Name: 多能性幹細胞は、心筋の修復のための心臓細胞を派生します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学ぶ多能性幹細胞から心筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞への分化法とパッチ介在細胞移植による心筋修復技術。効率的な心臓組織工学の手法を習得できます。

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この作業は、米国公衆衛生局の助成金NIH RO1s HL67828、HL95077、HL114120、UO1 HL100407-project 4(JZへ)、米国心臓協会の科学者開発助成金(16SDG30410018)、アラバマ大学バーミンガム臨床・トランスレーショナルサイエンスセンターからの研究バウチャー賞(WZへ)によって支援されました。

全ての実験手順は、アラバマ大学バーミンガム校の動物ガイドラインに従って行われています。 1. hiPSC-のCMにhiPSCsの区別<ol><li>一晩4℃で予め冷却した成長因子低減ゼラチン状タンパク質混合物でコート6ウェルプレートのウェル。使用前にゲル状のタンパク質混合物を吸引。 10μMのROCK阻害剤とのmTeSR1培地補充で5％CO 2、37℃で細胞（ウェル当たり1×10 5細胞）プレコーティングしたプレート上にhiPSCsをシードし、文化。 </li><li>細胞が90％コンフルエンスに達するまで毎日培地をリフレッシュ。その後、5％CO 2、37℃2日分以上の細胞成長因子低減ゼラチン状タンパク質培地への混合物（6ウェルプレート当たり0.5 mgのゼラチン状のタンパク質混合物、ウェルあたり2 mlの培地）、および文化を追加します。 <ol><li>培地を交換するには、静かにして真空を経由してペトリ皿から培地を吸い出します細胞をタッチアウト、および転送ピペットを使用して、新しいメディアを追加します。 </li></ol></li><li>成長因子低減ゼラチン状タンパク質混合物、インスリンなしB27および100ng / mlのアクチビンAを補ったRPMI1640培地で培地を交換し、分化を開始します。 24時間の培養を5％CO 2、37℃で細胞。 </li><li>インスリンなしB27を補充されたRPMI1640培地、10ng / mLの骨形成タンパク質4（BMP-4）、および10ng / mLの塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）を含む培地を交換し、 96時間培養を5％CO 2、37℃で細胞。 </li><li> B27を補充したRPMI1640培地で培地を交換し、培養を5％CO 2、37℃で細胞を続けます。 3日ごとに培地を更新します。 </li><li>分化を開始した後3日〜、顕微鏡下で細胞を収縮のクラスターを観察します。最初の収縮を観察した後〜7日のクラスタを収集し、ハンクス平衡塩溶液でそれらを洗います。 <ol><li>穏やかに振盪しながら37ºCで10分間100 U / mlのコラゲナーゼIVを含むハンクスバッファーでそれらをインキュベートすることによってプレートにクラスタ化された細胞を解離させます。その後、5分間、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）中の0.25％トリプシンを加えます。 </li><li> RPMI / B27培地中で、10％ウシ胎児血清を酵素溶液を中和した後、RPMI / B27培地中で細胞を再懸濁。 </li><li>血球計数器により細胞数をカウントします。培養非心筋細胞は、培養皿の表面に付着することを可能にする、少なくとも3時間、5％CO 2、37℃で10cmの皿に細胞。 </li></ol></li><li> hiPSC-のCMが含まれている細胞懸濁液を、収集し、ゲル状のタンパク質混合物でコーティングされた表面上でそれらを培養することによって細胞（10cmディッシュあたり1×10の周りに6個の細胞）を維持します。 </li></ol> 2. hiPSC-ECのにhiPSCsの区別<ol><li>目をインキュベートすることにより単一細胞にhiPSC集団を解離5分間、5％CO 2、37℃でのキレート剤とEM。新鮮なmTeSR1培地を含む15ミリリットルの遠心チューブに細胞を移します。 </li><li> 5分間、200×gで細胞をスピンダウン。 10μMのROCK阻害剤を補充したmTeSR1培地で細胞を再懸濁します。血球計数器を用いて細胞密度を決定します。 </li><li> 24ウェルプレートの1ウェルに20 NIH単位/ mlのトロンビン溶液の250μlのを追加します。 </li><li> 12.5 mg / mlでフィブリノゲン溶液の250μlに1×10 6 hiPSCsを追加します。そして、トロンビンロードウェルに細胞含有フィブリノーゲン溶液の250μlを添加します。混合物を分以内hiPSC含有フィブリン足場を形成するために固化観察します。 </li><li>カバーガラスをピンセットで6ウェルプレートのウェルに凝固、細胞を含む足場を転送し、インスリンなしで2％のB27を補充した2 mlのEBM2培地で足場を培養することによって分化を開始し、アクチビンA（50ngの/ミリリットル）、及びBMP-4（25 ngの/ ml）を、5％CO 2で24時間<sUB&gt; 2、37℃です。 <ol><li>細胞を穏やかに触れることなく真空を介して、古い培地を吸引して培地を交換してください。インスリンなしB27を補充した新しいEBM2培地、血管内皮増殖因子（VEGF、50ngの/ mlで）、エリスロポエチン（EPO、100ng / mlの）、およびトランスフォーミング増殖因子β1（TGFβ1、を10ng / ml）を、培養に追加48時間、5％CO 2、37℃で足場。 </li><li>さらに48時間、5％CO 2、37℃で培地および培養足場を更新します。その後、培地に200 UのコラゲナーゼIV（100U / ml）を添加することによって、足場から細胞を放出します。 </li><li>彼らがリリースされた後に細胞をスピンダウン。 B27、VEGF-A（50 ngの/ mlの）、およびSB-431542（10μM）の2％を補充した2ミリリットルEGM2-MV培地で培地を交換してください。 2日毎に培地を更新します。 </li><li>約10日後（ すなわち 、分化が開始された後に14〜日に）、Hを分離、100 U / mlのコラゲナーゼIVで細胞を解離フローサイトメトリーを介した分化細胞の集団からIPSC-のECは、EC特異的マーカータンパク質の発現について解析する（ 例えば 、CD31、CD144）3。 </li><li>確立されたプロトコル3を介して、単離されたhiPSC-のECを展開します。 </li></ol></li></ol> 3. hiPSC-のSMCにhiPSCsの区別<ol><li>コンフルエント（〜2日）まで、毎日培地交換で、5％CO 2、37℃でゲル状のタンパク質の混合物でコーティングされたプレート、および文化へのhiPSCs mTeSR1培地中で細胞をシード。 </li><li> 3日間RPMI1640培地と2％のB27プラスインスリンでCHIR99021（5μM）およびBMP-4（10ng / ml）で細胞を培養することにより、中胚葉系細胞への分化を開始します。 </li><li> 主に合成表現型とhiPSC-たSMCを生成するには： <ol><li>培養RPMI1640私におけるVEGF-A（25ngの/ ml）を、線維芽細胞成長因子β（FGFβ、5 ngの/ mlで）を有する細胞<html> dium、4日間、5％CO 2、37℃で2％のB27マイナスインスリン。 </li><li> 5％CO 2、37℃で培養VEGF-A（25ngの/ ml）でのセル、FGFβ（5 ngの/ ml）をRPMI1640培地中で、2％のB27プラスインスリン 2日間Cを°。 </li><li>培養血小板由来成長因子β（PDGFβ、を10ng / ml）を、TGFβ、5％CO 2、37℃でRPMI1640（3 NG / ml）を、2％のB27を加えたインスリンのセル 4日間Cを°。 </li></ol></li><li> 主に収縮表現型とhiPSC-たSMCを生成するには： <ol><li> RPMI1640および2％のB27のマイナスインスリンにおけるVEGF-A（25 ngの/ ml）及びFGFβ（5 ngの/ ml）で培養4日間細胞を。 </li><li> RPMI1640および2％B27プラスインスリンにおけるPDGFβ（5ng / ml）およびTGFβ（2.5 ngの/ ml）で7日間培養細胞を。 </li></ol></li><li> 〜6日間RPMI1640代謝培地を含有する乳酸（4ミリモル）で細胞を培養することにより、最終的なhiPSC-SMC集団を精製します。 </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4。IGF-含むマイクロスフェアを作成します<ol><li>水浴中で45℃にオリーブオイルを加熱します。 </li><li>加熱を50℃に10％ゼラチン溶液5ml。 </li><li>オリーブオイル、攪拌にゼラチンを追加し、水浴に氷を添加することにより、5℃に、その後急速に冷却します。 </li><li> 25分後に、マイクロスフェアの形成を誘導するためにオリーブオイルを冷蔵（4℃）アセトンを追加します。 </li><li> 5の温度を維持します 1時間°C;その後、オリーブオイルを除去するために、予め冷却したアセトンでそれらを5回洗浄し、マイクロスフェアを収集し、4℃で空気乾燥し、それらを可能にします。 </li><li>架橋を誘導するために、一晩4℃で70％エタノールおよび0.25％グルタルアルデヒド溶液でマイクロスフェアを再懸濁し、次いで、100mMグリシンとの混合物を中和します。 </li><li> 5μgのIGFの30分間、0.1％ウシ血清アルブミンを含有するH 2 Oを蒸留15μlの5 mgの微小球を混合してマイクロスフェアに負荷IGF。 </li></ol> 5.損傷部位の上にパッチを作成し、細胞を注入<ol><li> 1ミリリットル最小必須培地（MEM）で一緒にhiPSC由来のSMC（100万）のCM（2百万円）と、電気部品（100万）を一時停止します。 </li><li> 1ミリリットルフィブリノゲン溶液（25 mg / mlで）中の微小球の5ミリグラムを一時停止します。 </li><li>細胞含有液、フィブリノーゲン/マイクロスフェア溶液と別の注射器、およびトロンビン溶液1mlを有する第3シリンジで1注射器を記入（80 NIH単位は/ミリリットル、2μlの400 mMの塩化カルシウムおよび200mMのεアミノカプロンを補っ酸）。 </li><li>外科2の前に説明したように左冠動脈前下行枝の結紮を介し豚の心に心筋梗塞を誘発します。 注：簡単な、女性ヨークシャーブタ（〜13キロ、年齢の45日）でテラゾール/キシラジン（4.4ミリグラム/キログラム）の筋肉内注射で鎮静され、およびイソフルラン（0.5から5パーセント）で全身麻酔下挿管。 4 番目の intercostal開胸を行い、左前下降冠状動脈を露出しています。冠状動脈を60分間結紮によって閉塞され、次いで、結紮を除去します。即時の電気的除細動は、心室細動の場合に行われます。 </li><li>豚の心臓の梗塞領域の心外膜上の位置滅菌プラスチックリング（〜2.5センチメートル）、その後、同時にリングにマイクロスフェア/フィブリノゲンとトロンビンのソリューションを注入します。 </li><li>混合物は、（〜30秒）固化することを許可し、その後、梗塞心筋に固化した混合物を介して細胞含有注射器の針を挿入し、細胞を注入します。動物の大きさに応じて、3-0または2-0モノクリル縫合糸で筋肉層、皮下組織、および胸壁を閉じます。ブプレノルフィン0.01〜0.02ミリグラム/ kgの筋肉内注射の8時間ごとに、手術後の最初の3日間、疼痛を制御するために使用されます。 </li><li>心臓磁気共鳴を用いた心機能を評価します外科手術、一週間、手術手順2、3、4後4週間前にイメージング（MRI）。最終的なMRI研究の後、動物を犠牲にし、組織学および分子解析2、3、4のための彼らの心を処理します。 </li></ol>

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hiPSC-のCMの歩留まりの向上/純度 CMSにヒト幹細胞を分化するための従来のプロトコルは、多くの場合、低い収率および純度によって制限されます。例えば、ヒトES細胞-CMSのわずか35から66まで%は遅いミオシン重鎖またはcTnTの6を表明パーコール分離および心臓体形成を介して得られます。分化hiPSC-CM集団の純度は、実質的にCM特異的タンパク質7、8、9のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子の発現のために選択することによって増加させることができるが、この手法は必ずしも遺伝的に改変されたの使用を必要とします特に臨床研究のために、望ましくない細胞、。ここで紹介するプロトコルでは、hiPSC-CMSの68％は、cTnTのを表明し、純度はその後、遺伝子操作または単一ずに顕微解剖し、プレめっきを経由しての&gt; 90％増加しました-cell選択。総...

ヒトの人工多能性幹細胞（hiPSCs）は、患者の免疫系によって拒絶されていない細胞の潜在的に無限の範囲と量に分化させることができるので、再生細胞療法のための最も有望な薬剤の一つです。 （平滑筋細胞を但し、自己複製および分化のための能力はまた、腫瘍形成につながる可能性があり、その結果、hiPSCsは、完全にこのような心筋細胞（CMS）、内皮細胞（EC）、および平滑筋細胞などの特定の細胞型に分化することが必要）、投与前。細胞投与の最も簡単で最も一般的な方法の1つは、直接心筋内注射であるが、本来の心筋組織により生着された移植細胞の数が非常に低いです。このスレの多くは、虚血組織の細胞毒性環境に起因することができます。しかし、マウスの胚性幹細胞（ESC）は、O、無傷心臓の心筋に直接注入しました。NLY〜配信500万細胞の40％は、それらが中に製造された高圧力によって針トラックを通って絞り出されたせいか、投与された細胞のかなりの割合は、投与部位を終了したことを示唆している3-5時間1、のために保持しました心筋収縮。 ここでは、（SMCの）4 hiPSC由来の心筋細胞（hiPSC-CMS）2、内皮細胞（hiPSC-ECS）3、および平滑筋細胞を生成するための新規かつ、実質的に、より効率的な方法を提示します。注目すべきは、このhiPSC-SMCプロトコルは、主に合成または収縮SMC表現型に向かって細胞を向けることによって、体細胞のSMC 5で観察された形態学的および機能的特性の広い範囲を模倣する最初のものです。我々はまた、サイトカインを含むフィブリンPを作成することにより、注入された細胞の生着率を改善細胞送達の方法を提供します注射部位の上にATCH。パッチは、少なくとも3日間の期間にわたってインスリン様成長因子（IGF）を放出することにより、心筋から出るセルを防止する針トラック、及び細胞生存を封止することにより、両方の細胞保持を改善するように見えます。

<table><tbody><tr><td>プロトコルセクション1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1中</td><td>幹細胞技術</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>成長因子減少マトリゲル</td><td>コーニングライフサイエンス</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>幹細胞技術</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>B27サプリメント、無血清</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>アクチビンA</td><td>のR&D</td><td>338-AC-010</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R&D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>のR&D</td><td>232-FA-025</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ IV</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック・ <td>NC0217889</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液 (デキストロース、KCl、KH2PO4、NaHCO3、NaCl、Na2HPO4無水)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td>・<td>14175079</td><td></td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック・サイエンティフィック <td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Corning Lifescience</td><td>356721</td><td></td></tr><tr><td>10 cm ディッシュ</td><td>Corning Lifescience</td><td>354732</td><td></td></tr><tr><td>細胞インキュベーター</td><td>パナソニック</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>プロトコル セクション 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>フィブリノーゲン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630-5G</td><td></td></tr><tr><td>トロンビン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7009-1KU</td><td></td></tr><tr><td>EMB2 ミディアム</td><td>ロンザ</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>ProSpec-Tany</td><td>CYT-241</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Life Technologies</td><td>PHC9431</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&#946;</td><td>Peprotech</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>EGM2-MV媒体</td><td>ロンザ</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Selleckchem</td><td>S1067</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>BDB555445</td><td></td></tr><tr><td>CD144</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>560411</td><td></td></tr><tr><td>15ml遠心分離管</td><td>フィッシャーサイエンティフィック12565269</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Section 3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>幹細胞技術</td><td>720542</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-&#946;</td><td>Prospec</td><td>CYT-501-10ug</td><td></td></tr><tr><td>プロトコルセクション4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>オリーブオイル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1514</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー科学BP2818100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>IGF</td><td>R&D</td><td>291-G1-01M</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15561020</td>加熱プレートフィッシャーサイエンティフィックSP88850200<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-462-10Q</td><td></td></tr><tr><td>プロトコルセクション5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>&#949;-アミノカプロン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0420000</td><td></td></tr><tr><td>MEM medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482748</td><td></td></tr><tr><td>麻酔人工呼吸器</td><td>Datex-Ohmeda</td><td>47810</td><td></td></tr><tr><td>麻酔人工呼吸器</td><td>Ohio Medical</td><td>V5A</td><td></td></tr><tr><td>除細動器</td><td>Physiol Control</td><td>LIFEPAK 15</td><td></td></tr><tr><td>1.5 T MRI</td><td>General Electric</td><td>Signa Horizon LX</td><td></td></tr><tr><td>7 T MRI</td><td>Siemens</td><td>10018532</td><td></td></tr><tr><td>Gadolinium Contrast Medium (Magnevist)</td><td>Berlex</td><td>50419-188-02</td><td></td></tr><tr><td>2-0 シルク縫合</td>糸 <td>Ethilon</td><td>685H</td><td></td></tr><tr><td>3-0 シルク縫合糸</td><td>Ethilon</td><td>622H</td><td></td></tr><tr><td>3-0モノフィラメント縫合糸</td><td>Ethilon</td><td>627H</td><td></td></tr></tbody></table>

多能性幹細胞は、心筋の修復のための心臓細胞を派生します

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

ヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）が完全に投与する前に、特定の細胞型に分化されなければならないが、心筋細胞（hiPSC-CMS）にhiPSCsを区別するための従来のプロトコル、内皮細胞（hiPSC-ECS）、および平滑筋細胞（平滑筋細胞）は、しばしば低収量、純度、および/または貧弱な表現型の安定性によって制限されます。ここで、我々は、新規hiPSC-のCMを生成するためのプロトコル、-ECs、実質的に従来の方法よりも効率的です-SMCs、ならびに投与のサイト上で作成されたサイトカインを含むパッチで細胞注入を組み合わせるための方法を提示します。パッチは、長期間にわたってインスリン様成長因子（IGF）を放出することにより、心筋から絞り出されてから細胞を防ぐために、針の軌道、及び細胞生存を封止することにより、注入された細胞の保持の両方を改善します。心筋虚血再灌流傷害のブタモデルにおいて、生着率が時より2倍大きかったです細胞は、細胞とパッチの両方を有するサイトカイン含有貼付せずに細胞に比べ、パッチ、および治療を投与したが、一人ではない細胞を用いて、心機能および梗塞サイズの大幅な改善と関連していました。

差別hiPSC-CMを、-ECs、および-SMCsのキャラクタリゼーション hiPSCsの微分容量は2、3、4を評価しました。フローサイトメトリー心臓トロポニンT（cTnTの）の発現の分析は、最終的なhiPSC-CM集団の純度は90％（ 図1A、1B、パネルB1）を超えることができることを示唆しています。約25％がミオシン軽鎖（MLC2v）（ 図1B、パネルの2Vアイソフォームを発現したほぼすべての細胞のは、遅いミオシン重鎖（ 図1B、パネルA1）、α-筋節アクチン（ 図1B、パネルA2）で表さ唯一の心室の...

我々は、心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞およびパッチ媒介性サイトカインの送達と細胞注射を組み合わせることにより、移植細胞の生着を改善する配送方法に、ヒト人工多能性幹細胞を分化するための3つの新規かつより効率的なプロトコルを提示します。

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

このビデオの全体的な目的は、ヒト多能性幹細胞を心筋細胞へ分化させる手法を紹介し、これらの細胞を用いて虚血再灌流傷害後の心筋修復を研究する方法を実演することです。この手法は、心筋修復のためにヒトiPS細胞由来の心細胞を用いて心臓組織を構築するという重要な課題を解決するのに役立ちます。この手順の主な利点は、精製された心筋細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞を回収し、これらの前駆細胞を用いて心臓組織を生成できることです。Ling GaoはUABのZhang博士の研究室のポストドクターであり、Greg WalcottはUAB病院の循環器内科医です。TrinaはUAB病院のMRIスペシャリストです。多能性幹細胞を心筋細胞に分化させるには、まず、4 °Cまで冷却した成長因子低減ゼラチンタンパク質混合液で6ウェルプレートのウェルをコーティングします。その後、プレートを4 °Cで一晩冷蔵します。翌日、ゲル状のタンパク質混合物を吸引し、1ウェルあたり1億個の幹細胞をプレートに播種します。幹細胞をインキュベーター外に15分以上放置しないでください。また、常に新鮮な培地を使用してください。本手順では、10 $\mu$MのROCK阻害剤を添加したmTeSR1培地を使用します。その後、細胞を37 °C、5% $\text{CO}_2$条件下で培養し、細胞に触れないように慎重に旧培地を吸引除去した後、トランスファーピペットを用いて新鮮な培地を加え、毎日培地を交換してください。細胞をコンフルエンスが90%になるまで培養します。分化開始から3日後、収縮する細胞のクラスターが出現していないか確認し始めます。収縮が認められた時点で（通常は1週間ほどかかります）、細胞を回収します。ヘモサイトメーターを用いて回収細胞数を計測し、10 cmプレートに1 mLあたり100万個の濃度で細胞を播種します。また、幹細胞から内皮細胞や平滑筋細胞を作製することも可能です。これらのプロセスは異なりますが、テキストプロトコルに詳細に記載されています。まず、ブタの心臓に外科的に心筋梗塞を誘発します。簡潔に述べると、第4肋間胸壁切開を行い、左前下降冠動脈を露出させます。その後、結紮を用いて冠動脈を60分間遮断します。必要に応じて心臓に除細動を行います。5 mgのマイクロスフィアを1 mLのフィブリノゲン溶液に懸濁させ、これをシリンジに充填します。次に、別のシリンジに1 mLのトロンビン溶液を満たします。1時間が経過した後、心筋梗塞を誘発するために使用した結紮糸を除去します。次に、梗塞領域の心外膜上にプラスチックリングを配置し、マイクロスフィアとフィブリノゲン、およびトロンビン溶液を同時にリング内に注入します。溶液の混合物が凝固するまで待ちます。これには約30秒かかります。これによりパッチが作成されます。次に、細胞が入ったシ

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

私たちは、人間の心臓前駆細胞の大量供給と心血管修復のための機能的な心筋細胞の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接cardioblastsの誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

整列心筋組織の生成が臨床的に有用な目的のために、幹細胞生物学の最近の進歩に適応させるための重要な要件です。ここに我々は、細胞の形や機能の正確な制御のためのマイクロコンタクトプリントのアプローチについて説明します。心臓前駆細胞由来の胚性幹細胞の高度に精製された集団を使用して、我々はそれから異方性、機能心筋組織を生成します。...

マイクロコンタクトプリントスルーアライン機能心筋組織の生成

例えば、高血圧または心筋梗塞などの心血管疾患のマウスモデルにおける心筋細胞送達は、回生広く研究において、異なる細胞型の治療可能性を試験するために使用される。そのため、詳細な説明およびこの外科処置の明確な可視化は、小型げっ歯類の心血管細胞治療の分析の限界と利点を定義するのに役立ちます。...

心筋内細胞送達：マウスハーツの観測

このプロトコルでは、マウスとヒトの胚性幹細胞の両方からの心前駆細胞の誘導が説明されます。このプロトコールの主な戦略は、胚性幹細胞株に改変された蛍光レポーターを使用して、フローサイトメトリーで心前駆細胞を濃縮することです。...

胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導

ここでは、機能、契約、心筋細胞のような細胞を生成するために若いヒト間葉系幹細胞源の心臓微分の潜在性を効率的に活用する方法を提案するの in vitro...

体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

機能的な心筋細胞発現 Tbx5、ミール 1 とミール 133 Mef2c、Hand2 GATA4 (GHMT2m) と一緒に TGF-β シグナルの阻害を介してプライマリ胚性線維芽細胞を再プログラムする手法をご紹介します。我々 のプロトコル 60% までの 7...

プロ線維性シグナル伝達の抑制を促進する誘導心筋細胞マウス胚性線維芽細胞のリプログラミング因子を介した

このプロトコルでは、心臓前駆細胞の内皮への分化技術について説明します。特に、血清濃度と細胞播種密度が内皮細胞の分化に及ぼす影響について焦点を当てています。...

低血清条件下で心臓前駆細胞の内皮への分化の誘導

ここでは、幹細胞移植前の DNA...

心臓の細胞治療幹細胞 DNA の完全性を評価します。

本プロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞由来の心血管細胞を含むメッシュ状の人工心臓組織を生成し、心臓病の細胞移植療法の調査を可能にする。...

生体内心筋修復用ヒトiPS細胞由来のメッシュ状の設計心臓組織の調製

ここでは、患者末梢血単核細胞からヒト心筋細胞を強固に生成・拡張するプロトコルを提示する。...

患者末梢血単核細胞からのヒト心筋細胞の発生と拡大

マウスの心筋梗塞部位周辺の超音波ガイド下細胞送達は、安全で効果的で便利な細胞移植方法です。...

心筋梗塞マウスにおける超音波ガイド下多能性幹細胞由来心筋細胞移植術

学ぶ多能性幹細胞から心筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞への分化法とパッチ介在細胞移植による心筋修復技術。効率的な心臓組織工学の手法を習得できます。

多能性幹細胞は、心筋の修復のための心臓細胞を派生します

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