するカルシウム入口に対するさまざまな活性物質の影響を研究するために使用できます。このローディング技術は、細胞質カルシウムの変化のイメージングによく適しています。

蛍光インジケーターと単一神経刺激、およびリズミカルなシナプス活動の両方を備えています。カルシウムの過渡振幅の分析は、神経伝達物質の放出に関与するカルシウムの侵入に対するさまざまな物質の影響を研究するために使用できます。注意したい重要なポイントがいくつかあります。

インキュベーションの手順には2つのステップがあります。室温で、冷蔵庫でインキュベートします。室温で色素とのインキュベーション時間を制御することが重要です。

神経断端の長さ、染料、室内の温度によって、インキュベーション時間は異なる場合があります。手術前の端子や神経断端に近い近位部分を露出しすぎると、過負荷になる可能性があります。冷蔵庫でのインキュベーションが長いため、染料は神経終末に沿って均一に分布しています。

切断後数分以内に神経を染料ローディング溶液に入れることが不可欠であり、これは、おそらく閉じた神経を受け取るため、時間間隔が長いと効果のないローディングが発生するため、染料が神経に入るようにします。染料のコンパートメント化を減らすために、染料の拡張形態を使用することが可能です。組織の長時間の蛍光照明を防ぐことは、組織の生存に影響を与えるため、非常に重要です。

可視光チャネルにノマルスキー光学系を使用して、端末を探索します。録画中は、ダイヤフラムによって照らされた視界を制限します。神経のシャッタースタンプにより、長時間のローディング処理を短縮することができます。

この場合、ガラスマイクロバイパスを使用できます。