大規模な再建と選択的集団のニューロンを分類するために形態学的指標に基づいて独立、不偏クラスタリング

このプロトコルは、選択的ニューロン集団の大規模な再構成を説明し、蛍光マーカーを発現する修正された狂犬病ウイルス、および独立した、公平なクラスタとラベルされた次の逆行性感染症は、それが明確なニューロンのサブクラス間の形態学的評価指標の包括的な特性評価を可能に分析します。

このプロトコルの目標は、ウイルス標識ニューロンの形態を再構築する手順を説明し、標識ニューロンの集団に対して独立した偏りのないクラスター分析を実行して、異なるニューロンサブクラスに沿った形態学的指標の包括的な特性評価を可能にすることです。私たちは、選択的なニューロン集団内の形態学的にユニークなニューロンタイプのより包括的なサンプリングと偏りのない分類を促進するために、神経解剖学的データを収集および分析するための新しいアプローチを概説します。この手法の主な利点は、ニューロンの形態の大規模な分析を可能にし、偏りのない方法を利用して異なるニューロンのサブクラスを分類できることです。

形態学的再構成の最も困難な側面は、再構成するニューロンを適切に分離し、適切なz深さを割り当て、隣接する組織切片間で再構成を継続するためにアーバーを調整することです。EGFPを発現する改変狂犬病ウイルスを定位注射した霊長類の50ミクロンの脳組織切片を染色したスライドを選択することにより、再建を開始します。スライドを顕微鏡スライドホルダーにセットし、低倍率対物レンズを使用して目的の1つのセクションに焦点を合わせます。

カメラのシャッターを適切に配置して、カメラの画像がライブ画像に表示されていることを確認します。関心のある脳構造内で合理的に分離された標識ニューロンを選択して、樹状突起樹状突起の明確な再構築を可能にします。倍率10倍に切り替えて、エリアにピントを合わせます。

細胞体が1つのセクションに完全に収まっている場合は、ニューロンを優先的に選択して、その面積と丸みを正確に推定します。よく染色され、十分に分離されたニューロンを選択したら、ソフトウェアの新しいセクションボタンをクリックして、細胞体を含むホームセクションをセクションマネージャーに追加します。再構築に含めるセクションの数を入力します。

開始するには、2〜3つのセクションを挿入することをお勧めします。断面の厚さを 50 ミクロンに割り当てます。2つのxオブジェクトを選択し、上部のツールバーの等高線ボタンをクリックして、ドロップダウンメニューから等高線タイプを選択します。

ターゲット構造の輪郭をトレースするには、マウスを使用して輪郭に沿った点をクリックします。輪郭のトレースが終了したら、マウスを右クリックし、メニューから[輪郭を閉じる]を選択して輪郭を閉じます。次に、ビューが 2 x のままで、左側のツールバーで目的のマーカー記号をクリックします。

次に、ターゲット構造の中心をクリックしてマーカーを配置します。等高線が完成したら、40倍または60倍の対物レンズを選択して、セル本体の輪郭をトレースします。次に、上部のツールバーにあるニューロントレースボタンを選択し、ドロップダウンメニューからトレースするニューロン構造(この場合はセル本体)を選択します。

セル本体をトレースするには、セル本体の最大範囲付近の点をクリックし、必要に応じて Z 深度を調整してセル本体にピントを合わせます。そして、マウスを右クリックしてセル本体の輪郭を完成させます。次に、セル本体の輪郭の中心に別のスタイルのマーカーを配置し、マーカーが z 深さのほぼ中心にあることを確認します。

各トレースを開始する前に、ホームセクションと隣接するセクションで正しい Z 深さを設定して、Z 軸の値が正確になるようにすることが重要です。樹状突起アーバーのトレースを開始するには、上部のドロップダウンメニューからデンドライトを選択します。

次に、細胞体から始まる各樹状突起をトレースします。樹状突起が分岐する場合は、マウスを右クリックして[分岐ノード]または[分岐ノード]を選択し、この分岐点にノードを配置します。トレーシング全体でZ深度を調整して、樹状突起の角度と方向を正確にキャプチャしてください。

このセクションの樹状突起の最後に、マウスを右クリックして、ドロップダウンメニューから[ending]を選択します。すべての樹状突起アーバーがホームセクションでトレースされたら、隣接するセクションに続く可能性が高い樹状突起の終末を特定します。そして、顕微鏡画像の適切なz深さでこれらを20倍で焦点を合わせます。

顕微鏡画像には、血管や簡単に認識できる樹状突起のパターンや束など、近くにある主要なランドマークを含めます。次に、デジタルカメラを使用してコンピューターの画面にライブ画像を撮ります。次に、顕微鏡の対物レンズを2つのxに切り替えて、スライドの隣接するセクションに移動します。

次に、ソフトウェア ビューで以前にトレースしたセクションの輪郭を、新しいセクションの LGN と TRN の境界に揃えます。20倍に戻り、ランドマークを使用して整列します。次に、以前にトレースしたセクションの樹状突起の末端の写真を使用して、最初に矢印ツールを使用して再構築を選択し、トレースを移動して樹状突起を整列させます。

次に、右クリックしてドロップダウンメニューから[移動]を選択し、それに応じてトレースを移動します。トレーシングを回転させるには、右クリックしてドロップダウンメニューから[回転]を選択し、それに応じてトレーシングを回転させます。または、上部のツールのドロップダウンからマッチングツールを選択し、マッチングするポイントの数を選択します。

次に、再構築の終点とライブ画像内の対応する継続点をクリックして、樹枝状突起の終点と始まりを一致させます。前のセクションのトレースが新しいセクションの樹状突起と揃ったら、以前と同様にセクションマネージャーに新しいセクションを追加します。または、以前に作成した隣接するセクションを選択し、同じ方法でz深度を調整します。

現在のセクションをクリックして、セクションマネージャーで対応する新しいセクションが選択されていることを確認します。次に、倍率を40倍または60倍に上げた後、矢印を使用して樹状突起を選択します。前のセクションの樹状突起の端でマウスを右クリックし、ドロップダウンメニューから[末尾に追加]を選択します。

続きが新しいセクションにあるかどうかを尋ねるプロンプトが表示されます。[はい] をクリックします。次に、マウスを描画ツールとして使用して、樹状突起の継続をトレースします。

次のセクションに揃える準備として、エンディングの画像を撮ります。次に、ニューロンの少なくとも 3 つのセクションがトレースされるまで、または樹状突起が追跡または検出できなくなるまで、樹状突起トレースに継続を追加します。ニューロン再構成システムに関連付けられた抽出プログラムを使用して、完成した再構成ファイルを開きます。

編集ドロップダウンメニューから、[すべてのオブジェクトを選択]を選択します。上部の解析ツールバーからブランチ構造解析を選択し、各タブをクリックして、各タブで目的の解析オプションを選択します。分析ウィンドウの[OK]ボタンをクリックして必要なデータをすべて抽出し、出力ウィンドウを右クリックして[Excelにエクスポート]を選択してスプレッドシート形式で保存し、さらに分析します。

この写真は、1匹の動物の背側LGNを通る単一の冠状突起を示しています。シトクロムオキシダーゼ染色は、LGN層を可視化するために使用されます。そして、GFP染色はウイルス注入部位をマークします。

矢印は、密集した逆行性標識された視床網様体核ニューロンの領域を示しています。断面の向きは、図示されている背側、腹側、内側、外側のコンパスに従っています。スケール バーは左下隅に示されています。

この画像は、ウイルス注入を含むすべてのセクションのLGNの輪郭を赤で、TRNを栗色で示しています。黄色の星は注射部位の中心を示します。この画像は、輪郭と注入部位の 3D レンダリングを示しています。

これは、栗色で示された単一の集約TRN等高線内のクラスター割り当てに従って色分けされた再構成されたTRNニューロンの位置のマップです。スケールバーは500ミクロンを表します。この画像は、TRNの凝集輪郭を黒、LGNを灰色で示し、5つの再構成されたTRNニューロンが、TRN内の内側の側面位置に応じて暖色から寒色に着色されています。

スケールバーは500ミクロンを表します。これらの写真は、100ミクロンを表す色が一致したスケールバーを備えた同じ5つのTRNニューロンの詳細を示しています。この階層的な樹形図ツリーは、10の独立した形態学的指標に基づいて再構築された160のTRNニューロン間の連鎖距離を示し、クラスター分析の全体的な結果を示しています。

TRNニューロンの3つの異なるクラスターは、青、緑、赤で示されています。これらのニューロン再構築技術を習得すると、1〜2時間で1つのニューロンを完全に再構築できます。ニューロンを再構築する際には、z深度を常に監視し、調整することが重要です。

ここで概説するプロトコルは、従来のより偏った神経解剖学的解析方法を改良したもので、研究者は大規模な形態学的データに基づいてニューロンの新しいサブクラスを探索できます。このビデオを見れば、隣接する組織切片を通じてニューロンを再構築する方法や、さらなる解析のために形態学的データを抽出する方法について十分に理解できるはずです。