Name: 異種非含有条件下での3次元培養における治療間葉系幹/間質細胞の生産と管理（MSC）スフェロイドプライム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 学ぶ異種非含有条件下でのMSCスフェロイドの生成と腹腔内投与法。ハンギングドロップ法を用いた3次元培養により細胞保持性と機能性を向上させ、再生医療への臨床応用可能性を高める革新的プロトコルを解説する。

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この作業は、国立衛生研究所からの助成金P40RR17447とテキサス州癌予防研究所からの賞RP150637によって部分的に資金提供されました。このプロジェクトへのご支援をいただいたDarwin J. Prockop博士に感謝いたします。

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

いくつかの研究及び臨床用途に使用するための最適なMSCは非常に彼らの利益を最大化するために活性化され、好ましくは例えばFBS等の異種培地成分からの潜在的な抗原の送達を最小限にするために、化学的に定義されたXF条件下で調製されるべきです。ここに記載されたプロトコルでは、1の方法を示している）2）3）、それらの抗に関しては回転楕円体のMSCの活性化レベルを評価し、XF条件下でのMSCの3D活性化を達成するため、スフェロイドを形成することによって、3D培養におけるMSCを活性化します炎症、免疫調節、および抗がんの可能性、および4）マウスに、完全なスフェロイドなどの活性化MSCを提供します。 MSCは、骨髄および脂肪組織を含む多数の成体組織からプラスチック接着によって単離することができる多能性幹細胞です。 MSCは容易に表面マーカーの異なる組を表す、比較的高い（10~20％）FBS濃度の下で組織培養プラスチック上で増殖され、そして脂肪生成、骨形成、および軟骨形成系譜<sup class="xref...

間葉系幹細胞/ストローマ細胞（MSC）は、様々な再生医療のアプローチのための大きな可能性を示しています。 MSCは、最初は、骨髄の間質成分として単離したが、以降、脂肪組織1、2、3を含む多数の他の成体組織から得られました。興味深いことに、メイン単離方法は、ウシ胎児血清（FBS）の存在下で組織培養プラスチックにしっかりと付着するMSCの顕著な特性を包含する。この伝統的な分離技術は、2次元（2D）培養中のMSCの簡単かつ急速な拡大を可能にする一方で、それはまた、非常に人工的であり、重要な細胞特性4の潜在的な損失につながるネイティブ3次元（3D）環境の重要性を無視し、5 、6。したがって、3次元培養におけるMSCの研究では、どの従来の2D培養液より生理的であり、MSCの特性を「減少/失われた」の検索で浮上しています。また、大きな関心は、異種非含有（XFに）MSC培養および活性化のための化学的に定義された条件を特定し、ひいては臨床応用のための細胞がより容易にするために上昇しています。 多くの研究は、生体材料に、球状凝集体またはスフェロイドとして両方のMSCの3D培養を実証公開されています。 MSCのスフェロイド培養物は、前臨床または臨床試験における治療のための細胞の投与後の生体内での MSCの挙動を理解する方法として見られたのに対し、生体材料中のMSCは、最初に、細胞を播種した足場で損傷した組織を置き換えるために組織工学的アプローチのために設計されました4、5、7。興味深いことに、MSCのフォームスフェロイドは自発的に組織培養プラスチックへの付着は認められていないとき8、9、10。伝統的に、細胞凝集は、スピナーフラスコ法または液体オーバーレイ技術、腫瘍微小環境を模倣しようとする努力において、癌生物学において最初に使用される方法によって容易にしました。より最近では、追加の方法は、細胞へのプラスチック接着4、5、6を防止するために特定の化学薬品で予めコーティングした培養皿に細胞凝集を示すこと浮上しています。 MSCスフェロイドを生成するための最も単純で経済的な方法の一つは、多くの場合、胚性幹細胞から胚様体を生成するために使用された技術、懸滴培養それらです。ドロップ培養技術をぶら下げて、組織培養プラスチックへの細胞接着は、組織培養皿の蓋の下側に媒体の液滴で細胞を懸濁させ、重力が細胞aggregを促進させることによって防止されますドロップの頂点でエーション。スフェロイドの大きさを容易に制御することがハンギングドロップ培養は、特に容易にする、細胞濃度または滴体積を変えることによって操作することができます。 MSCの3D培養に関する初期の研究では、対応する2D 6、8、9と比較して、3Dでの細胞の特性のラジカル違いを実証しました。同時に、レポートは、 インビボでのMSCの有益な効果は、微小環境の合図によって活性化され、反応して、抗炎症性および免疫調節11因子生成するためになる能力に頼っていることを実証しました。興味深いことに、そのようなプロスタグランジンE2（PGE2）などのこれらの因子の多くは、腫瘍壊死因子刺激遺伝子6（TSG6）、および肝細胞増殖因子（HGF）のための道を開く従来の2DのMSCよりMSCスフェロイドによってはるかに大量に生産されましたのアイデア細胞8、12、13を活性化するために、3D培養物を使用して。また、3次元培養における遺伝子活性化は、マウス12への注入後に少なくとも部分的に、細胞活性化の、メカニズムを再現するように見えました。 インビボでの伝統的なMSCの効果は、多くの場合、遅延、過渡、および「ヒットして実行」と記載することができるされているように、実験での使用の前にMSCを活性化することによって、細胞の効果を延長し、より目立つことができます。過去数年の間に、MSCスフェロイドを用いて重要な機能的研究は、これらが炎症反応を抑制し、そのようなスフェロイドをプライミングしたMSC 2の魅力的な形を作る、マクロファージ、樹状細胞、好中球、およびT細胞などのエフェクター細胞に影響を与えることによって、in vivoで免疫を調節することができることが実証されています、3。また、intなどの抗癌分子の産生erleukin-24（IL-24）および腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）は、MSCを単層にMSCの相対的な3次元培養で標的癌治療8、10、14のために利用することができる現象が増加します。 組織培養プラスチックの使用だけでなく、FBSのみならず、必要な従来のMSC培養物として、臨床使用のためにMSCのスフェロイドをより容易にする別のハードルを克服しなければなりませんでした。この障害に取り組むために、我々は最近、特定の下MSCスフェロイドの形成は、化学的にXFの条件を定義し、得られたMSCのスフェロイドをFBS 14との条件で生成されたスフェロイドのような抗炎症同じと抗癌分子を生成するために活性化されたことが確立さを示しました。ここでは、これらの知見は、XFを使用して3D培養物で予め活性化MSCの生成を実証するいくつかの詳細なプロトコールに提示されていますメディア。また、プロトコルは共にマウスに完全な球状体を送達するための実用的な方法で、それらの抗炎症性、免疫調節性及び抗癌効果に関しては、MSCの活性化レベルを評価するための効果的な方法を説明し、その提示されています。

<table><tbody><tr><td>MEM-&alpha;(最小限の必須ミディアムアルファ)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>12561049; 12561056;</td><td>MSC成長培地(CCM)</td></tr><tr><td>FBS(ウシ胎児血清)、プレミアムセレクト</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11595の調製のための最小限の必須培地12561072。S11510;S11550;S11595-24</td><td>全種類の細胞用完全培養培地の成分</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>25030081; 25030149; 25030164</td> すべての<td>種類の細胞用の完全培養培地の成分</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>15070063</td><td>全タイプの細胞用完全培養培地の成分</td></tr><tr><td>滅菌フィルターユニット、0.22 & マイクロ;m PESメンブレン</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCGPU01RE;SCGPU02RE;SCGPU05RE;SCGPU10RE;SCGPU11RE</td><td>培地滅菌</td></tr><tr><td>150 mm 細胞培養ディッシュ</td><td>Nunc</td><td>D8554&nbsp;SIGMA</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>Thermo Forma water-jacketed CO2加湿インキュベーター</td><td>Thermo Fisher</td><td>Model 3110</td><td>培養細胞のインキュベーション</td></tr><tr><td>早期継代MCSs</td><td>成体幹細胞の調製と分配のためのセンター テキサスA&M Health Science Center College of Medicine スコット&再生医療研究所</td><td></td><td>MSCの2Dおよび3D培養の白色NA調製 MSCウォーター</td></tr><tr><td>バス</td><td>VWR</td><td>89501-468</td>加<td>温培地 37°C;C</td></tr><tr><td>ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>492000904</td><td>手動リキッドハンドリング</td></tr><tr><td>ピペットエイド</td><td>ドラモンド サイエンティ</td>フィック <td>カンパニー 4-000-300</td><td>ハンドリング セレオロジーピペット</td></tr><tr><td>Costar 滅菌血清ピペット (5、10、25、50 ml)</td><td>コーニング</td><td>4487; 4101; 4251; 4490</td><td>リキッドハンドリング</td></tr><tr><td>PBS (リン酸緩衝生理食塩水), pH 7.4</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>10010023; 10010072;10010031;10010049</td><td>細胞培養処理</td></tr><tr><td>0.25%トリプシン/EDTA溶液</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>25200056; 25200072; 25200114</td><td>接着細胞の持ち上げと細胞凝集体の分散</td></tr><tr><td>15 ml コニカルチューブ</td><td>Corning/BD Falcon</td><td>352097</td><td>細胞遠心分離</td></tr><tr><td>50 ml コニカルチューブ</td><td>Corning/BD Falcon</td><td>352098</td><td>細胞遠心分離機</td></tr><tr><td>Eppendor 冷蔵遠心分離機</td><td>Eppendorf/Fisher Scientific</td><td>Model 5810R</td><td>細胞遠心</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Fisher Scientific</td><td>26716</td><td>細胞計数</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154 血</td><td>球計算計での細胞計数中の SIGMA 死細胞排除</td></tr><tr><td>Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>A1067501</td><td>ヒト間葉系幹細胞の増殖と拡大のために特別に配合されたゼノフリー培地</td></tr><tr><td>定義されたゼノフリーMSC培地-2(XFM-2)</td><td>幹細胞技術</td><td>5420</td><td>ヒト間葉系幹細胞</td></tr><tr><td>HSA(ヒト血清アルブミン)</td><td>ジェミニ</td><td>800-120</td><td>ゼノフリーMSC培地</td></tr><tr><td>の成分 rHSA(組換えヒト血清アルブミン)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9731&nbsp;ゼ</td><td>ノフリーMSC培地のSIGMAコンポーネント</td></tr><tr><td>トータルRNA単離ミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>トータルRNA抽出</td></tr><tr><td>Qiashredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>トータルRNA抽出前のサンプル均質化</td></tr><tr><td>RNAseフリーDNaseセット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>全RNA抽出中のオンカラムDNA除去</td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>M6250&nbsp;</td><td>RLTバッファー中のRNAsesのALDRICH阻害</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td>ミキシングサンプル</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>Biorad</td><td>NA</td><td>RNAの濃度と品質</td></tr><tr><td>大容量cDNA逆転写キット</td><td>サーモフィッシャー/アプライドバイオシステム</td>ズ <td>全RNAのcDNAへの転写</td><td>4368814</td></tr><tr><td>遺伝子発現アッセイ</td><td>サーモフィッシャー/アプライドバイオシステム</td><td>リアルタイムPCR用のプライマー/プローブの組み合わせ</td><td>を変化</td>させます</tr><tr><td>高速ユニバーサルPCRマスターミックス</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>4352042; 4364103; 4366073; 4367846</td><td>リアルタイムPCR反応用マスターミックス</td></tr><tr><td>リアルタイムPCRシステム (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)</td> <td>ABI Prizm</td><td>NA</td><td>リアルタイムPCR</td></tr><tr><td>1.5 ml 遠心分離管</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>細胞の遠心分離、サンプル収集および保存</td></tr><tr><td>(-80 &deg;C) 冷凍庫</td><td>サーモフィッシャー</td><td>モデル サーモフォーマ 8695</td><td>サンプル保存</td></tr><tr><td>PGE2 (プロスタグランジン E2) ELISA キット</td><td>R&D系</td><td>KGE004B</td><td>試料</td></tr><tr><td>DMEM(Dulbecco'ThermoFisher</td><td>/Gibco</td><td>10566-016; 10566-024;10566-032</td><td>マクロファージ培地</td></tr><tr><td>J774 マウスマクロファージ</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>マウスマクロファージ細胞株</td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3513</td><td>in vitro マクロファージ刺激</td></tr><tr><td>LPS(リポ多糖)</td> <td>Sigma-aldrich</td><td>L4130</td><td>in vitro マクロファージ刺激</td></tr><tr><td>マウス TNF-a ELISA キット</td><td>R&D Systems</td><td>MTA00B</td> サンプルマウスIL-10(インターロイキン10)ELISAキットR&のサイト<td>カイン濃度の推定</td></tr><tr><td></td><td>D Systems</td><td>M1000B</td><td>サンプル中のサイトカイン濃度の推定</td></tr><tr><td>RPMI-1640 培地</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>11875-085</td><td>脾細胞培養培地</td></tr><tr><td>BALB/c マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>651</td><td>in vivo スフェロイド送達; 脾臓細胞の調製</td></tr><tr><td>抗マウス CD3e 機能グレード 精製</td><td>eBioscience</td><td>145-2C11</td><td>in vitro脾細胞刺激</td></tr><tr><td>70 &mu;mストレーナー&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>脾細胞調製</td></tr><tr><td>赤血球溶解液 (1x)</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>00-4333</td><td>脾臓細胞単離中の赤血球の除去</td></tr><tr><td>マウス IFN-&#947;(インターフェロンガンマ)ELISAキット</td><td>R&D Systems</td><td>MIF 00</td>によるサンプルLNCaP前立腺癌細胞<td>中のサイトカイン濃度の推定</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1740</td> がん<td>細胞株に対する 3D MSC の効果の研究 in vitro</em</td></tr><tr><td>>DNA ベースの細胞増殖アッセイキット</td><td>ThermoFisher</td><td>C7026</td><td>DNA 含有量に基づく細胞数測定</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>溶解試薬</td></tr><tr><td>の成分 EDTA (エチレンジアミン四酢酸)</td> <td>ThermoFisher</td><td>FERR1021</td><td>カルシウムキレート剤、DNAの測定のための溶解試薬</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>RNA分解</td></tr>の成分 <tr><td>フィルターベースのマルチモードマイクロプレートリーダー</td><td>BMGテクノロジーNA</td><td></td><td>マイクロプレートアッセイ(ELISA、細胞定量、など)</td></tr><tr><td>HBSS(ハンクス平衡塩溶液)、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドを含まない</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>14175079</td><td>in vivo注射前のMSCスフェロイドの蘇生</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>MWI獣医</td><td>in vivo注射のための麻酔</td><td>502017</td></tr>供給 <tr><td>酸素、圧縮ガス</td><td>Praxair</td><td>NA</td><td>イソフルランで使用するため</td></tr><tr><td>サーモフォーマ BSL-2キャビネット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>モデル1385</td><td>滅菌細胞培養</td></tr><tr><td>安全性I.V.カテーテル/ニードルスティレット、 20 G、1インチ</td><td>テルモ</td><td>SR*FNP2025</td>腹腔<td>内へのシュペロイドの送達</td></tr><tr><td>滅菌マイクロピペットチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>は液体</td><td>/細胞の取り扱い</td>が異なります</tr></tbody></table>

異種非含有条件下での3次元培養における治療間葉系幹/間質細胞の生産と管理（msc）スフェロイドプライム

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

間葉系幹細胞/ストローマ細胞（MSC）は、生体工学や再生医療に大きな約束を保持します。 MSCは組織培養プラスチックへの強い付着を介して複数の成体組織から単離し、次いで、さらに最も一般的にウシ胎児血清（FBS）を使用して、 インビトロで増殖することができます。 FBSは、MSCは、免疫原性になる可能性がありますので、MSC培養物におけるその存在は、細胞の臨床的および実験的なアプリケーションの両方を制限します。したがって、MSC培養のために化学的に定義された異種非含有（XF）メディアを用いた研究は非常に価値があります。 MSCの多くの有益な効果は、主に腫瘍壊死因子刺激遺伝子6（TSG6）及びプロスタグランジンE2（PGE2）などの免疫調節因子の分泌を介して、炎症及び免疫を調節するそれらの能力に起因しています。しかし、MSCは、これらの要因を生成するために活性化を必要とMSCの効果は、多くの場合、一過性であるため、大きな関心は、事前活性化細胞PRIOの方法を発見するために浮上していますそれらの使用rは、このように生体内での活性化のためのタイムラグを解消します。ここでは、3次元（3D）培養液で効率的に活性化するためのプロトコルやプライムMSCを提示します 化学的に定義されたXFの条件下で生体内でのこれらの予め活性化MSCを投与します。具体的には、まずXF培地を用いて球状MSCマイクロ組織または懸滴の「スフェロイド &#39;を生成し、球及び馴化培地（CM）は、様々な用途のために収穫することができる方法を示すための方法を説明します。第二に、我々は、遺伝子発現の画面を説明し、 インビトロでの機能アッセイは、迅速に細胞の抗炎症性及び抗癌の可能性を強調し、スフェロイドにおけるMSCの活性化のレベルを評価します。第三に、我々は、in vivo効力試験のためのマウス腹腔内にそのままMSCスフェロイドを注入する新規な方法を説明します。全体的に、プロトコルは、本明細書中で化学的に定義されたXF詐欺の下で予め活性化MSCを取得する主要な課題を克服しますditionsとは、治療のためのMSCスフェロイドを管理するための柔軟なシステムを提供します。

現在の研究では、ハンギングドロップ培養は、コンパクトな球状のミクロ組織またはXF条件下で活性化されたMSCの「スフェロイド」を生成するために使用しました。 図1の治験ロードマップは、MSCは、スフェロイド、またはCMが球由来の治療因子を装填した後、自己集合72時間懸滴中に懸濁させたときにスフェロイドにに奨励されていることを示して、収集され、潜在的の両方で利用することができます研究と臨床応用。球産生のために必要とされる多数のセルは、1cm 2当たり100〜200セル、典型的には、低密度でMSCを播種することにより、一週間以内に取得し、その後約80％コンフルエント（ 図2になるまで6-7日間、細胞を増殖することができ）。細胞増殖動態は、日々の生存細胞を計数することによって決定さ、堅牢な拡大期（日3-7）1-2日の短い誘導期（ 図2Cを&lt;以下のことが示されました/強いです&gt;）。継代2または3のMSCは、典型的には、CCMで培養百万凍結保存細胞の...

間葉系幹細胞/間質細胞(MSC)の治療可能性は十分に文書化されていますが、患者のために細胞を準備する最善の方法は依然として議論の余地があります。ここでは、実験的および臨床的な応用のために、ゼノフリー条件下でプライミングされたMSCの治療用球状凝集体または「スフェロイド」を効率的に生成および投与するためのプロトコルを伝達します。

異種非含有条件下での3次元培養における治療間葉系幹/間質細胞の生産と管理（MSC）スフェロイドプライム

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

これらの一連の実験の全体的な目的は、実験的および臨床的な応用において、ゼノフリー条件下でプライミングされた間葉系幹細胞/ストローマ細胞（MSC）の治療用球状凝集塊、すなわちスフェロイドを効率的に作製し、注入することです。これらの手法は、分散して投与された細胞の移植後にしばしば見られる、細胞保持率の低さ、生存率および機能性の低下、ならびに組織損傷に一般的に伴う不良条件といった、MSC治療分野における主要な障壁の克服に寄与します。これらの手順の主な利点は、FBSなどの免疫原性のある動物由来製品を使用せずに、MSCスフェロイドを調製、プライミング、および注入できることです。こうした製品は、現在、細胞のいくつかの臨床応用を制限しており、一部の前臨床データの解釈を混乱させる可能性もあります。このメカニズムは、MSCベースの有効性を媒介する上で潜在的に非常に有益ですが、MSC介在性の組織修復の理解や、他の培地処方が治療上の遺伝子プラスをどのように変化させるかを理解するためにも利用できます。これらの手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるJosh BeaverとBret Cloughの2名です。テキストプロトコルに従って間葉系幹細胞を播種およびインキュベートした後、トリプシンおよびEDTAを用いて細胞を回収します。回収した細胞を450 ×gで遠心分離し、すべての細胞を適切な培地とともに単一のコニカルチューブにまとめます。細胞を遠心分離し、ペレットを少量の培地で再懸濁します。その後、細胞数をカウントし、約25,000個の細胞からなるスフェロイドを形成させるため、回収したMSCを以下のいずれかの培地を用いて714 cells/µLに希釈します。次に、細胞を35 µLずつ、150 mmの倒立培養ディッシュの蓋の裏側に滴下します。室温のPBS 20 mLをディッシュの底部に移し、滴下した細胞が下を向くように、一つの連続した安定した動作で蓋を反転させます。その後、蓋を培養ディッシュの底部に慎重に載せます。適切なスフィア形成を促すため、ディッシュをインキュベーターに移し、動かさずに3日間静置します。インキュベーション後、慎重に蓋を取り外し、液滴が再び上を向くように反転させて、スフェロイドの回収を開始します。次に、蓋を約10～20度に傾け、セルリフターを用いてスフェロイドを含む液滴をプレートの端まで押し出します。1 mL ピペットを使用して、スフィアの回収培地を 15 mL コニカルチューブに移します。その後、室温の PBS と同じピペットチップを用いてプレートを洗浄し、スフェロイドを最大限に回収します。リアルタイム PCR アッセイを行う場合は、スフィア懸濁液を室温で 450 ×g、5 分間遠心分離します。次に、上清を吸引除去します。PBSを用いてスフェロイドを洗浄し、遠心分離と吸引のステップを繰り返します。動物への投与を行う場合は、遠心分離を行わずにスフェロイドをチューブの底に沈殿させます。免疫調節能および抗がん活性の解析に向けた条件培地（CM）を回収するには、先ほど示したようにセルリフターとピペットを用いて、スフェロイドとCMを15 mLコニカルチューブに回収します。ただし、蓋をPBSで洗浄しないでください。450 ×gで5〜10分間遠心分離した後、上清を1.5 mLチューブに移します。この上清を、室温、10,000 ×gで5〜10分間遠心分離します。次に、ピペットを用いて清澄化したCMを慎重に回収し、新しい1.5 milliliterチューブに移して-80 °Cで保存します。このビデオで示した通りにスフェロイドを調製し、チューブの底に沈殿するまで3〜4分待機した後、上清を吸引し、xeno-free条件を維持するために0.2〜0.5% HSAを添加したHBSSを加えてスフェロイドを洗浄します。続いて、上清を吸引します。スフェロイドに100から200 µLの滅菌済みHBSS/HSAを重ね、チューブを氷上に置きます。テキストプロトコルに従ってマウスを麻酔した後、動物をBSL-2キャビネット内に背側を下にして配置し、70%エタノールでマウスの下腹部を消毒します。20ゲージ静脈留置カテーテルのキャップを取り外し、片手でマウスの皮膚を保持しながら、屈曲した膝関節と生殖器領域を結ぶ仮想線の中央を確認します。カテーテル針の先端を正中線に向けて、もう一方の手で腹腔内注射を行います。カテーテルスタイレットアセンブリから、金属製のスタイレット針をそっと抜きます。スタイレットに血液、尿、糞便が付着していないかを確認し、廃棄してください。100 µLの滅菌HBSS/HSAを入れた100〜200 µLピペットチップをカテーテルシリンジアダプターに挿入し、密閉して、プラスチックカテーテルが適切に配置されていることを確認します。次に、腹腔内にゆっくりと液体を注入します。100～200 µLのピペットチップを用いて、MSAスフェロイドとHBSS/HSAを回収し、今示したようにカテーテルを通して全量を腹腔内に移します。続いて、100 µLのHBSS/HSAでスフェロイドが入っていたチューブを洗浄し、その全量を腹腔内に移します。消毒液に浸したガーゼをカテーテルに当て、腹腔内からゆっくりとカテーテルを抜去して廃棄します。カテーテルにスフェロイドが残っていないか確認してください。その後、指で腹腔内を優しくマッサージし、スフェロイドが均一に分布するようにします。マウスへのスフェロイド投与直後、注入用に調製したスフェロイドの活性化レベルを評価するため、40～120個のスフェロイドを、2% FBSおよび1X penicillin streptomycinを添加したAlpha MEM 1～2 mLを含む12ウェルまたは6ウェルプレートのキャセッターに移します。6時間後、ウェルから培地を1.5 mLまたは15 mLチューブに移し、室温で450 ×gで5分間遠心分離します。最後に、上清のCMを新しい1.5 mLチューブに移し、市販のELISAキットを用いてプロトコルの通りにPGE-2濃度を測定します。ここで示されているように、約25,000個のMSCを35 µLのCCMの液滴中に懸濁させると、細胞はまず小さな凝集体を形成し、最終的に72時間後には液滴の頂点に単一の緻密な球体を形成します。この図は、単一の緻密な球体およびXFM-1の形成には、CCMにおける推定総タンパク質含有量を反映した濃度である13 mg/mLのHSAの添加が必要であることを示しています。球体の形成過程においてMSCの表現型は劇的に変化し、適切に化学的に定義されたゼノフリー培地中では、PGE2やTSG6を含む多数の抗炎症因子の発現がアップレギュレートされます。しかしながら、HSAを含まないXFM-2またはXFM-1でスフィアとして培養したMSCでは、TSG6およびPGE2の産生は著しく増加しません。最後に、in vitroでの効果と同様に、LPSの静脈内投与による全身性炎症の誘導直後に、XFM-1 HSAスフィアをマウスの腹腔内に注入したところ、腹腔内のPGE2およびIL-10レベルが上昇し、一方で炎症性サイトカインであるTNF alphaが減少しました。この手法を習得すれば、ハンギングドロップのプレート1枚を1〜2分で準備することが可能です。適切に実施すれば、無傷のスフェロイドの腹腔内投与は動物1匹あたり5～10分で完了できます。吊り滴法を用いてMSCスフェロイドを作製する場合、スフェロイド形成および治療遺伝子の発現増強に関して、使用するxeno-free培地の組成によって結果が異なる点に留意することが重要です。本手順の後、共焦点顕微鏡などの他の手法を用いることで、スフェロイド内におけるMSCの構成や、スフェロイドの異なる部位で活性化している可能性のある追加のシグナル伝達経路を解析することができます。この開発後、この手法によりMSC研究者は、他の3D培養条件がMSCのプライミングおよび治療遺伝子の発現にどのように影響するかを研究することが可能になりました。このビデオを視聴することで、ハンギングドロップ法を用いてMSCをスフェロイドとしてプライミングする方法、in vitroでその治療有効性を評価する方法、およびin vivoでの有効性試験のために、無傷のスフェロイドをマウスに効率的に導入する方法について十分に理解できるはずです。また、成人ヒト幹細胞の取り扱いには特別な設備とトレーニングが必要であり、細胞が適切に扱われない場合は危険を伴う可能性があることに留意してください。成人ヒト幹細胞を扱う際は、常に適切な個人用保護具（PPE）を着用してください。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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異種非含有条件下での3次元培養における治療間葉系幹/間質細胞の生産と管理（MSC）スフェロイドプライム

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