異種非含有条件下での3次元培養における治療間葉系幹/間質細胞の生産と管理（MSC）スフェロイドプライム

これらの一連の実験の全体的な目的は、実験的および臨床的な応用において、ゼノフリー条件下でプライミングされた間葉系幹細胞/ストローマ細胞（MSC）の治療用球状凝集塊、すなわちスフェロイドを効率的に作製し、注入することです。これらの手法は、分散して投与された細胞の移植後にしばしば見られる、細胞保持率の低さ、生存率および機能性の低下、ならびに組織損傷に一般的に伴う不良条件といった、MSC治療分野における主要な障壁の克服に寄与します。

これらの手順の主な利点は、FBSなどの免疫原性のある動物由来製品を使用せずに、MSCスフェロイドを調製、プライミング、および注入できることです。こうした製品は、現在、細胞のいくつかの臨床応用を制限しており、一部の前臨床データの解釈を混乱させる可能性もあります。このメカニズムは、MSCベースの有効性を媒介する上で潜在的に非常に有益ですが、MSC介在性の組織修復の理解や、他の培地処方が治療上の遺伝子プラスをどのように変化させるかを理解するためにも利用できます。これらの手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるJosh BeaverとBret Cloughの2名です。

テキストプロトコルに従って間葉系幹細胞を播種およびインキュベートした後、トリプシンおよびEDTAを用いて細胞を回収します。回収した細胞を450 ×gで遠心分離し、すべての細胞を適切な培地とともに単一のコニカルチューブにまとめます。細胞を遠心分離し、ペレットを少量の培地で再懸濁します。その後、細胞数をカウントし、約25,000個の細胞からなるスフェロイドを形成させるため、回収したMSCを以下のいずれかの培地を用いて714 cells/µLに希釈します。

次に、細胞を35 µLずつ、150 mmの倒立培養ディッシュの蓋の裏側に滴下します。室温のPBS 20 mLをディッシュの底部に移し、滴下した細胞が下を向くように、一つの連続した安定した動作で蓋を反転させます。その後、蓋を培養ディッシュの底部に慎重に載せます。

適切なスフィア形成を促すため、ディッシュをインキュベーターに移し、動かさずに3日間静置します。インキュベーション後、慎重に蓋を取り外し、液滴が再び上を向くように反転させて、スフェロイドの回収を開始します。次に、蓋を約10～20度に傾け、セルリフターを用いてスフェロイドを含む液滴をプレートの端まで押し出します。

1 mL ピペットを使用して、スフィアの回収培地を 15 mL コニカルチューブに移します。その後、室温の PBS と同じピペットチップを用いてプレートを洗浄し、スフェロイドを最大限に回収します。リアルタイム PCR アッセイを行う場合は、スフィア懸濁液を室温で 450 ×g、5 分間遠心分離します。次に、上清を吸引除去します。

PBSを用いてスフェロイドを洗浄し、遠心分離と吸引のステップを繰り返します。動物への投与を行う場合は、遠心分離を行わずにスフェロイドをチューブの底に沈殿させます。免疫調節能および抗がん活性の解析に向けた条件培地（CM）を回収するには、先ほど示したようにセルリフターとピペットを用いて、スフェロイドとCMを15 mLコニカルチューブに回収します。

ただし、蓋をPBSで洗浄しないでください。450 ×gで5〜10分間遠心分離した後、上清を1.5 mLチューブに移します。この上清を、室温、10,000 ×gで5〜10分間遠心分離します。

次に、ピペットを用いて清澄化したCMを慎重に回収し、新しい1.5 milliliterチューブに移して-80 °Cで保存します。このビデオで示した通りにスフェロイドを調製し、チューブの底に沈殿するまで3〜4分待機した後、上清を吸引し、xeno-free条件を維持するために0.2〜0.5% HSAを添加したHBSSを加えてスフェロイドを洗浄します。続いて、上清を吸引します。

スフェロイドに100から200 µLの滅菌済みHBSS/HSAを重ね、チューブを氷上に置きます。テキストプロトコルに従ってマウスを麻酔した後、動物をBSL-2キャビネット内に背側を下にして配置し、70%エタノールでマウスの下腹部を消毒します。20ゲージ静脈留置カテーテルのキャップを取り外し、片手でマウスの皮膚を保持しながら、屈曲した膝関節と生殖器領域を結ぶ仮想線の中央を確認します。カテーテル針の先端を正中線に向けて、もう一方の手で腹腔内注射を行います。

カテーテルスタイレットアセンブリから、金属製のスタイレット針をそっと抜きます。スタイレットに血液、尿、糞便が付着していないかを確認し、廃棄してください。100 µLの滅菌HBSS/HSAを入れた100〜200 µLピペットチップをカテーテルシリンジアダプターに挿入し、密閉して、プラスチックカテーテルが適切に配置されていることを確認します。

次に、腹腔内にゆっくりと液体を注入します。100～200 µLのピペットチップを用いて、MSAスフェロイドとHBSS/HSAを回収し、今示したようにカテーテルを通して全量を腹腔内に移します。続いて、100 µLのHBSS/HSAでスフェロイドが入っていたチューブを洗浄し、その全量を腹腔内に移します。

消毒液に浸したガーゼをカテーテルに当て、腹腔内からゆっくりとカテーテルを抜去して廃棄します。カテーテルにスフェロイドが残っていないか確認してください。その後、指で腹腔内を優しくマッサージし、スフェロイドが均一に分布するようにします。

マウスへのスフェロイド投与直後、注入用に調製したスフェロイドの活性化レベルを評価するため、40～120個のスフェロイドを、2% FBSおよび1X penicillin streptomycinを添加したAlpha MEM 1～2 mLを含む12ウェルまたは6ウェルプレートのキャセッターに移します。6時間後、ウェルから培地を1.5 mLまたは15 mLチューブに移し、室温で450 ×gで5分間遠心分離します。最後に、上清のCMを新しい1.5 mLチューブに移し、市販のELISAキットを用いてプロトコルの通りにPGE-2濃度を測定します。

ここで示されているように、約25,000個のMSCを35 µLのCCMの液滴中に懸濁させると、細胞はまず小さな凝集体を形成し、最終的に72時間後には液滴の頂点に単一の緻密な球体を形成します。この図は、単一の緻密な球体およびXFM-1の形成には、CCMにおける推定総タンパク質含有量を反映した濃度である13 mg/mLのHSAの添加が必要であることを示しています。球体の形成過程においてMSCの表現型は劇的に変化し、適切に化学的に定義されたゼノフリー培地中では、PGE2やTSG6を含む多数の抗炎症因子の発現がアップレギュレートされます。

しかしながら、HSAを含まないXFM-2またはXFM-1でスフィアとして培養したMSCでは、TSG6およびPGE2の産生は著しく増加しません。最後に、in vitroでの効果と同様に、LPSの静脈内投与による全身性炎症の誘導直後に、XFM-1 HSAスフィアをマウスの腹腔内に注入したところ、腹腔内のPGE2およびIL-10レベルが上昇し、一方で炎症性サイトカインであるTNF alphaが減少しました。この手法を習得すれば、ハンギングドロップのプレート1枚を1〜2分で準備することが可能です。

適切に実施すれば、無傷のスフェロイドの腹腔内投与は動物1匹あたり5～10分で完了できます。吊り滴法を用いてMSCスフェロイドを作製する場合、スフェロイド形成および治療遺伝子の発現増強に関して、使用するxeno-free培地の組成によって結果が異なる点に留意することが重要です。本手順の後、共焦点顕微鏡などの他の手法を用いることで、スフェロイド内におけるMSCの構成や、スフェロイドの異なる部位で活性化している可能性のある追加のシグナル伝達経路を解析することができます。

この開発後、この手法によりMSC研究者は、他の3D培養条件がMSCのプライミングおよび治療遺伝子の発現にどのように影響するかを研究することが可能になりました。このビデオを視聴することで、ハンギングドロップ法を用いてMSCをスフェロイドとしてプライミングする方法、in vitroでその治療有効性を評価する方法、およびin vivoでの有効性試験のために、無傷のスフェロイドをマウスに効率的に導入する方法について十分に理解できるはずです。また、成人ヒト幹細胞の取り扱いには特別な設備とトレーニングが必要であり、細胞が適切に扱われない場合は危険を伴う可能性があることに留意してください。

成人ヒト幹細胞を扱う際は、常に適切な個人用保護具（PPE）を着用してください。