Name: 単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぶ単一細胞シーケンス法によるメガベース規模のDNAコピー数変化検出。マイクロアスピレーターと全ゲノム増幅を用いて、従来手法より高感度・高特異的にゲノム異質性を解析する信頼性の高いプロトコルです。

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我々は、この原稿上のコメントのスチュアート・レヴァインに感謝します。この作品は、コッホ研究所のサポート・グラントP30-CA14051によりアンゲリカアモンに部分的には健康グラントGM056800とキャシーとカートマーブルがん研究基金の国立研究所によってサポートされていました。アンジェリカアモンはまた、ハワード・ヒューズ医学研究所と生物医学研究のためのグレン財団の研究者です。 KAKはNIGMSトレーニンググラントT32GM007753でサポートされています。

<ol><li>Kahlem, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+Level+Alterations+Reflect+Gene+Dosage+Effects+Across+Multiple+Tissues+in+a+Mouse+Model+of+Down+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Transcript Level Alterations Reflect Gene Dosage Effects Across Multiple Tissues in a Mouse Model of Down Syndrome.</a> Genome Res. 14 (7), 1258-1267 (2004).</li>
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<li>KAPA Library Quantification Kit. , at: 
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<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).</li>
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<li>Szulwach, K. E., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Genetic+Analysis+Using+Automated+Microfluidics+to+Resolve+Somatic+Mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Genetic Analysis Using Automated Microfluidics to Resolve Somatic Mosaicism.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135007(2015).</li>
<li>Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Detection+of+Single-Nucleotide+and+Copy-Number+Variations+of+a+Single+Human+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell.</a> Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).</li>
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<li>Zhang, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromothripsis+from+DNA+damage+in+micronuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromothripsis from DNA damage in micronuclei.</a> Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).</li>
<li>Macaulay, I. C., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Genomics%3A+Advances+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives.</a> PLoS Genetics. 10 (1), e1004126(2014).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

伝統的に、このようなFISHおよびSKYなどの細胞学的方法を必要とした単一細胞のレベルでのCNVおよび異数性を識別する。今、単一のセル配列決定は、そのような質問のための代替的なアプローチとして浮上しています。それはゲノムワイドと高解像度の両方とおり、単一のセル配列決定は、FISHおよびSKYを上回る利点があります。適切な品質管理方法が適用される場合、それはFISHおよびSKYに固有のハイブリダイゼーションおよび拡散アーティファクトの影響を受けないようにまた、単一のセル配列決定は、より信頼性のCNVの評価と異数性を提供することができます。しかし、単一の細胞配列の最近のアプリケーションの多くは、方法および分析の感度及び特異性の徹底的な評価によって実証されていません。実際、他の研究で使用される分析的アプローチのいくつかは、偽陽性のCNV 12を呼び出すの高周波数（&gt; 50％）に関連しています。私たちが説明する手法は、厳密にKNの細胞を使用してテストされています真と偽発見率を決定し、CNV検出12の感度と特異性を最適化するために独自のCNV負担。このプロトコルに記載の品質管理および分析手法を用いて、5 MBの利得の約20％、5 MBの損失の75％、及び10メガビットを超えるすべてのCNVを検出することができます。単一セル配列の偽発見率を決定することは困難であるが、我々はそれが25％未満であると推定しています。このプロトコルは、さまざまなソースからの細胞に適用することができ、スクリプトは、CNVの検出の分解能を調整するために変更することができ、プロトコルは、ゲノム変化の他のタイプを識別するように構成することができます。 そこに単一細胞に新鮮な組織解離の様々な手段があり、多くの刊行物は、皮膚24および脳25のような特定の組織のために最適化された手順を説明します。それはfoを可能にするように私たちは、微小誤嚥により単一細胞を単離することを好みます<html>各セルのR視覚的評価を配列決定します。しかし、蛍光活性化細胞選別（FACS）26と、マイクロ流体デバイス27によって単一細胞を単離することも可能です。単一細胞の単離および全ゲノム増幅が手動で実行された場合、単離および単一座っに40セルまで増幅することが合理的です。高品質の単セルの配列決定データを得るためには、単一細胞のゲノムの増幅が均一かつ完全であることが重要です。我々は、溶解および増幅の効率、ならびに単離された単一細胞の品質は、配列決定データの品質に大きな影響を与えることを見出しました。このように、直前に分離し、全ゲノム増幅にその天然環境から採取されるべき細胞は、細胞が単離されている直後に開始すべきです。また、溶解および断片化のステップは、ステップ2.3から2.6に記載とおりに従うべきです。 &quot;&gt;アルゴリズムは、感度および特異性12に対向する効果と、CNVの検出の解像度を変更するように調整することができる。四倍11の設定で全染色体の異数性を検出するための閾値を調整することも可能であるが、我々は発見します全ゲノム増幅の間に導入されたノイズが小さく変種12の検出を複雑として我々のアプローチは、より大きい5メガビットのCNVを検出することに限定されています。全ゲノム増幅アプローチにおける今後の改善が、最終的に単一細胞の配列決定を使用して、CNV検出の分解能を向上させる必要があります。 単一細胞シーケンシングだけでなく、コピー数変化の調査だけでなく、一塩基変異28、29および構造的変化30を可能にします。単一細胞単離のための私たちのプロトコルは、これらの他のQUEに答えるためにも適用することができますstions。しかし、全ゲノム増幅方法の選択は、特定の用途に依存します。ポリメラーゼ連鎖反応に基づくもので、このプロトコルに記載された方法は、それが増幅偏り32のより低いレベルに関連付けられているため、コピー数の変化を検出するのに最適です。そのような一塩基多型などのゲノム変化の他のタイプを調べるために、全ゲノム増幅の他の方法は、31、32、より適していると考えられます。

DNAコピー数の変化は、いくつかの塩基対（コピー数変異体（）のCNV）から全染色体（異数性）のサイズの範囲であり得ます。ゲノムの大部分に影響を与えるコピー数変化は遺伝子1、2、数千までの発現を変化させることにより、大幅な表現型の結果を持つことができます。集団の全ての細胞に存在しているのCNVは、バルク配列決定またはマイクロアレイに基づく方法3,4により検出することができます。しかし、集団はまた、人口、あるいは単一細胞のサブセットで既存のCNVと、遺伝的に不均一であることができます。遺伝的異質性は、未知の結果5、6、7、8、9で、また、正常組織に存在する腫瘍の進化を駆動し、癌において一般的であり、かつ<suP&gt;、10。 伝統的に、遺伝的異質性は、細胞学的アプローチまたはバルク配列決定によっていずれかを評価しました。このような蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）、染色体スプレッド、スペクトル核型分析（SKY）のような細胞学的手法は、個々の細胞内に存在する変化を同定する利点を有するが、ハイブリダイゼーションおよび11の拡散アーチファクトによる高いエラー率を有します。これらのアプローチはまた、いくつかのメガベースに及ぶ彼らの解像度のみ明らかコピー数変化に限定されています。バルクのDNAの配列決定またはマイクロアレイは、精度と分解能が高いものの、あまり敏感です。集団ベースのアプローチによって遺伝的多様性を検出するために、変異体は、集団中の細胞のかなりの割合で存在しなければなりません。単一細胞からのゲノムDNAを増幅する方法の出現は、それが可能な単一細胞のゲノムの配列を決定することが可能となりました。単一細胞sequencingは、高解像度、高感度、かつ、適切な品質管理方法が適用され、高精度12の利点を有します。 ここでは、単一細胞におけるメガベーススケールコピー数変化を検出するための方法を記載します。私たちは、微小誤嚥により単一細胞を単離し、リンカー - アダプターPCRを用いてゲノムDNAを増幅し、次世代シーケンシングのためのライブラリを準備し、隠れマルコフモデルと円形バイナリセグメンテーションの両方でコピー数の変異体を検出します。

<table><tbody><tr><td>校正済みマイクロキャピラリーピペット用アスピレーターチューブアセンブリ</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>PVCチューブ(ID 3/16インチ、OD 5/16インチ、~1フィート)</td><td>VWR</td><td>89068-500</td><td></td></tr><tr><td>PVCチューブ(ID 5/16インチ、OD 7/16インチ、~6インチ)</td><td>VWR</td><td>89068-508</td><td></td></tr><tr><td>HT Tuffryn膜付きアクロディスクシリンジフィルター(直径25 mm、細孔サイズ0.2 & マイクロ;m)</td><td>VWR</td><td>28144-040</td><td></td></tr><tr><td>血清学ピペット (5 mL)</td><td>BioExpress</td><td>P-2837-5</td><td></td></tr> 酸素<tr><td>使用のためのインライン ウォーター トラップ</td><td>Amazon.com</td><td>700220210813</td><td></td></tr><tr><td>毛細血管融点チューブ (ID 0.8-1.1 mm、長さ 100 mm)</td> <td>VWR</td><td>34502-99</td><td></td></tr><tr><td>モデリング粘土</td><td>VWR</td><td>470156-850</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿(直径150 mm)</td><td>VWR</td><td>25384-326</td>表面<td>は、単一細胞の硬質シェルの吸引を容易にするために非接着性でなければなりません</td></tr><tr><td>。フルハイト96ウェルセミスカートPCR&nbsp;プレート</td><td>バイオ・ラッド</td><td>HSS9601</td><td>96ウェルPCRプレートなら十分</td></tr><tr><td>96ウェル組織培養プレート</td><td>VWR</td><td>62406-081</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex シングルセル全ゲノム増幅キット</td><td>シグマ</td><td>WGA4</td><td></td></tr><tr><td>マイクロシール 'A' フィルム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>MSA5001</td><td></td></tr><tr><td>ミニプレートスピナー</td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>1225Z37</td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096&nbsp;</td><td>96ウェルPCRプレートを収容できるものであれば、どのサーマルサイクラーでも十分です</td></tr><tr><td>Agencourt Ampure Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>同様の磁気チューブストリップで十分です</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA ライブラリ調製キット</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1012</td><td></td></tr><tr><td>コンプリートキット (Roche LightCycler 480 用に最適化)</td><td>カパバイオシステムズ</td><td>KK4845&nbsp;</td><td>このキットは、Roche LightCycler 480リアルタイムPCRマシン用に最適化されています。別のマシンを使用している場合は、マシンに最適化されたキットに交換してください。</td></tr></tbody></table>

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

単細胞解像度におけるゲノム変化の検出は、正常組織、癌、微生物集団における遺伝的多様性と進化を特徴づけるために重要です。遺伝的異質性を評価するための従来の方法は、低解像度、低感度、および/または低特異性によって制限されています。単一細胞配列決定は適切に分析し、高解像度、高感度かつ、高い特異性で遺伝的多様性を検出するための強力なツールとして浮上しています。ここでは、単一細胞の単離、全ゲノム増幅、シーケンシング、および分析のためのプロトコルを提供します。我々のアプローチは、単一細胞におけるメガベーススケールコピー数変異体の信頼性の同定を可能にします。しかしながら、このプロトコルの態様は、単一細胞における遺伝子変化の他のタイプを調査するために適用することができます。

組み立てられた吸引器は、 図1Aの1のようになります。針はなく、とても広い大ボリュームは、単一のセルに引き上げられることを1つのセルを収容するのに十分な幅であるように描かれるべきです。 10Xフィールドに1と5細胞（ 図1B）との間に存在する場合、単一の細胞を吸引することが最も簡単です。 全ゲノム増幅が成功した場合、試料は、アガロースゲル上のスメアとして現れる（ 図2、レーン1、2、4、5、6、および7）であろう。かすかまたは不在スミアが失敗した増幅反応を示し、サンプルが（レーン3および8、 図2）配列決定されるべきではありません。 ライブラリーの調製後、試料の断片サイズ分布は、フラグメント分析のキャピラリー電気泳動によって評価されるべきです。正常に準備ライブラリは、150から900塩基対（ 図3、A、B）にフラグメントサイズのかなり均一な分布を持つことになります。 （ 図3C）配列決定されるべきでないライブラリの準備がスキュー断片サイズ分布およびこのようなライブラリーになりませんでした。 隠れマルコフモデル（HMMcopy）と円形バイナリセグメンテーション（DNAcopy）を介して配列決定データを処理すると、推定コピー数のセグメントに各細胞のゲノムを解析します。これらのセグメントは、単一のセル（ 表1）の利得または損失と一致推定コピー数を有するものを同定するために濾過することができます。 HMMcopyとDNAcopyからこれらのフィルタ処理のセグメントは、その後、高信頼のCNVを識別するためにオーバーラップする必要があります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig1.jpg" /> 1.単一細胞の単離図。 （<html> A）Anがmicroaspiratorを組み立てました。 （B）10Xフィールドかを示すには、細胞（矢印）とmicroaspirator針（右下）を解離しました。 10Xフィールドに1〜5つのセルがある場合、単一の細胞を吸引することが最も簡単です。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig2.jpg" /> 2.全ゲノム増幅図。全ゲノム増幅産物の5μlをアガロースゲル電気泳動。正常に1 kbの100塩基対から明るいスミアが現れる増幅サンプル（レーン1、2、4、5、6、および7）、配列決定することができます。正常に増幅しないサンプルは、かすかなスメアまたは全く汚れ（レーン3および8）を生成し、配列決定されるべきではありません。large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig3.jpg" /> 図3.ライブラリの準備。フラグメント分析から代表的な結果。グラフは、Y軸上にX軸、相対蛍光単位（RFU）で（BP）にフラグメントサイズを示します。各グラフの右側にシミュレートされたゲルのレーンです。 （A）は、150〜900 bpおよび鋭いピークまたは1側に偏りのない均一な分布で、理想的なサンプルについての結果。このサンプルでは、​​配列決定のために許容可能です。サイズ分布を有する大丈夫サンプルから（B）の結果は、下のフラグメントサイズに偏っ。これは最適ではないが、サンプルがまだ配列決定され得ます。 （C）は 、主に小断片サイズで、失敗したサンプルから得られた結果。これはおそらくtagmentationステップ中に長時間のインキュベーションによって引き起こされますライブラリの準備の。このサンプルでは、​​配列決定されるべきではありません。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="7"> HMMcopy </td></tr><tr><td> サンプル </td><td> セグメント </td><td> chrです </td><td> 開始 </td><td> 終わり </td><td> 状態 </td><td> 中央値 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 23 </td><td> chr8 </td><td> 144500001 </td><td> 1.465億</td><td> 6 </td><td> 0.5008794 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 29 </td><td> chr10 </td><td> 67000001 </td><td> 1.345億</td><td> 6 </td><td> 0.4031945 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 52 </td><td> C言語hr19 </td><td> 1 </td><td> 20,000,000 </td><td> 6 </td><td> 0.4616884 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 57 </td><td> chrY </td><td> 1 </td><td> 5950万</td><td> 2 </td><td> -1.506532 </td></tr><tr><td colspan="8"> DNAcopy </td></tr><tr><td> サンプル </td><td> CHROM </td><td> スタートビン </td><td> エンドビン </td><td> 開始 </td><td> 終わり </td><td> ワンセグ平均 </td><td> ワンセグMED </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr10 </td><td> 88 </td><td> 197 </td><td> 62612945 </td><td> 129971511 </td><td> 1.4688 </td><td> 0.157 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr19 </td><td> 0 </td><td> 31 </td><td> 0 </td><td> 28416392 </td><td> 1.4141 </td><td> 0.1674 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chrX </td><td> 77 </td><td> 126 </TD&gt; <td> 51659160 </td><td> 95343369 </td><td> 1.3548 </td><td> 0.1874 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chrY </td><td> 0 </td><td> 14 </td><td> 0 </td><td> 23805358 </td><td> -2.7004 </td><td> 0.3591 </td></tr></tbody></table> 表1.データ分析。単一の細胞からHMMcopyとDNAcopyによって生成されたフィルタ処理セグメント。これら二つの結果が重複すると、67〜130メガビットから10番染色体上の利益だけでなく、20 MBに0から19番染色体上の利益を明らかにする。私たちは、19番染色体の近位部益は、単一細胞シーケンシング12の人工物であることを見出しました。

単一細胞配列決定は、高解像度でゲノムの変化に対処するため、ますます人気とアクセス可能なツールです。我々は、単一の細胞内のコピー数の変化を識別するために、単一細胞の配列決定を使用するプロトコルを提供します。

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

本手順の目的は、単一細胞におけるメガベーススケールのDNAコピー数変化を特定することです。細胞集団におけるゲノムの不均一性を分類するためには、単一細胞レベルの解像度でゲノム変化を特定する必要があります。従来、これは細胞学的アプローチを用いて行われてきましたが、これらの手法は感度と特異度に限界がありました。シングルセルシーケンシングは、慎重に実施すれば、従来の手法よりも高い感度と特異度でさまざまなゲノム変化を検出できます。本稿では、シングルセルにおいてメガベーススケールのコピー数異常を確実に検出するための、シングルセルシーケンシングの使用方法について説明します。マイクロアスピレーターを組み立てるには、まずアスピレーターチューブアセンブリから透明なプラスチック端を取り除き、その細い端を内径3/16 inchの長さ1フィートのPVCチューブの一端に挿入します。内径3/16 inchの長さ1フィートのPVCチューブのもう一方の端に、0.2 µmシリンジフィルターの出口を挿入します。次に、0.2 µmシリンジフィルターの入口を、内径5/16 inchの長さ6インチのPVCチューブの端に挿入します。5 mLプラスチック製セロロジカルピペットを1 mLの目盛り部分で折断し、その折断端を内径5/16 inchのPVCチューブの開口端に挿入します。次に、5 mLプラスチックセロロジカルピペットの出口をアスピレーターチューブアセンブリのフレキシブル端に挿入し、保管のために滅菌プラスチックチューブでチューブアセンブリの赤いマウスピースを覆います。チューブの中央を火に近づけ、チューブの両端に張力をかけることで、ガラスキャピラリーチューブを内径10-30 µmまで延伸させます。延伸させたチューブを2等分に折り、2本のアスピレーター針を作成します。単一細胞をピックアップするのに適した内径を持つ針を十分に準備するため、この工程を数本のチューブで繰り返します。ヒト線維芽細胞株などの接着細胞を準備する場合は、トリプシン処理によって細胞を回収し、適切な培地を含むコニカルチューブに細胞を移します。全ゲノム増幅のためのクリーンベンチのセットアップとして、10%漂白剤を使用してベンチの表面、ピペットチップボックス、およびピペットチップをスプレーで洗浄します。次に、ペーパータオルですべてを拭き取り、70% ethanolで洗浄を繰り返します。全ゲノム増幅（Whole Genome Amplification: WGA）キットに含まれる水を8 µLずつ、96ウェルPCRプレートの各ウェルに分注します。その後、96ウェル組織培養プレートの蓋で96ウェルPCRプレートを覆い、プレートを氷上に置きます。次に、15 cmのペトリ皿に入れた10 mLの培地またはPBSに1,000個の細胞を加え、細胞が皿に接着するのを防ぐため、皿を氷上に置きます。その後、氷上に置いたまま、ペトリ皿に入れた細胞と96ウェルPCRプレートを、10倍対物レンズを備えた光学顕微鏡に移動させます。アスピレーター針の引き伸ばされた先端を硬い表面に軽く叩いて先端を切り離し、針の開口部を広げます。次に、針の太い端をマイクロアスピレーターの透明な端に挿入します。続いて、細胞が入ったペトリ皿を顕微鏡のステージ上に置きます。アスピレーターの赤いマウスピースを口に当てます。次に、片方の手でアスピレーター針を動かし、もう片方の手でシャーレを動かしながら、シーケンスを行う単一細胞を特定します。口による吸引を用いて、単一細胞を約1～2 µLの培地またはPBSとともにアスピレーター針内に吸い込みます。その後、その細胞を96ウェルPCRプレートの1ウェルにある8 µLの水に転送します。シングルセルシーケンシングデータの品質と有用性は、各細胞およびそのゲノムの状態に依存するため、細胞調製およびマイクロアスピレーションの際は、生存しておりアポトーシスを起こしていない細胞を単離するように注意してください。各細胞を吸引してPCRプレートのウェルに転送した後、細胞が入ったウェルに印を付けます。これを目的の細胞数分繰り返します。その間に、Whole Genome Amplificationキットに含まれる10X Single Cell Lysis Fragmentation Bufferを融解させます。全ゲノム増幅中のコンタミネーションを防ぐため、すべての試薬はティッシュカルチャーフード内で添加してください。フィルター付きのピペットチップを使用し、ウェルごとにチップを交換してください。最大32個までの細胞1セットにつき、10X Single Cell Lysis and Fragmentation Buffer 32 µLとProteinase K溶液 2 µLをマイクロ遠心チューブに合わせ、チューブをボルテックスして内容物を混合します。この溶液を各ウェルに 1 µLずつ加え、ピペッティングして混合します。プレートに蓋をし、プラスチックフィルムを用いてすべてのウェルを密封します。次に、ミニプレートスピナーでプレートを短時間遠心します。続いて、以下のプログラムを用いてサーモサイクラーでプレートを処理します。その後、プレートを氷上で冷却し、短時間遠心します。Whole Genome Amplificationキットを用いてライブラリ調製用ワーキングバッファー溶液を調製するには、細胞1個につき、1X Single Cell Library Preparation Bufferを2 µLとLibrary Stabilization Solutionを1 µLを混合します。全ゲノム増幅時のバイアスを最小限に抑え、高品質なシーケンシングライブラリを調製するためには、十分な細胞溶解と完全なゲノム断片化が不可欠です。そのため、これらの手順は記載通りに正確に実施してください。ディッシュからプラスチックフィルムを取り除き、各ウェルに溶液を3 µLずつ加えます。ウェル内の内容物をピペッティングして混ぜ合わせた後、プラスチックフィルムを戻します。プレートを短時間遠心分離した後、細胞を95 °Cで2分間インキュベートし、次にプレートを氷上で冷却し、再度プレートを短時間遠心分離します。次に、プラスチックフィルムを取り除き、各ウェルにLibrary Preparation Enzymeを1 µL加え、ウェル内をピペッティングして混合した後、再びプラスチックフィルムで蓋をします。プレートを短時間遠心し、サーマルサイクラーにセットして以下のプログラムを実行します。プレートを冷却し、短時間遠心した後、Whole Genome Amplification kitを用いて、水48.5 µL、10X amplification master mix 7.5 µL、WGA DNA polymerase 5 µLを細胞1個分ずつ混合し、増幅用ワーキングミックスを調製します。ワーキングミックスは氷上で保持してください。プレートからプラスチックフィルムを取り除きます。各ウェルに61 microlitersのワーキング増幅ミックスを加え、各ウェルの内容物をピペッティングして混合した後、プラスチックフィルムを戻します。プレートを短時間遠心分離し、以下の条件でサーマルサイクリングを行います。サンプルのシーケンシングおよびデータ解析は、テキストプロトコルに従って実施してください。本図に示されているように、全ゲノム増幅が成功すると、サンプルのアガロースゲル電気泳動像はスミア状に現れます。スメアが薄いか、あるいは認められない場合は増幅反応に失敗したことを示しており、そのサンプルはシーケンシングに用いるべきではありません。ここで示すように、フラグメントサイズの解析は、フラグメントアナライザーを用いたキャピラリー電気泳動により行われました。正常に調製されたライブラリでは、150から900 base pairsの範囲でフラグメントサイズが比較的均一に分布します。ライブラリ調製に失敗すると、断片サイズの分布に偏りが生じるため、そのようなライブラリをシーケンシングしてはいけません。隠れマルコフモデルと円形バイナリセグメンテーションを用いることで、各細胞のゲノムを推定コピー数ごとのセグメントに分割しました。この表は単一細胞からのオーバーラップ結果を示しており、第10染色体の67から130 megabase、および第19染色体の0から20 megabaseにおけるゲインが明らかになっています。単一細胞の分離および全ゲノム増幅は、同一日に行うことができ、またそうすべきです。その後のシーケンシングライブラリの調製、全ゲノムシーケンシング、およびデータ解析は、柔軟なスケジュールで実施可能です。細胞分離と全ゲノム増幅が適切に行われ、記述された通りに厳格なデータ解析が行われれば、5 Mbを超えるコピー数異常を高感度かつ高特異的に検出することができます。本プロトコルでは、コピー数変化の検出に特化してシングルセルシーケンシングの使用について説明していますが、シングルセルの単離やライブラリ調製などの本プロトコルの手法は、他のゲノム変化の検出にも適用可能です。

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Research

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Genetics

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学ぶ単一細胞シーケンス法によるメガベース規模のDNAコピー数変化検出。マイクロアスピレーターと全ゲノム増幅を用いて、従来手法より高感度・高特異的にゲノム異質性を解析する信頼性の高いプロトコルです。

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

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