子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

この子宮内エレクトロポレーションアプローチの全体的な目標は、通常の実験条件下での皮質ニューロンの構造的結合性と興奮性を特徴付けることです。この方法は、脳の構造と機能的接続性、認知障害の生物学の解剖など、発生神経生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、ニューロンのまばらな集団のマーキングを可能にし、樹状突起をドレスアップして個々のニューロンにアクセスできるため、より効率的でフィメティックな定量分析につながることです。

注射の前に、単一細胞標識または標準的なパッチクランプ研究のために、手術ごとに10マイクロリットルのDNA混合物を準備します。次に、胚を指で優しく操作して、終脳を見つけます。次に、準備したホウケイ酸キャピラリーをマウスピペットに入れます。

針の先端を子宮に通し、血管を避けて、側脳室に到達するまで通します。その後、大きな青い斑点が観察されるまで、約1マイクロリットルのFast Green色のDNA溶液をゆっくりと注入します。この手順の重要なステップは、DNAの注入です。

これはできるだけ穏やかに行う必要があります。次に、7ミリメートルのプラチナ電極を胚の頭に横向きに配置し、プラチナ電極を介して電圧を印加します。この手順では、固定された脳を4°CのPBS中の30%スクロース10ミリリットルで1〜2日間凍結するまで凍結保護します。

次に、1つの立方センチメートルのアルミホイルキューブを準備し、キューブを2/3またはOCTで満たします。その後、凍結した脳を摂氏80度で保存します。

クライオスタットで脳を切片にするには、標本ディスクの表面にOCTを一滴垂らします。組織ブロックからアルミホイルをはがし、ブロックを液体OCTの上の希望の向きに置きます。組織学的ブロックが固定されるまでしっかりと圧力をかけます。

次に、試料ディスクをクライオスタットの試料ヘッドに挿入し、試料を切片化の向きにします。次に、厚さ50〜100マイクロメートルの切片をスライスし、浮遊する凍結切片を細いブラシを使用してPBSに移します。その後、0.5%Triton X-100を含むPBS中の5%ウシ胎児血清で、切片を室温で1時間ブロックします。

次に、ブロッキング溶液で希釈した1:500の一次抗体とともに、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、PBSで切片を3回洗います。ブロッキング溶液で希釈した1:500の二次抗体を添加し、切片を室温で1時間インキュベートします。

次に、PBSでセクションを3回洗います。その後、0.5%Triton X-100を含むPBS中のdapEで切片を10分間対比染色します。切片をPBSですすぎ、封入剤で封入します。

ニューロンを再構築するためには、脳切片の画像を高倍率・高解像度で取得します。次に、取得ソフトウェアでTile Scanを選択して、すべての樹状突起と軸索突起にまたがる対象領域をカバーします。情報の損失を避けるために、Z軸上に十分な数のスタックを取得します。

その後、画像を開き、メニューからセグメント化された線オプションを選択します。ニューロンの構造に沿って線を引きます。続いて、[分析]、[ツール]、[ROIマネージャー]、[追加]の順に選択して行を保存します。

分析したニューロンのすべての軸索または樹状突起について、このプロセスを繰り返します。ROI マネージャー メニューで、測定を押して長さを取得します。測定値をテキストファイルまたはスプレッドシートにエクスポートして分析します。

GFPエレクトロポレーションマウスからGFP発現ニューロンの記録を行うには、脳を冷やした培養皿に入れます。小さなハサミで小脳を切り取ります。次に、ヘラで脳を拾い上げ、ペーパータオルで拭いて乾かします。

脳の腹側尾面をビブラトームホルダーに接着します。氷冷したACSFで満たされたビブラトームにホルダーを置き、ビブレーターチャンバーが連続的にカーボゲン化していることを確認します。これに続いて、15分以内に300マイクロメートルの冠状切片を切断することにより、急性スライスを取得します。

次に、急性スライスを摂氏25度でACSFで少なくとも60分間インキュベートし、カルボゲンでバブリングします。60分後、パスツールピペットまたは小さなブラシを使用してスライスを記録チャンバーに移します。スライスをハープで押さえ、ACSFで毎分2ミリリットルの割合で大量に塗ります。

GFP陽性ニューロンにパッチを当てるには、顕微鏡で対象領域を10倍の位置に位置します。次に、60x対物レンズを使用してGFP陽性細胞を見つけます。次に、記録電極に細胞内溶液を充填します。

その後、ガラスピペットをピペットホルダーに入れます。その後、ピペットチップをお風呂に入れ、チップに焦点を合わせます。ピペットが浴に入ったら、背圧制御システムを通じて陽圧を加えます。

ピペット内の背圧を維持しながら、目視ガイドの下で目的の細胞にアプローチします。細胞の表面に小さなくぼみが現れたら、圧力を解放します。この時点で、1ギガオーム以上の抵抗を持つタイトシールが形成されることがあります。

それ以外の場合は、軽い負圧を加えて促進します。シールが形成されている間に、保持電圧クランプを60ミリボルトにします。ギガオームシールが形成されたら、吸引パルスを印加して細胞膜を破裂させ、細胞全体モードに突入します。

全セルモードになったら、電圧クランプから電流クランプモードに切り替えて録音を開始します。これらの画像は、胎生15.5日目に子宮内エレクトロポレーションによって層2/3ニューロンにベクターを送達し、出生後16日目に冠切片を調製したことを示しています。CAG DsRed2ベクターをコントロールとしてコトランスフェクトしました。

GFPは、creも取り込んだニューロンでのみ発現し、CALNL GFPベクターのLoxP部位の組換えを可能にします。これは、まばらに標識された別のGFPニューロンの樹状突起の高倍率共焦点画像です。これは、GFPでエレクトロポレーションした錐体ニューロンであり、明視野および緑色蛍光条件下で観察されました。

これは、CAG-GFPエレクトロポレーション制御ニューロンの層2/3における典型的な規則的なスパイク応答です。このテクニックを習得すれば、子宮内エレクトロポレーションでは30分、適切に行えばパッチクランプ録音では半日で行うことができます。この手順を試みるときは、母親のストレスを軽減し、子犬の生存の可能性を高めるために、できるだけ早く手術を行うことを忘れないでください。

この手順に続いて、特定の遺伝子の発現と代理母の発生におけるそれらの影響との関係など、追加の質問に答えるために、発現などの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、発生神経科学の分野の研究者がマウスのニューロンの接続性と形態を研究する道を開きました。このビデオを見た後、子宮内操作を使用して単一細胞レベルでのニューロンの構造と接続性、および蛍光標識されたニューロンの興奮性を説明する方法を十分に理解しているはずです。