ニトロセルロース結合アッセイを用いて細菌ヒスチジンキナーゼ自己リン酸化の定量化

このプロトコルの全体的な目的は、精製された細菌ヒスチジンキナーゼの自己リン酸化を定量化することです。この手法は、2成分制御系のシグナル伝達分野における重要な疑問、例えば、タンパク質間相互作用における同族刺激がヒスチジンキナーゼの自己リン酸化に及ぼす影響などの解明に役立ちます。

この手法の主な利点は、ハイスループットな手法であるため、生成されたピコモル単位のホスホヒスチジンを正確に検出し、ヒスチジンキナーゼの速度論的パラメータを取得できることです。私はポストドクトラルフェローとして、ニトロセルロース膜を用いたろ過法を用いてタンパク質結合放射性リガンドを定量しています。そのため、細菌のヒスチジンキナーゼにおけるヒスチジンリン酸化を定量するために、同様の手法を開発することは理にかなっていました。

テキストプロトコルに従って、試薬および材料の準備を行い、本手順を開始してください。96ウェルドットプロット装置をセットアップするには、8 cm × 12 cmのニトロセルロース膜を切断します。ニトロセルロース膜をドットプロット装置に配置します。

装置が密閉され、すべてのウェルがメンブレンで完全に覆われるようにメンブレンを密着させます。ろ液を回収するために、装置を二次サイドアームフラスコに接続します。バルブステムに適切なチューブを接続し、二次フラスコを傾けることなく装置を快適に使用できるようにします。

次に、二次サイドアームフラスコをアスピレーター真空源に接続します。装置に真空をかけて、装置が完全に密閉されているかを確認してください。正しく組み立てられていれば、すべてのウェルに強い真空がかかります。

密閉を確実にするため、すべてのチューブ接続部はParafilmまたはサランラップで巻いてください。開始前に、テキストプロトコルに記載されている通り、4つの反応成分すべてを4Xストック溶液として調製します。反応バッファー、ヒスチジンキナーゼ、および二回蒸留水を等量ずつ混合してください。

これらの反応成分を室温で短時間静置し、平衡状態にします。反応を開始させるため、等量のgamma-32 P ATP溶液を加え、ピぺッティングによって混合します。タイマーで反応経過時間を追跡し、所定の時間まで反応を進行させます。

反応を停止させます。反応液分注量を325 millimolar リン酸に加えます。すべての反応が停止するまで、停止させた反応液を直ちに氷上に置きます。

事前に組み立てた96ウェルドットプロット装置を二次容器に入れます。使用後、装置とメンブレンが放射能を持つため、この容器は装置を容易に分解できる十分な大きさである必要があります。96ウェルドットプロット装置に真空を印加します。

装置内が真空状態になったら、クエンチした反応液を各ウェルのニトロセルロース膜上に注意深くピペッティングします。すべての反応液を膜上にロードするまで、この工程を繰り返します。ニトロセルロースの結合容量はスポットしたヒスチジンキナーゼの量よりも大きいため、正しくロードされればキナーゼのほぼすべてが膜に結合すると考えられます。

使用する器具に応じて、ニトロセルロース膜に穴を開けないよう注意してください。反応液のすべてがニトロセルロース膜に接触していることを確認します。反応液の一部がウェルの壁面に付着しやすいため注意が必要です。

ウェルを100 µLの氷冷25 mMリン酸で洗浄します。これにより、ウェル内に残っている可能性のある反応液を膜まで到達させ、すべての反応液を完全にローディングさせることができます。全量を膜に通過させてください。

真空を停止させる前に、装置を慎重に分解してください。この時点では、装置とニトロセルロース膜の両方が放射性を持っていることに注意してください。二次容器から装置の構成部品を一切取り出さないでください。

ピンセットを用いて、ニトロセルロース膜を装置から、約200 mLの25 mM 氷冷リン酸が入った容器に慎重に移します。洗浄液が放射性となるため、この容器に蓋をしてください。この時点で、真空ポンプを停止しても構いません。

洗浄メンブレンを入れた容器をロッカースタンドに設置します。メンブレンを20分間ゆっくりと揺らします。20分後、使用済みの洗浄液を、一時的な廃棄物保管用の大きなバケツに注意深くデカンテーションします。

氷冷した25 millimolar 燐酸を200 milliliters、メンブレンに加えます。メンブレンから背景のgamma-32 P ATP信号を除去するため、この方法で少なくとも3回メンブレンを洗浄します。3回目の洗浄後、使用済みの洗浄液をガイガーカウンターで放射線検査します。

洗浄液にシグナルが検出されなくなるまで、メンブレンの洗浄を続けます。メンブレンが十分に洗浄されたら、通常5分かそれ以下で完了する短い自然乾燥を行います。本文のプロトコルに記載されている通り、ニトロセルロースをフォスフォラスグリーンに曝露させた後、ポンソーS染色および脱色の準備を行います。

ニトロセルロース膜をポンソーS染色液に1〜2分間短時間浸します。脱色前に、膜全体を染色液で十分に濡らしてください。その後、膜から過剰なポンソーS液を捨てます。

ヒスチジンキナーゼ由来のスポットのみが染色された状態になるまで、メンブレンを二回蒸留水で洗浄します。なお、この手順は、すべてのスポットに検出可能な量のタンパク質が含まれている場合にのみ有効であることに注意してください。ハサミを使用して、ニトロセルロースメンブレン上の各スポットを切り出します。

染色されたスポットの縁に沿って完璧に切り抜く必要はありません。メンブレンが十分に洗浄されていれば、切り出したスポットのサイズが多少異なっても、バックグラウンドへの影響は無視できます。各反応に対してスポット全体を切り出すことだけが重要です。

ピンセットを用いて、各スポットをシンチレーションバイアルに慎重に移します。リン32はチェレンコフ放射により容易に検出できるため、シンチレーションカクテルの添加は不要です。次に、gamma-32 P ATP溶液を数段階に希釈し、1 cm × 1 cmのニトロセルロース正方形にスポットします。

ピンセットを用いて、各スクエアをシンチレーションカクテルを含まないシンチレーションバイアルに慎重に移します。これらのサンプルは、ATP溶液の1ピコモルあたりの1分間あたりのカウント数を決定するための標準曲線を作成するために使用されます。ここでは、ニトロセルロース膜のポンソー染色を示しています。

すべてのサンプルで染まり方が均一であり、全サンプルが等量ロードされていることが示されています。ニトロセルロース膜のフルオログラフィーの結果は、各スポットにおける放射標識ホスホヒスチジンの相対的なレベルを示しています。4行目と8行目は陰性対照であり、過剰なATPがニトロセルロース膜から洗浄し除かれていることを証明しています。

ヒスチジンキナーゼの自己リン酸化の定量結果の代表例をここに示します。このデータは、メンブレンから切り出した各スポットのシンチレーション計数によって得られたものです。ここに示すATP 1 picomoleあたりのcounts per minuteの標準曲線もシンチレーション計数から作成されており、各サンプル中に存在するホスホヒスチジンのpicomole数を算出するために使用されます。

本手順に続き、同族刺激やキナーゼ活性を調節すると仮定されるタンパク質を導入するなど、他の手法を実験に加えることで、これらの添加物がキナーゼ活性に及ぼす影響といった追加の疑問を検討することが可能です。放射性物質を取り扱う際は非常に危険であることに留意してください。本手順を実施する際は、適切な放射線安全トレーニングの受講、個人用保護具および遮蔽体の使用などの予防策を必ず講じてください。