単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

この手順の全体的な目標は、単一細胞のメガベーススケールのDNAコピー数の変化を特定することです。細胞集団におけるゲノムの不均一性を分類するためには、単一細胞の分解能でゲノムの変化を特定する必要があります。従来、これは細胞学的アプローチを使用して達成されていましたが、これらの方法は感度と特異性に限界がありました。

シングルセルシーケンシングは、さまざまなゲノム変化を検出でき、以前のアプローチよりも感度と特異性が向上していますが、それは慎重に実行した場合に限られます。ここでは、シングルセルシーケンシングを使用して、シングルセルのメガベーススケールのコピー数の変化を確実に検出する方法について説明します。マイクロアスピレーターを組み立てるには、まずアスピレーターチューブアセンブリから透明なプラスチックの端を取り外し、狭い端を内径3/16インチの1フィートの長さのPVCチューブの一端に挿入します。

0.2マイクロメートルのシリンジフィルターの出口を、内径3/16インチの1フィートの長さのPVCチューブのもう一方の端に挿入します。次に、0.2マイクロメートルのシリンジフィルターのインレットを、内径5/16インチの長さの6インチPVCチューブの一端に挿入します。5ミリリットルのプラスチック製血清ピペットを1ミリリットルの目盛りで壊し、壊れた端を5/16インチの内径のPVCチューブの開放端に挿入します。

次に、5ミリリットルのプラスチック製血清ピペットの出口を吸引器チューブアセンブリのフレキシブルエンドに挿入し、滅菌プラスチックチューブを使用してチューブアセンブリの赤いマウスピースを覆って保管します。ガラス毛細管を内径10〜30マイクロメートルまで引き抜きます チューブの中央を炎の近くに配置し、チューブの両端に張力をかけます。引き抜いたチューブを半分に割って、2つの潜在的な吸引針を作成します。

この手順を複数のチューブで繰り返して、単一細胞をピッキングするための適切な内径で十分な針が準備されていることを確認します。ヒト線維芽細胞株などの接着細胞を調製するには、トリプシン処理によって細胞を回収し、細胞を適切な培地を含む円錐管に移します。全ゲノム増幅用のフードを10%漂白剤を使用してフード、ピペットチップボックス、ピペットチップの表面にスプレーします。

次に、ペーパータオルを使用してそれらをすべて拭き取ってから、70%エタノールで洗浄を繰り返します。Whole Genome Amplification(WGA)キットから8マイクロリットルの水を個々のウェルに加え、96ウェルPCRプレートに添加します。次に、96ウェルPCRプレートを96ウェル組織培養プレートの蓋で覆い、プレートを氷の上に置きます。

次に、15センチメートルのペトリ皿に10ミリリットルの培地またはPBSに1, 000個の細胞を加え、皿を氷の上に置いて細胞が皿に付着するのを防ぎます。次に、氷上に置いたまま、ペトリ皿と96ウェルPCRプレートの細胞を10倍対物レンズを備えた光学顕微鏡に移します。伸長した針の端を硬い表面で軽くたたいて、先端が折れるようにして、吸引針の開口部を増やします。

次に、針の広い方の端をマイクロアスピレーターのクリアエンドに挿入します。次に、細胞の入ったシャーレを顕微鏡ステージに置きます。アスピレーターの赤いマウスピースを口の中に挿入します。

次に、一方を使用しながら吸引器の針を動かし、もう一方の手でペトリ皿を動かしながら、配列決定する単一細胞を特定しました。口腔吸引を使用して、約1〜2マイクロリットルの培地またはPBSとともに、単一のセルを吸引器の針に引き込みます。細胞を96ウェルPCRプレートの1つのウェル内の8マイクロリットルの水に移します。

シングルセルシーケンシングデータの品質と有用性は、各細胞の状態とそのゲノムに依存するため、細胞調製および微小吸引時には、生存細胞と非アポトーシス細胞を単離するように注意する必要があります。各細胞を吸引し、PCRプレートのウェルに移した後、細胞を受け取ったウェルに印を付けます。必要なセル数に対してこれを繰り返します。

その間に、Whole Genome Amplificationキットから10X Single Cell Lysis Fragmentation Bufferを解凍します。全ゲノム増幅時のコンタミネーションを防ぐために、すべての試薬を組織培養フード内に添加してください。フィルター付きのピペットチップを使用し、ウェル間でピペットチップを交換します。

最大32個の細胞の各セットについて、32マイクロリットルの10X Single Cell Lysis and Fragmentation Bufferと2マイクロリットルのProteinase K溶液を微量遠心チューブに組み合わせ、チューブをボルテックスして内容物を混合します。各ウェルに1マイクロリットルの溶液を加え、ピペットで上下に動かして混合します。プレートを覆い、プラスチックフィルムを使用してすべてのウェルをシールします。

次に、ミニプレートスピナーでプレートを短時間遠心分離します。次に、次のプログラムを使用してプレートをサーモサイクラーに通します。次に、プレートを氷の上で冷却し、短時間遠心分離します。

Whole Genome Amplificationキットから実用的なライブラリ調製バッファー溶液を調製するには、各細胞について、2マイクロリットルの1X Single Cell Library Preparation Bufferと1マイクロリットルのLibrary Stabilization Solutionを組み合わせます。全ゲノム増幅時のバイアスを最小限に抑え、高品質のシーケンシングライブラリを確実に調製するためには、適切な細胞溶解と完全なゲノム断片化が重要です。そのため、これらの手順は、記載されているとおりに正確に実行するように注意してください。

皿からプラスチックフィルムをはがし、各ウェルに3マイクロリットルの溶液を追加します。ウェルの内容物を上下にピペットで動かして混ぜ合わせ、プラスチックフィルムを交換します。プレートを短時間回転させた後、細胞を摂氏95度で2分間インキュベートし、プレートを氷上で冷却し、プレートを再度短時間遠心分離します。

次に、プラスチックフィルムをはがし、各ウェルに1マイクロリットルのLibrary Preparation Enzymeを追加し、ウェルの内容物を上下にピペットで動かして混合し、プラスチックフィルムを交換します。プレートを短時間回転させた後、サーモサイクラーに入れて、次のプログラムを実行します。プレートを冷却して短時間回転させた後、各細胞に48.5マイクロリットルの水、7.5マイクロリットルの10倍増幅マスターミックス、および5マイクロリットルのWGA DNAポリメラーゼを組み合わせて、全ゲノム増幅キットから作業用増幅ミックスを調製します。

ワーキングミックスを氷の上に保ちます。プレートからプラスチックフィルムをはがします。各ウェルに61マイクロリットルの作業増幅混合物を追加し、各ウェルの内容物を上下にピペットで動かして混合し、プラスチックフィルムを交換します。

プレートとサーモサイクルを次のように簡単に遠心分離します。サンプルをシーケンシングし、テキストプロトコルに従ってデータ解析を実行します。この図に示すように、全ゲノム増幅が成功すると、サンプルはアガロースゲルに塗抹標本として現れます。

微弱または不鮮明な塗抹標本は、増幅反応が失敗したことを示しており、サンプルのシーケンシングは行わないでください。ここに示すように、フラグメントサイズの分析は、フラグメントアナライザー上のキャピラリー電気泳動を使用して行いました。正常に調製されたライブラリは、150〜900塩基対のフラグメントサイズの分布がかなり均一になります。

ライブラリ調製に失敗すると、フラグメントサイズ分布が歪むため、そのようなライブラリはシーケンシングしないでください。隠れマルコフモデルと環状バイナリセグメンテーションを使用して、各細胞のゲノムを推定コピー数のセグメントに解析しました。この表は、単一細胞からの重なり合った結果を示しており、10番染色体が67メガベースから130メガベースに増加し、19番染色体が0から20メガベースに増加していることを示しています。

単一細胞の単離と全ゲノム増幅は、1日に行うことができ、また行うべきです。その後、シーケンシングライブラリの準備、全ゲノムシーケンシング、およびデータ解析を柔軟なスケジュールで実行できます。細胞の単離と全ゲノム増幅を適切に行い、上記のように厳密なデータ解析を行うと、5メガ塩基を超えるコピー数の変化を高い感度と特異性で検出することができます。

私たちのプロトコルでは、コピー数の変化を検出するためのシングルセルシーケンシングの使用が具体的に説明されていますが、シングルセルの単離やライブラリ調製などのこのプロトコルの側面は、他のゲノム変化を検出するために適用できます。