大規模な再建と選択的集団のニューロンを分類するために形態学的指標に基づいて独立、不偏クラスタリング

本プロトコルの目的は、ウイルス標識されたニューロンの形態を再構築する手順を説明し、標識されたニューロン集団に対して独立した不偏のクラスター解析を行うことで、異なるニューロンサブクラスにわたる形態学的指標の包括的な特性評価を可能にすることです。我々は、選択的なニューロン集団内において、形態的にユニークなニューロン型のより包括的なサンプリングと不偏な分類を促進するために、神経解剖学的データを収集および分析する新しいアプローチを概説します。この手法の主な利点は、ニューロン形態の大規模な分析が可能であり、不偏な手法を用いて異なるニューロンサブクラスを分類できる点にあります。

形態学的再構築において最も困難な点は、再構築するニューロンを十分に孤立したものから選択すること、適切なz深度を割り当てること、および隣接する組織切片間で再構築を継続するために樹状突起を整列させることです。まず、EGFPを発現する改変狂犬病ウイルスを立体定位的に注入した霊長類の、染色済み50 micron脳組織切片が載ったスライドを選択し、再構築を開始します。スライドを顕微鏡のスライドホルダーに設置し、低倍率対物レンズを用いて目的の単一切片に焦点を合わせます。

カメラシャッターを適切に配置し、ライブ画像にカメライメージが表示されていることを確認します。樹状突起の分枝を明確に再構成できるよう、目的の脳構造内で十分に単離された標識ニューロンを選択します。10倍の倍率に切り替え、当該領域にピントを合わせます。

細胞体の面積と円形度を正確に推定するため、細胞体が単一の切片内に完全に収まっているニューロンを優先的に選択してください。適切に染色され、孤立したニューロンを選択したら、ソフトウェアの「new section」ボタンをクリックし、細胞体を含むホームセクションをセクションマネージャーに追加します。再構築に含める切片数を入力してください。

まずは2～3枚の切片を挿入することを推奨します。切片の厚さは50 micronsに設定してください。2倍の対物レンズを選択し、上部ツールバーのcontourボタンをクリックして、ドロップダウンメニューからcontourタイプを選択します。

マウスを使用して輪郭上の点をクリックし、標的構造の輪郭をなぞります。輪郭のトレースが完了したら、マウスを右クリックし、メニューから「close contour（輪郭を閉じる）」を選択して輪郭を閉じます。次に、表示倍率を2倍に維持したまま、左側のツールバーから目的のマーカー記号をクリックします。

次に、ターゲット構造の中心をクリックしてマーカーを配置します。輪郭の描画が完了したら、40倍または60倍の対物レンズを選択し、細胞体の外形をトレースします。その後、上部ツールバーのニューロン・トレーシングボタンを選択し、ドロップダウンメニューからトレースするニューロン構造（この場合は細胞体）を選択します。

細胞体の最も広い範囲に沿って点をクリックし、必要に応じてz深度を調整して細胞体に焦点を合わせながら、細胞体の輪郭をトレースします。マウスを右クリックして細胞体の輪郭描画を完了してください。次に、細胞体輪郭の中心に異なるスタイルのマーカーを配置し、そのマーカーがz深度においてもおおよそ中心に位置するようにしてください。

各トレーシングを開始する前に、z軸の値を正確にするため、ホームセクションおよび隣接するセクションにおいて正しいz深さを設定することが極めて重要です。樹状突起の樹形（dendritic arbors）のトレーシングを開始するには、上部のドロップダウンメニューからdendriteを選択してください。

次に、細胞体から始めて各樹状突起をトレースします。樹状突起が分岐している場合は、マウスを右クリックして「bifurcating node（二分ノード）」または「trifurcating node（三分ノード）」を選択し、その分岐点にノードを配置します。樹状突起の角度と方向を正確に捉えるため、トレース中は適宜z-depth（z深さ）を調整してください。

このセクションの樹状突起の末端でマウスを右クリックし、ドロップダウンメニューから「ending」を選択します。ホームセクション内のすべての樹状突起樹がトレースされたら、隣接するセクションまで継続している可能性が高い樹状突起の末端を特定します。そして、顕微鏡画像の20倍率において、適切なz深さでこれらに焦点を合わせます。

顕微鏡画像には、血管や容易に識別可能な樹状突起のパターンや束など、近くの主要な指標を含めてください。次に、コンピューター画面にデジタルカメラを手でかざして、ライブ画像の写真を撮影します。その後、顕微鏡の対物レンズを2xに切り替え、スライド上の隣接する切片へ移動します。

次に、ソフトウェア画面上で、前回トレースしたセクションの輪郭を、新しいセクションにおけるLGNおよびTRNの境界線に合わせます。20倍に戻し、ランドマークを用いて位置を合わせます。その後、前回トレースしたセクションの樹状突起終末の写真を参照しながら、まず矢印ツールで再構築したデータを選択し、樹状突起が一致するようにトレース位置を移動させます。

次に、右クリックしてドロップダウンメニューから「move」を選択し、トレースを適切に移動させます。トレースを回転させるには、右クリックしてドロップダウンメニューから「rotate」を選択し、トレースを適切に回転させます。あるいは、上部のツールドロップダウンから「match」ツールを選択し、マッチさせるポイント数を指定します。

次に、再構築データの末端と、ライブ画像内の対応する継続点（開始点）をクリックして、樹状突起の末端と開始点を一致させます。前のセクションからのトレースが新しいセクションの樹状突起と揃ったら、前述と同様にセクションマネージャーに新しいセクションを追加します。あるいは、単純に以前に作成した隣接セクションを選択し、同様にz深度を調整してください。

セクションマネージャーで現在のセクションをクリックし、対応する新しいセクションが選択されていることを確認してください。次に、倍率を40倍または60倍に上げ、矢印を使用して樹状突起を選択します。前のセクションの樹状突起の末端でマウスを右クリックし、ドロップダウンメニューから「終点に追加」を選択します。

継続部分が新しいセクションにあるかどうかを確認するプロンプトが表示されます。「はい」をクリックしてください。次に、マウスを描画ツールとして使用し、樹状突起の続きをトレースします。

次のセクションとの整合性を取る準備として、末端部の画像を撮影します。その後、そのニューロンについて少なくとも3つのセクションがトレースされるか、あるいは樹状突起をこれ以上追跡または発見できなくなるまで、樹状突起のトレースを継続します。ニューロン再構築システムに付随する抽出プログラムを使用して、完了した再構築ファイルを開きます。

「編集」ドロップダウンメニューから「すべてのオブジェクトを選択」を選択します。上部の解析ツールバーから「分枝構造解析」を選択し、各タブをクリックして、それぞれのタブで目的の解析オプションを選択します。解析ウィンドウの「OK」ボタンをクリックして必要なデータをすべて抽出し、出力ウィンドウを右クリックして「Excelにエクスポート」を選択し、さらなる解析のためにスプレッドシート形式で保存します。

この写真は、1匹の動物の背側LGNを通る単一の冠状断面を示しています。LGN層を可視化するためにシトクロムcオキシダーゼ染色を用いています。また、GFP染色によりウイルス注入部位を標識しています。

矢印は、高密度に逆行性に標識された視床網様核ニューロンの領域を示しています。切片の方向は、図示されている背腹・内外のコンパスに基づいています。スケールバーは左下に示されています。

この画像は、黒い輪郭線で示されたウイルス注入を含むすべての切片における、赤色のLGNと栗色のTRNの輪郭線を示しています。黄色の星印は注入部位の中心を示しています。また、この画像は輪郭線と注入部位の3Dレンダリングを示しています。

これは、栗色で示された単一の統合TRN輪郭内におけるクラスター割り当てに従って色分けされた、再構築TRNニューロンの位置を示すマップです。スケールバーは500 micronsを表しています。この画像は、黒色で示されたTRNの統合輪郭と灰色で示されたLGN、およびTRN内での内側・外側位置に応じて暖色から寒色に色分けされた5つの再構築TRNニューロンを示しています。

スケールバーは500 µmを示しています。これらの写真は、同じ5つのTRNニューロンの詳細を示しており、色分けされたスケールバーは100 µmを示しています。この階層的デンドログラムは、10個の独立した形態学的指標に基づいた160個の再構築TRNニューロン間の連結距離を示しており、クラスター分析の全体的な結果を表しています。

TRNニューロンの3つの異なるクラスターが、青、緑、赤で示されています。これらのニューロン再構築技術を習得すれば、単一のニューロンを1〜2時間で完全に再構築することが可能です。ニューロンを再構築する際は、z深度を絶えず監視し、調整することが重要です。

ここに概説するプロトコルは、従来のバイアスの強い神経解剖学的解析手法を改良したものであり、大規模な形態学的データに基づいてニューロンの新しいサブクラスを探索することを可能にします。このビデオを視聴することで、隣接する組織切片を通じてニューロンを再構築し、さらなる解析のために形態学的データを抽出する方法について十分に理解できるはずです。