リビジョン人工で新規診断: 超音波処理と多重ポリメラーゼの連鎖反応のインプラント

関節穿刺、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、および超音波処理を用いて説明される一連の手法の全体的な目的は、人工関節周囲感染が疑われる症例において、整形外科医に迅速かつ信頼性の高い微生物学的結果を提供することです。本手法は、病原体の早期発見、ひいては早期の標的治療といった、人工関節周囲感染の診断および治療分野における重要な課題の解決に寄与します。これらの技術の主な利点は、迅速に結果を得られることです。

人工関節周囲感染が疑われる症例において、鑑別診断を迅速化させることができます。患者を診察台の上に仰臥位で눕かせます。膝を穿刺する場合は、膝の下に膝ロールを配置し、膝が軽く屈曲した状態で保持されるようにします。

電気バリカンを使用して、密集しているか長い体毛を短くします。次に、テキストプロトコルに従って器具テーブルを準備し、手術着を着用します。続いて、皮膚消毒剤を使用して、穿刺部位の患者の皮膚を十分に洗浄します。

開口部のある滅菌ドレープで穿刺部位を覆います。次に、ドレープ越しに穿刺部位を確認します。尖ったメスを用いて、切開部位の皮膚に小さな刺入切開を加えます。

カニューラをシリンジのルアー slips に接続します。次に、カニューラを穿刺切開口から挿入します。膝関節の上方陥凹において、膝蓋骨の上極の下方から陥凹に向かって背側および内側に45度の角度で狙いを定め、針を約5 cmの深さまで挿入します。

シリンジのプランジャーを引き、関節液を吸引します。血腫の形成を防ぐため、刺入部位にドレッシング材を当て、その上から包帯を巻きます。アルコール消毒剤を用いて、小児用血液培養ボトルのゴム膜を消毒します。

次に、新しいカニューレをシリンジに取り付け、吸引した関節液を1〜3 mL、フラスコに注入します。緩やかに振とうまたは回転させて混ぜ合わせます。未処理の関節吸引検体を用意する場合は、シリンジからカニューレを取り外してください。

次に、添加剤なしの採血管を開け、関節穿刺液を1 mL注入します。PCR解析のため、蓋を閉めて固定します。細胞数計測および分化能解析のため、1～4 mLの関節穿刺液をEDTA含有採血管に移します。

マスターミックスチューブを室温に置いて解凍します。採取した検体180 mcLをサンプルチューブに移します。ワークフロー全体の品質管理のためのプロテインキナーゼKおよび内部コントロール遺伝子が含まれているサンプルチューブキャップで、サンプルチューブを密閉します。

コックピットにて、左下の「New Test」ボタンに触れて操作ソフトウェアを開きます。タッチスクリーンを使用して、患者データまたはサンプルIDを入力してください。ドロップダウンから検体を選択するには、まず「ITI Cartridge」を選択し、次にアプリケーションモードとして「Orthopedics」を選択し、最後にサンプルタイプとして「Synovial Fluid」または「Sonication Fluid」を選択します。その後、「Start」ボタンを押してください。

サンプルチューブ底部のバーコードをスキャンします。次に、サンプルチューブをLysatorに挿入します。その後、コックピット画面でサンプルを選択し、Lysatorからサンプルチューブを解除します。

その後、Lysatorからサンプルチューブを取り出し、Lysatorのトップカバーを閉じます。サンプルチューブをPCRカートリッジのサンプルチューブスロットに転送します。次に、解凍したマスターミックスチューブをPCRカートリッジのマスターミックススロットに挿入します。

コックピットモニターの指示に従い、マスターミックスとサンプルチューブが入ったPCRカートリッジをスキャンします。PCRカートリッジをアナライザーの指定されたカートリッジスロットに挿入します。コックピットタッチスクリーンの左下隅で「Active Tests」を選択し、適切なサンプルIDを選択して検査結果を表示させます。

結果を装置のメモリに保存し、今後の参照のために印刷またはエクスポートします。微生物学者に連絡して症例の詳細を報告し、サンプルを速やかに分析できるよう準備を依頼してください。層流クリーンベンチ内で、手術室から運ばれた摘出プロステーゼが入ったプラスチック容器を開け、摘出された異物が少なくとも80%浸るまで滅菌0.9% sodium chloride溶液を加えます。プラスチック容器を閉じます。

その後、プラスチック容器を30秒間、十分に振とうまたは撹拌します。プラスチック容器を超音波バスに入れます。次に、バス内の液量を確認します。

周波数 40 ± 2 kHz、出力密度 0.22 ± 0.04 W/cm² で、検体を 5 分間ソニケーションします。その後、検体を 30 秒間振盪または十分にボルテックスします。ラミナーフローベンチ内で、ソニケーション液 50 mL を採取し、滅菌チューブに移した後、チューブをしっかりと密閉します。

濃縮超音波処理液を作成するため、チューブを4200 ×gで10分間遠心分離し、10 mLの液量を残して、ピペットで残りの上清を除去します。ピペッティングとボルテックスミキシングによりペレットを再懸濁します。適切な培養液を入れた各フラスコに、濃縮超音波処理液を0.5 mLずつ接種します。

このビデオの前半で示した通り、小児用血液培養ボトルに濃縮超音波処理液を2 mL接種します。次に、PCR分析用に、1 mLの濃縮超音波処理液を添加剤のない滅菌チューブに移します。接種した培養培地をインキュベーターに移します。

培養物を14日間インキュベートし、毎日増殖を確認します。1つの主要基準、または5つの副次基準のうち少なくとも3つが認められた場合に、人工関節周囲感染症であると診断しました。主要基準には、瘻孔の存在、または2つの独立した微生物学的検体から病原体が検出されることが含まれます。

副基準には、関節穿刺液における細胞数の陽性または細胞分化の陽性、血液検体におけるCRPおよび血沈速度の陽性、組織検体における組織学的陽性、または単一の微生物学的検体における病原体の検出が含まれます。本結果では、超音波洗浄液および関節穿刺液のPCR診断において中程度の感性が示されましたが、特異度は100%という非常に強力な結果となりました。関節穿刺液または超音波洗浄液のPCRで陽性所見が得られた場合、その後、従来の微生物学的培養のいずれかにおいて同一の病原体が検出されました。非感染症例の異なる検体を用いたPCRでは、偽陽性の結果は認められませんでした。

超音波洗浄液サンプルの真の病原体16例のうち6例、および関節液培養からの病原体13例のうち5例が、PCR検出で検出されませんでした。関節吸引液と超音波洗浄液の両方の検体を組み合わせたPCR診断では、18例の感染症例のうち12例を正しく特定しました。このビデオを視聴することで、人工関節周囲感染における診断経路をどのように改善すべきかについて、十分な理解が得られるはずです。

微生物学者と整形外科医が、分画診断を最大限に向上させるために密接に連携する必要があることがお分かりいただけたかと思います。正しく実施すれば、関節穿刺から5時間以内に、カートリッジベースのマルチプレックスPCRによる臨床的に価値のある結果を得ることができます。この手順を行う際は、全過程を通じて無菌的に作業することを忘れないでください。

ヒト組織検体または微生物検体の取り扱いは、極めて危険な場合があることに留意してください。本手順の実施にあたっては、個人用保護具の使用など、常にすべての予防措置を講じる必要があります。