低周波体細胞変異の検出のための高感度な方法として直接配列決定と組み合わせるPCRをブロックする野生型

野生型ブロッキングPCRとそれに続く直接シーケンシングは、さまざまなサンプルタイプにおける低頻度の体細胞突然変異を高感度に検出する方法を提供します。

この手順の全体的な目標は、さまざまなサンプルタイプで低頻度の体細胞変異を検出することです。この方法論は、非常に低い頻度の突然変異の検出を容易にすることにより、体細胞突然変異検査における重要な質問に答えるのに役立ちます。ここでは、骨髄サンプル中のmyd88遺伝子の変異を探します。

この技術の主な利点は、腫瘍細胞が非常に少ない場合でも、体細胞変異の存在に関する非常に正確で感度の高い情報を提供することです。この野生型ブロッキングPCRベースのシーケンシングアッセイは、myd88遺伝子のエクソン5の一部を増幅し、L265ホットスポットのカバレッジを確保するために開発されました。フォワードプライマーとリバースプライマーは、補完的なシーケンシングプライマーのひざまずきを可能にするために、5つのプライムM13シーケンスで設計されました。

ブロッキングオリゴヌクレオチドは、長さが約10〜15塩基で、変異体の濃縮が望まれる野生型テンプレートと相補するように設計します。オリゴが短いほど、ミスマッチの識別が改善されます。高い標的特異性を達成するためには、ブロッキングヌクレオチドを過剰に使用しないことが重要です。これにより、非常に粘着性のあるオリゴヌクレオチドが生成されます。

ブロッキングオリゴヌクレオチドを設計するには、まずOligo Toolsのウェブサイトにアクセスしてください。Oligo TM予測ツールを選択します。新しいウィンドウが開きます。

ブロックする野生型テンプレートの配列をオリゴ配列ボックスに貼り付けます。ブロッカーベースの前にプラス記号を追加して、それらをマークします。「calculate」ボタンをクリックして、DNAブロッカーハイブリッドのおおよそのTMを決定します。

計算された融解温度は、下のボックスに表示されます。ブロッキングオリゴは、サーモサイクル中の融解温度が伸長温度より10〜15°C高くなるように設計します。ここでは、延長温度は摂氏72度です。

融解温度を調整するには、ブロッキングベースを追加、削除、または置換します。CまたはGベースをブロックする3〜4つの長いストレッチは避けてください。次に、二次構造の形成や自己二量体化を避けるために、Oligo Toolsのウェブサイトのホーム画面に戻り、Oligo Optimizerツールを選択します。

新しいウィンドウが開きます。ブロックする野生型テンプレートの配列をボックスに貼り付けます。ブロッキングベースを示すプラス記号を追加します。

secondary structureとself onlyの2つのボックスを選択し、解析ボタンを押すと、hybridizationとsecondary structureのスコアが表示されます。これらのスコアは、自己二量体と二次構造の融解温度の非常に大まかな推定値をそれぞれ表しています。スコアが低いほど最適であり、ブロッカーとブロッカーのペアリングを制限することで達成できます。

ブロッキングヌクレオチドを除去または再配置して、スコアを低くします。ここに示されているmyd88の最適化されたブロッキングオリゴヌクレオチドは、DNAブロッカーハイブリッドの融解温度と十分に低いハイブリダイゼーションおよび二次構造スコアとのバランスをとっています。これは、アミノ酸Q262からI266をカバーするように設計されており、DNAポリメラーゼによる伸長と3つのプライムエキソヌクレアーゼによる分解の両方を阻害する3プライム反転DTを特長としています。

プライマーを設計したら、野生型ブロッキングPCRをセットアップし、添付の文書に記載されているようにサーモサイクリングを実行します。磁気ビーズを摂氏4度の保管場所から取り出し、室温に戻します。10マイクロリットルのPCR産物を新しいPCRプレートに移します。

磁気ビーズを激しくボルテックスして磁性粒子を完全に再懸濁し、新しいプレート上の各ウェルに18マイクロリットルの磁気ビーズを追加します。ピペットで10回上下させて混ぜます。次に、プレートを室温で5分間インキュベートします。

インキュベーション後、PCRプレートをサイドスカート付きマグネットプレートに2分間置き、ビーズを溶液から分離します。マルチチャンネルピペットを使用して上清を吸引します。ビーズペレットを避けるように注意してください。

次に、150マイクロリットルの70%エタノールを各ウェルに分注し、プレートを室温で少なくとも30秒間インキュベートします。次に、マルチチャンネルピペットでエタノールを吸引し、チップを廃棄します。この洗浄手順をもう一度繰り返します。

20マイクロリットルのマルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルから残りのエタノールを吸引し、チップを廃棄します。プレートのウェルが乾くまで約10分間待った後、磁石からプレートを取り出し、各ウェルに40マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を追加します。ピペットで15回上下させて混ぜます。

その後、室温で2分間インキュベートします。インキュベート後、PCRプレートをマグネットプレートに1分間戻し、ビーズを溶液から分離します。精製した35マイクロリットルの精製製品を新しいPCRプレートに移し、添付の文書に記載されているように双方向シーケンシングを行います。

シーケンシング製品を精製するために双方向シーケンシングを行ったら、PH 5.2 の 3 モル酢酸ナトリウムと 100% エタノールの 25 溶液中の新しい 1 つを準備します。また、70%エタノールの新鮮な溶液を準備します。フォワードシーケンシングプレートとリバースシーケンシングプレートの両方の各ウェルに、100%エタノールに30マイクロリットルの酢酸ナトリウムを加え、ピペットで5回上下にピペットで混合します。

その後、プレートを再密封し、室温で暗所で20分間インキュベートします。20分が経過した後、プレートをGの2,250倍で15分間遠心分離します。回転後、プレートシーラーを取り外し、プレートを廃棄物容器の上で一度反転させます。

プレートを複数回反転させると、ペレットがウェル底から緩む可能性があります。逆さプレートを清潔なペーパータオルの上に置き、Gの150倍で1分間遠心分離します。次に、150マイクロリットルの70%エタノールを各ウェルに加え、プレートを再シールします。

2、Gの250倍で5分間回転します。次に、プレートシーラーを取り外してプレートを反転するプロセスを繰り返します。ウェルが完全に乾いていない場合は、室温で風乾させます。

サンプルが光から保護されていることを確認してください。ウェルが完全に乾いたら、各ウェルに10マイクロリットルのホルムアミドを加え、ピペットで10回上下して混合します。プレートを再シールします。

サーモサイクラーを使用して摂氏95度で3分間、続いて摂氏4度で5分間変性します。変性後、プレートシーラーをセプタムと交換し、製造元の指示に従ってシーケンシングプラットフォーム上でシーケンスします。シーケンス解析ソフトウェアを使用して、トレースを視覚化し、シーケンスを適切な参照シーケンスにアラインメントします。

myd88 を NCBI リファレンス配列NM002468にアラインします。突然変異の有無にかかわらず、患者からのゲノムDNAは、従来型と野生型の両方のブロッキングPCRを受け、得られたPCR産物の配列決定が行われました。ここで見ることができるように、野生型ブロッキングPCRを行ったときに変異対立遺伝子が濃縮され、野生型DNAでは偽陽性は見られませんでした。

ここに示すように、シグナル強度の特徴的な低下は、ブロッカーの濃度が高すぎる場合、またはPCR精製後の精製で双方向シーケンシングの前にブロッカーを除去できなかった場合によく見られます。これは、磁気ビーズ精製の代わりに酵素精製を行う場合に発生します。変異型対立遺伝子を濃縮するPCRベースのアッセイは、低頻度のアーチファクトを検出します。

これらのトレースは、シトシンまたはメチル化シトシンがそれぞれウラシルまたはチアミンへの正式なインフィックスを介して脱アミノ化されると、FFPE組織のTAアーティファクトと比較して、CGシーケンシングアーティファクトの増加を示しています。ウラシルDNAグリコシラーゼまたはUDGは、野生型ブロッキングPCRの前にウラシルを切除できるため、シーケンシングアーティファクトの低減に役立ちます。ただし、CPGアイランドで頻繁に発生する脱アミノ化5メチルシトシンから生じるチアミンは、UDGで切除することはできません。

野生型ブロッキングPCRで使用されるブロッカーの濃度を下げると、UDG処理によって改善されないシーケンシングアーティファクトの発生を減らすのに役立つ可能性があります。このビデオを見れば、野生型ブロッキング技術を使用して、体細胞突然変異を高い精度と感度でテストする方法を十分に理解できるはずです。この技術の原理は、細胞の小さな亜集団における突然変異の検出に適用することができます。

したがって、さまざまな新生物の患者の微小残存病変の検出、患者のモニタリング、早期再発の予測に有用です。