Name: 酵母ツーハイブリッドスクリーンを用いた非耕作植物病原体から細菌のエフェクターの機能をUnravelling (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 学ぶ酵母ツーハイブリッドスクリーンを用いた細菌エフェクターとMalus domestica宿主タンパク質の相互作用解析法。リンゴ増殖病の分子メカニズム解明に役立つ効率的なスクリーニング手法です。

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私たちは、原稿を校正するための技術支援のためのDualsystemsバイオテックAGとジュリアシュトローブルからLaimburg研究センターとMirelleボルヘスディアスSchnetzerからクリスティンKerschbamer、トーマスLetschka、ザビーネOettl、マーゴットラファイナー、フロリアンSenonerに感謝します。この作品はAPPL2.0プロジェクトの一環として実施し、部分的にボルツァーノ/ボルツァーノ、イタリアの自治州と南チロルアップルコンソーシアムによって資金を供給されました。

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

Y2H画面では、潜在的なエフェクタータンパク質は、異なる仮想的な相互作用するタンパク質（ステップ7）と共発現です。各成長酵母クローンは、餌が、（潜在的に）異なる相互作用物質が含まれています。相互作用するタンパク質は、獲物プラスミド中にクローニングされたcDNAライブラリーでエンコードされています。ベイトとプレイは、酵母転写因子の一部は、各共同cistronicallyコードをプラスミド。ベイト（エフェクター）と獲物プラスミドにコードされた相互作用物質の間の物理的相互作用の場合には、2つの転写因子部分（DNA結合ドメインおよび活性化ドメイン）が一体化され、そしてレポーター遺伝子の発現が誘導されます。酵母はヒスチジンおよびアデニン枯渇SD選択プレート上で増殖することができます。獲物cDNAライブラリーの種類をスクリーニングエフェクターに依存し、それに応じて選択されなければなりません。獲物とベイトベクター、ならびに酵母株は、互換性がなければなりません。この画面では、LexAのDNA結合ドメインとGAL4活性化domainは互換性のある酵母転写因子単位として使用しました。 cDNAライブラリーは、個別にカスタム得商業製、又は、構成することができます。 cDNAの獲物ライブラリーの調製は、このプロトコルの一部ではありません。このプロトコルでは、 マリュス第X domestica葉のRNAからの自己構築し、正規化されたcDNAライブラリーを使用し、pGAD-HA 41にクローニングしました。酵母株を発現性エフェクター（ベイト）は獲物ライブラリーで形質転換し、クローンはヒスチジンおよびアデニン枯渇SD選択プレート上で選択しました。酵母コロニーからプラスミドDNAを抽出するには、細菌の列ベースのDNAプラスミドミニキットは、酵母溶解（ステップ8）を改善するために、ガラスビーズを用いて機械的破壊のステップと組み合わせてお勧めします。このプラスミド精製では、ベイトおよびプレイベクターは、比較的低濃度で同時に精製されるであろう。しかしながら、プラスミドDNAの量は、配列決定ウィット介して相互作用パートナーを同定するために十分ですハウト前プラスミド増殖（ステップ8.4）。別の方法として、ステップ8.4で精製されたDNAは、コンピテント大腸菌に形質転換することができ、（ 例えば、pGAD-HAの場合にはアンピシリン）獲物ベクター媒介抗生物質耐性により選択します。選択された大腸菌コロニーは、pGAD-HAライブラリープラスミドを運び、かつ高収率プラスミド精製は、これらのクローンを用いて行うことができます。 pLexA-NとpGAD-HA構築物を形質転換の成功はNMY51のトリプトファンおよびロイシン栄養要求性を補完します。エフェクターおよびタンパク質（pGAD-HAにコードされる）との間の相互作用はNMY51株におけるレポーターシステムの活性化をもたらします。自己活性化の場合には、NMY51が原因NMY51レポーター系の望ましくない活性化にpGAD-HAは、TRP-レウ-彼-ADEを欠く選択プレート上で成長し、空のライブラリーベクターと組み合わせてpLexA-Nを発現するエフェクターで形質転換します40。自己活性化は、ワットすることができますEAKおよびTrp-Leuの-彼の不在下で発生する可能性があります、または活性化が強くなるとのtrp-leuへ-彼-ADEプレート41上に成長することを特徴とすることができます。自己活性化は、実際のY2H画面における偽陽性クローンの大規模なバックグラウンドを引き起こす可能性があります。これを回避するために、ベイト自己活性化試験を実施しなければならない、エフェクター発現ベクターは空のライブラリーベクターで同時形質転換しました。この実験設定では、レポーター遺伝子の発現が誘導されてはなりません。自己活性化（ すなわち、選択プレート上で成長）試験で表示されている場合、媒体は、3-アミノ-1,2,4-トリアゾール45（3-AT）の種々の濃度で補充することができます。 3-ATはimidazoleglycerolリン酸デヒドラターゼ（HIS3）、ヒスチジン生合成46の間に重要な酵素の阻害剤です。 3-ATの補充は、Y2Hスクリーン47の間に自己活性化の弱い影響を低減することができます48。 3-ATの異なる濃度の試験すべきです。このプロトコルでは - 1 40mMの3-ATを使用しました。自己活性化の抑制につながる最低濃度は、その後Y2H画面で使用されるべきです。同時形質転換のSD-TRP-Leuのプレートは、クローンの十分な数が含まれている場合、自己活性化アッセイの選択プレートのみを評価することができます。表示≥として90ミリメートル（直径）ペトリ皿当たり500コロニーが十分です。正確なトランスフェクション効率を決定するために、同時形質転換した酵母の連続希釈液を準備し、SD-TRP-Leuのプレート上にそれらを広げることをお勧めします。 自己活性化を減少させるために、エフェクターはpLexA-C、タンパク質のC末端へのLexAタグを融合ベイト発現ベクターにクローニングすることができます。レックスタグの向きは、自己活性化24を減衰させることができます。しかし、自己活性化を低減または廃止するすべての場合には不可能です。の形成赤色系のコロニーが弱いまたは偽陽性の相互作用を示しています。それは、タンパク質間相互作用に来るときNMY51のADE2レポーター遺伝子のみが活性化されるターンブロックで、この酵母株40における赤色色素の蓄積。強力な相互作用を運ぶコロニーは白色である一方で相互作用が存在しない場合には、NMY51は、赤みを帯びています。選択プレート上のコロニーの色の観察は、このようにそれぞれのコロニーが真陽性または偽陽性相互作用しているかどうかを判断するために、さらに重要なヒントを提供します。 適応や餌の性質と相互作用特性に関して、特定のアッセイの設定を変更することが最終的に必要です。今では、改善と共通Y2Hの派生技術の数が異なるホスト・システムではなく、困難なタンパク質相互作用の分析を可能にするために確立されています。 Stynen らによるレビュー。 49アドレスNDはY2H、その改善、および適応のさまざまな側面を説明し、このようにして、適切な相互作用アッセイを選択する方法についての有益な情報を提供しています。 Y2Hスクリーン派生技術が広くバイナリタンパク質相互作用の同定が必要とされる限り、異なる研究分野で使用されるようになっています。重要なコントロールが、そのような餌の自己活性化試験および同定相互作用タンパク質の一対一の再変換のように、実行された場合でも、Y2Hは誤った結果26、50、51を生成しやすいです。モデルとしての酵母は、すべての相互作用の研究には適していません。酵母は、必ずしもすべてのタンパク質24のための適切な翻訳後修飾や折りたたみをサポート細胞環境を構成するものではありません。また、Y2H設定で、タンパク質が過剰発現され、それらの発現は、コントロールではありませんその天然のプロモーターが率います。 Y2Hは、必ずしもそれらの自然の細胞内宛先ではない核へのタンパク質性相互作用パートナーを強制します。相互作用のネイティブの細胞の状況は、このように酵母によって反映されない場合がありますと、偽陰性または偽陽性結果につながる可能性があります。ほとんどのY2Hは、選択原則として酵母栄養要求性の相補性に基づいています。この栄養選択は、高感度によって特徴づけられるが、他に比べて減少した選択性を犠牲にして（ 例えば、発色性レポーター）が49をアッセイされます。非還元自己活性化（上記参照）または他の制限は、特定のエフェクターのために発生した場合、Y2Hは、適切なアッセイ25ではありません。 表1及び図1に、自己活性化試験の予想結果が与えられています。実際の相互作用（ すなわち、偽陰性）の不在は、タンパク質の毒性、誤った翻訳タンパク質によって引き起こされる可能性が処理、相互作用の立体障害、過小評価獲物ライブラリ内の相互作用パートナー、餌の膜局在化、または相互作用24のために必要な不足しているコンポーネント。 餌を発現への構築、cDNAから同定された相互作用するタンパク質の完全長遺伝子を増幅pGAD-HAにそれをサブクローニングし、生成されたpGAD-HAを変換することにより、1対1の相互作用アッセイを行うデノボに推奨されますNMY51株。獲物ライブラリーに存在する観測された相互作用因子だけより大きなタンパク質の断片であるかもしれないので、これは必要です。しかし、それぞれの完全長遺伝子の情報がかなりのゲノムおよびトランスクリプトーム配列データが利用可能である場合にのみアクセス可能です。ここに記載の自己活性化アッセイのための形質転換プロトコールは、一対一のアッセイに適用することができ、かつ餌と相互作用因子との間の相互作用が再現可能でなければなりません。 マリュスののx domesticaが ニコチアナベンタミアナで二分子蛍光相補性（BIFC）と植物体で確認されたのTCP転写因子との相互作用は、28（このプロトコルの一部ではない）をプロトプラスト。エフェクタータンパク質のATP_00189は、植物病原体のP.マリから派生しました。 プランタ BIFC ではこのようにマルスのx domesticaの転写因子とのATP_00189相互作用を確認するために選ばれました 以前Y2H 28で識別されました。 BIFCは、レポーター系を活性化するために、核への相互作用するタンパク質の細胞内移行を必要としない、タンパク質 - タンパク質相互作用アッセイです&lt;SUPクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 52。さらに、 植物体の発現および変形例では機械がその植物宿主中の植物細菌のエフェクター間の自然の相互作用の環境を模倣します。しかし、BIFCを使用してグローバル画面は現実的ではありません。 慎重に対処しなければならないプロトコルにはいくつかのステップがあります。関心（ステップ4）の遺伝子を増幅する場合には、プライマーは、植物DNAに結合することを排除することが重要です。このように、非感染植物からのDNAは、陰性対照として含まれている必要があります。目的の遺伝子の配列は、インサートの方向性クローニングのために使用されたEcoRIおよびSalI制限部位を含んではなりません。シーケンスは、これらのサイトが含まれている場合は、クローニングのための異なる制限酵素を選択する必要があります。酵母の形質転換は、このプロトコル中の中心的なメソッドです。トランスフェクション効率は、酵母細胞、それらの生存率、増殖状態、およびトランスフェクションの質の能力に依存REAGENT 53、54。提案されたプロトコルの場合、非常に変換を実行するときに2週間（4℃で保存）よりも古くない新鮮なプレートから酵母を使用することをお勧めします。選択液体培養が古い寒天プレートからコロニーを接種されたとき、多くの場合、形質転換酵母の成長が遅れています。プレートから直接酵母を使用するように、実際の実験のための接種物としての液体スターター培養物を使用しないためにも有用です。低効率は、ベイトを発現する酵母に獲物をトランスフェクトするときは、特定の獲物タンパク質（潜在的な相互作用）の過少につながることができますので、画面全体を歪曲することができます。このプロトコルでは、Y2Hで〜15万のcfu /μgでトランスフェクトされたDNAの酵母トランスフェクション効率はよく働きました。 Y2H技術の欠陥や欠点を知り、重要かつ適切な方法で結果を解釈すると、CORRを描画することが不可欠です電気ショック療法の結論。 Y2Hアッセイおよび誘導体は、長年使用されており、異なる餌特性に対して多くの改良及び適応を受けた、相互作用の細胞内局在性は、相互作用のために必要とされるかもしれない期待結合パートナー、およびその他の要因が（参照しますY3H 55、56、57）。最近では、アレイベースのY2Hスクリーンは獲物58の何百万人に対する多数の餌の自動化、ハイスループット分析を可能にするように開発されてきました。今後は、最も可能性の高い別の研究分野における複雑なシグナル伝達経路とインタラクトームの解明を可能にするために、このアッセイに自動化と高スループットのアプローチです。

<html>酵母ツーハイブリッドスクリーニング（Y2H）は1約27年前に開発され、広く、特定のタンパク質-タンパク質相互作用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11を決定するために、様々な分野で利用されているので有しました。ホスト標的タンパク質と細菌のエフェクターの物理的相互作用は、多くの場合、この標的タンパク質の機能的操作のための前提条件です。これらの相互作用を分析して、感染生物学12、13、14、15の多くの異なるセクターの焦点に移動しました、&quot;&gt; 16、17、18。Y2Hスクリーンの原理は、2つのタンパク質の相互作用は、レポーター遺伝子の発現を駆動する機能的転写因子の再構成をもたらすことである。既知のエフェクター（「ベイト」）が翻訳的に融合させますDNA結合ドメイン転写因子（DBD）、および潜在的な相互作用パートナー（「プレイ」）の相互作用パートナーは、潜在的なライブラリ不明であるので、それぞれの転写因子の活性化ドメイン（AD）に融合されているに相互作用は、いわゆる中にクローン化された「プレイ・ライブラリー。」通常、このライブラリーはベイトベクターと互換性のDBDを符号化されている。相互作用の場合には、ADをコードする適切な獲物ベクター発現プラスミドにcDNAをクローニングすることによって作られ、再構成された転写因子は、一般的に、酵母の増殖選択を可能にする、レポーター遺伝子の発現を誘導します。相互作用物質の同定は、プラスミド特異的プライマーと獲物プラスミドを配列決定することによって達成されます。 細菌は、操作とその宿主の代謝を利用するか、防御機構を回避し、異なる細菌分泌系19、20、21を介してエフェクター分子を分泌するために様々な戦略を開発しました。これらの細菌のエフェクターの結合パートナーを決定することは、このようホストでの操作経路を特定するための最初のステップです。これは、特定の病原性のメカニズムの理解の向上につながります。 Y2Hスクリーンはphytoplasmoses中の細菌エフェクターの相互作用を同定するために実施され、多くの場合、Y2Hは、ファイトプラズマ研究22、23の分子病原性機構のさらなる特徴付けのための重要な最初の実験です。しかし、会いましたほとんどの出版物におけるHOD説明はかなり希少であり、これらの技術は、多くの場合、バイオテクノロジー企業に外注しています。この方法の実現可能性に注意を引くために、このプロトコルは、その自然宿主における細菌エフェクター分子の相互作用パートナーを識別するためのステップバイステップの情報を提供します。 幅広い用途とY2H画面の早送りアプローチにもかかわらず、それは特定の相互作用は酵母系で発生していない可能性があることを忘れてはなりません。これは、酵母細胞は、特定の生物学的な制限が「 インビボ反応容器」の一種として使用されるという事実によるものです。いくつかの著者は、Y2H及びその誘導体11、24、25、26、27の利点と欠点に対処しています。一般的な考慮事項は、酵母細胞は、適切なを提供しない場合があること、例えば、遺伝子発現、（後）の翻訳、またはそれぞれのタンパク質の転条件が検討されて。これは、画面内の偽陰性の結果につながることができます。正の相互作用は、順番にアーティファクトすることができ、（ すなわち、適切な宿主内でのエフェクターの場合には）自然な状況で発生していない可能性があります。より密接に関連する生物学的システムにおける独立した相互作用試験で異種酵母発現系の相互作用を確認することが不可欠です。 本研究では、非耕作植物病原体マリCandidatusファイトプラズマ（P.のマリ）からエフェクターATP_00189の結合パートナーを同定しました。結果は、リンゴの増殖28、欧州29に影響を受けたリンゴに成長している地域では高い経済的損失の原因となる疾患の症状の開発の根底にある分子メカニズムに重要な洞察を提供します。

<table><tbody><tr><td>臭化セチルトリメチルアンモニウム (CTAB)</td><td>Applichem</td><td>A6284</td><td>DNA 調製用</td></tr><tr><td>トリスヒドロキシメチルアミノメタン (トリス)</td><td>Applichem</td><td>A2264</td><td>培地および緩衝液用</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Applichem</td><td>A2942</td><td>培地および緩衝液用</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩 (NaEDTA)</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td>培地および緩衝液用</td></tr><tr><td>DNA調製用</td><td>N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩</td><td>Applichem</td><td>A7402</td></tr>酢<tr><td>酸アンモニウム&nbsp;</td><td>DNA調製のための</td><td>Sigma-Aldrich(Fluka)</td><td>9688</td></tr><tr>DNA調製のための<td>2-メルカプトエタノール</td><td>Applichem</td><td>A1108</td><td>DNA調製</td></tr>のための<tr><td>イソプロパノール(2-プロパノール)</td>DNA<td>調製のための</td><td>Applichem</td><td>A3928</td></tr><tr><td>エタノール DNA</td>調製のための<td>Sigma-Aldrich(Fluka)</td><td>51976</td><td>DNA調製</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>のためのRNAseアプリケーションケムA2760クロロホルム:Isoamyl 24:1</td><td>Applichem</td><td>A1935</td><td>DNA 調製用</td></tr><tr><td>プルーフリーディング ポリメラーゼ (例:iProof)</td><td>Bio-Rad</td><td>203433</td><td></td></tr><tr><td>PCR EcoRI Thermo</td><td>Scientific</td><td>ER0271</td><td>クローニング用</td></tr><tr><td>SalI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0641</td> クロー<td>ニング用</td></tr><tr><td>カラムベース DNA 精製キット (e.g. QIAquick)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>クローニング用</td></tr><tr><td>カナマイシン硫酸塩</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>微生物学的選択用</td></tr><tr><td>3-アミノ-1,2,4-トリアゾール (3-AT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8056</td><td>自己活性化アッセイ</td></tr>用 <tr><td>L-アルギニン一塩酸塩&nbsp;</td><td>酵母培養用</td><td>Applichem</td><td>A3680</td></tr><tr><td>L-イソロイシン&nbsp;</td><td>酵母培養用</td><td>Applichem</td><td>A3642</td></tr><tr><td>L-リジン一水和物&nbsp;</td><td>酵母培養用</td><td>Applichem</td><td>A3448</td></tr><tr><td>L-メチオニン&nbsp;</td><td>酵母培養用</td><td>Applichem</td><td>A3897</td></tr><tr><td>L-フェニルアラニン&nbsp;</td><td>酵母培養用</td><td>Applichem</td><td>A3464</td></tr><tr><td>L-スレオニン&nbsp;</td>酵母<td>培養用</td><td>Applichem</td><td>A3946</td></tr><tr><td>L-チロシン&nbsp;</td><td>酵母培養用</td><td>Applichem</td><td>A3401</td></tr><tr><td>L-Uracile</td> 酵母<td>培養用</td><td>Applichem</td><td>A0667</td></tr><tr><td>L-バリン&nbsp;</td><td>酵母培養用</td><td>Applichem</td><td>A3406</td></tr><tr><td>L-アデニン半硫酸塩&nbsp;</td><td>酵母培養用の</td><td>Applichem</td><td>A1596</td></tr><tr><td>0.22 &micro;m 無</td><td>菌ろ過用</td>ポアフィルター<td>ザルトリウス</td><td>16541</td></tr><tr>酵母<td>培養用</td><td>L-ヒスチジン一塩酸塩</td><td>Applichem</td><td>A3719</td></tr><tr><td>L-ロイシン&nbsp;</td><td>酵母培養用</td><td>Applichem</td><td>A3496</td></tr><tr><td>L-トリプトファン&nbsp;</td><td>酵母培養用</td><td>Applichem</td><td>A3410</td></tr><tr><td>酵母窒素塩基&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51483</td><td>酵母培養</td></tr><tr><td>用D-グルコース一水和物&nbsp;</td><td>酵母培養用</td><td>Applichem</td><td>A1349</td></tr><tr><td>寒天</td>培地用<td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-1</td><td>酵母および細菌培養用</td></tr><tr><td>ペプ</td><td>トン Applichem</td><td>A2208</td><td>酵母培養用</td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td><td>Applichem</td><td>A1249</td><td>酵母形質転換</td></tr>用 <tr><td>酢酸リチウム二水和物(LiOAc)</td>酵母形質転換用<td>Applichem</td><td>A3478</td><td></td></tr><tr><td>サケの精子DNA&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A2159</td> 酵母<td>形質転換</td></tr><tr><td>Lex-A タグに対する抗体 (例 Anti-LexA DNA binding region)</td><td>Millipore</td><td>06-719</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>プラスミド Miniprep キット (例 GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PLN350</td><td>酵母および細菌からのプラスミド精製用</td></tr><tr><td>Acid Wash Glass ビーズ</td><td>Sigma-Aldrich</td>酵母<td>からのプラスミド精製用</td><td>G8772</td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td>微生物学的選択用</td></tr><tr><td>酵母抽出</td><td>物 Applichem</td><td>A1552</td> 酵母<td>培養用</td></tr><tr><td>真空濃縮器遠心分離機(例濃縮器5301)</td><td>エッペンドルフ</td><td>Z368245(シグマ)</td><td>DNA調製用</td></tr><tr><td>ベイトベクター(e.g.</em)> pLexA-N)</td><td></td><td>Y2H</td><td></td></tr><tr><td>獲物ベクトル(例pGAD-HA)</td><td>Y2H制御</td><td></td>獲物ベクトル(例pLexA-p53)Y2H制御餌ベクトル(例pACT-largeT)Y2H用Dualsystems <td>P01004</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Y2H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用デュアルシステムP01004エレクトロコンピテント E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td><td>Invitrogen</td><td>C640003</td><td></td></tr> 酵母<tr><td>レポーター株 (NMY51:MATahis3&Delta;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4、例えばNMY51)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>Y2H</td></tr><tr><td>プラスチックパラフィンフィルム(例えばパラフィルムM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>酵母および細菌培養用</td></tr><tr><td>ガス透過性シーラー(例えば BREATHseal)</td><td>Greiner</td><td>676 051</td> 酵母<td>培養用</td></tr><tr><td>PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>for PCR</td></tr><tr><td>定量 PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195</td> for <td>quantitative PCR</td></tr><tr><td>Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)</td><td>Eppendorf</td><td>5417 R</td><td>一般ラボ機器</td></tr><tr><td>遠心分離機 (例 遠心分離機 5804 R)</td><td>エッペンドルフ</td><td>5804 R</td><td>一般実験機器</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーの水 (DNAseフリー、RNAseフリー、プロテアーゼフリー)</td> <td>5Prime</td><td>2500010</td><td>PCR and DNA works</td></tr><tr><td>Scalpell</td><td>Swann-Morton</td><td>0301</td><td>for DNA preparation</td></tr><tr><td>滅菌フィルター (0.22 &micro;m;ポリエーテルスルホン)</td><td>VWR-International</td><td>514-0073(欧州カタログ番号)</td><td>酵母および細菌培養</td></tr><tr><td>用ペトリ皿&Oslash; 90 mm&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td>酵母およびバクテリア培養</td></tr><tr><td>用シャーレ &Oslash; 150 mm&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639161</td> 酵母<td>培養</td></tr><tr><td>用光度計 (例えばバイオフォトメーター)</td> <td>酵母培養用</td>エ<td>ッペンドルフ</td><td>550507804</td></tr><tr><td>光度計キュベット</td><td>酵母</td><td>培養用</td>ブランド<td>759015</td></tr><tr><td>ウォーターバス (例えば ウォーターバス Memmert WB7)</td> <td>Memmert</td><td>WB7</td><td>酵母変換</td></tr><tr><td>ウェスタンブロット装置</td><td>バイオ・ラッド</td>の<td>タンパク質検出用</td><td>ダイバーシティ</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>5Prime</td><td>2201210</td><td></td></tr> シェー<tr><td>カー (三角) フラスコ (100 mL、1,000 mL、2,000 mL) および通気性コットンプラグ (例 Duran Erlenmeyer ナローネックフラスコ)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z232793, Z232858, Z232866</td><td>for yeast and bacteria culture</td></tr><tr><td>Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)</td><td>GFL</td><td>3031</td><td>酵母および細菌培養用</td></tr><tr><td>インキュベータ</td><td>ーバインダー</td><td>KB 53 (E3.1)</td> <td>酵母および細菌培養用</td></tr><tr><td>製氷機 (例 製氷機 IF 825)</td><td>Omniwash</td><td>IF 825</td><td>一般実験装置</td></tr><tr><td>0.2 mL、1.5 mL、2.0 mL 反応バイアル (ポリプロピレン)</td><td>Eppendorf</td><td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td><td>一般実験装置</td></tr><tr><td>ピペットと使い捨てピペットのヒント(異なるボリューム:10 - 1,000 & マイクロ;L)</td><td>エッペンドルフ</td><td>の多様な</td><td>一般実験装置</td></tr><tr>酵母<td>および細菌培養用</td><td>スプレッダー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SPR-L-S01</td></tr><tr><td>ボルテックスシェーカー ( MS 3 Minishaker)</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td>一般実験装置</td></tr><tr><td>T4-リガーゼ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>EL0011</td><td>クローニング用</td></tr><tr><td>冷蔵庫 (4 °;C) (例 Liebherr Medline FKEX 5000)</td><td>Liebherr</td><td>81.767.580.4</td><td>一般実験装置</td></tr><tr><td>冷凍庫 (-20 °C;C) (例: Liebherr Comfort Professional G5216)</td><td>Liebherr</td><td>G5216</td><td>一般実験装置</td></tr><tr><td>メスシリンダー (例: ブランド)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>Z327352;Z327417;Z327441&nbsp;&nbsp;</td><td>一般的なラボ機器</td></tr><tr><td>血清学ピペット (例:フィッシャーブランド)</td>酵母<td>および細菌培養用</td><td>サーモフィッシャーS55701</td><td></td></tr><tr><td>機械式ピペット(例: Pipetboy acu 2)</td><td>Integra-Biosciences</td><td>155000</td><td>一般実験機器</td></tr><tr><td>エレクトロポレーション用キュベット(1mm)</td><td>Molecular Bio Products</td><td>5510-11</td> for <td>bacteria transformation</td></tr><tr><td>エレクトロポレーター (例:エポレーター)</td><td>エッペンドルフ</td><td>バクテリア</td><td>形質転換用</td></tr><tr><td>4309000019 ゲル&ブロットイメージングシステム ( ChemiDoc MPシステム)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1708280</td><td>一般実験装置</td></tr><tr><td>円錐形遠心チューブ (ポリプロピレン) (50 mL)</td><td>VWR-International&nbsp;</td><td>525-0403 (欧州カタログ番号)</td><td>一般実験装置</td></tr><tr><td>円錐形遠心分離管 (ポリプロピレン) (13 mL)</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>一般実験装置</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT; 1 M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>P2325</td><td>for ligation</td></tr><tr><td>adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM8110G(Thermo Scientificが配布)</td><td>ライゲーション用</td></tr>ドロップ<tr><td>アウトミックス ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン、アデニンを含まないドロップアウトミックス (DO, 例酵母合成ドロップアウト培地サプリメント)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2021 Sigma&nbsp;</td><td>酵母培養用(既製ミックス)</td></tr></tbody></table>

酵母ツーハイブリッドスクリーンを用いた非耕作植物病原体から細菌のエフェクターの機能をunravelling

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

病気の症状の分子機構をUnravellingする植物科学における病理および症状の発展を理解することが重要です。細菌は、自分の利益のためにそれらの宿主代謝を操作するために異なる戦略を進化させてきました。この細菌の操作は、多くの場合、重度の症状の開発や影響を受けた植物の死に連結されています。ホスト操作を担当する特定の細菌の分子を決定することは、微生物学的研究の重要な分野となっています。呼ばれるこれらの細菌の分子の同定後、「エフェクター、「彼らの機能を解明することが重要です。エフェクターの機能を決定するための直接的なアプローチは、酵母ツーハイブリッド（Y2H）画面を介して、その自然宿主でのタンパク質性結合パートナーを同定することです。通常、ホストは、 インシリコのアルゴリズム内の任意により十分に予測できない多数の潜在的な結合パートナーを保有します。したがってperfoするための最良の選択であります表現宿主タンパク質のライブラリ全体に対して仮想的なエフェクターで画面をRM。原因物質は、ファイトプラズマのような耕せないであれば、特に困難です。このプロトコルは、ファイトプラズマ感染木本宿主植物、潜在的なエフェクターの増幅、およびY2Hスクリーンでの植物の分子相互作用パートナーのその後の識別からのDNA精製のためのステップバイステップの手順を説明します。 Y2Hスクリーンが一般的に使用されているにもかかわらず、コストでY2Hサービスを提供していますバイオテクノロジー企業にこの技術をアウトソーシングする傾向があります。このプロトコルは、標準的な実験室技術を使用して任意のまともな装備の分子生物学研究室でY2Hを実行する方法について説明します。

実際Y2H画面を行うことができる前に、餌は、自己活性化のためにテストする必要があります。これは、空の餌ライブラリーベクターと共にベイト発現ベクターを形質転換し、選択プレート上での増殖を検査することによって達成されます。 ベイトプラスミドはTRPを補完し、獲物がS.セレビシエ NMY51 40のレイの栄養要求性をプラスミド部5で説明したようにphytoplasmalタンパク質ATP_00189が自己活性化であるか否かを分析するために、自己活性化試験を行いました。成功した同時形質転換は、このようにtrpおよびロイシンを欠く選択プレート上での増殖によって特徴づけられます。ベイトおよびプレイタンパク質の相互作用は、NMY51の彼とADEの栄養要求性の相補性につながります。相互作用の非存在下での餌による自己活性化が表示された場合、酵母は彼とADEを欠く選択プレート上で成長します。強者と弱者の自己活性化が発生する可能性があります。餌の強い自己活性化は、TRP-レイ-彼-ADE枯渇選択プレート上で同時形質転換した酵母の増殖を特徴とします。弱い自己活性化はなく、TRP-レイ-彼-ADE枯渇選択プレート上のtrp-leuへ-彼の成長につながります。適切な陽性対照は、自己活性化アッセイの結果を解釈するために不可欠です。自己活性化アッセイおよびそれらの解釈の期待される結果の概要を表1に提供され、 図1に可視化されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> 図1：Y2H スクリーンを実行する前に、ベイトのベイト自己活性化テストの例 。 、弱い自己活性化に加えて、空の獲物天秤座：S.セレビシエ NMY51はポジティブコントロール（AC左パネル ）として（PLEX-p53の）および獲物（PACT-largeT）餌を相互作用で同時形質転換しました。RYベクトル（ 中央のパネル：DF）とされない自己活性化餌プラス空の獲物のライブラリーベクター（ 右パネル：GI）。 、TRP、レイと彼：同時形質転換した酵母は、trpおよびレイ（、D、G上のパネル ）欠けているSDプレート上で培養した（ 中央のパネルを：B、E、H）とのtrp、レイ、彼とADE（ 下パネル：C、F、I）。ベイトベクターはNMY51のレイの栄養要求性（SD-TRP-レイ上での成長）のtrp栄養要求性と獲物のベクトルを補完するようtrpおよびレイを欠く培地上での選択は、同時形質転換の成功のための陽性対照です。ベイトおよびプレイや餌の自己活性化の間の相互作用の場合には、NMY51のレポーター発現がオンになり、彼とADEの栄養要求性（SD-TRP-レイ-彼-ADE上での成長）を補完します。弱い自己活性化は、SD-TRP-レイ-彼のプレート上で成長することを特徴とする（ 中央のパネルは、df）。餌の弱い自己活性化は、前に餌を分析するために減少されなければなりませんY2H画面において、選択培地に3-ATを添加することによって、例えば 。アミノ酸の枯渇がで示されている「 - 」それぞれのメディア名に。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td>なし</td><td>コロニー</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td></tr><tr><td>なし</td><td> pGAD-HA </td><td>全く成長しません</td><td>コロニー</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td>なし</td><td>コロニー</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td&gt;コロニー</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td></tr><tr><td> pLexA-p53を</td><td> PACT-largeT </td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td>コロニー</td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td></tr></tbody></table> 表1：ベイト自己活性化アッセイで予想される結果。 S.セレビシエ NMY51の変換は、同時形質転換ベイトおよびプレイの特性に基づいて選択培地上の差動の成長にもたらします。選択プレート上での増殖は、30℃で72時間のインキュベーション後の異なるベクターの組合せ（AF）の形質転換の際に評価しました。弱い自己活性化は、SD-TRP-レイ-彼-ADE選択プラット上の成長によってSD-TRP-レイ - 彼との強い自己活性化に酵母増殖によって特徴付けられます相互作用パートナーの不在下でES。 pLexA-N符号化されたphytoplasmalエフェクターATP_00189はNMY51が彼とADEの非存在下で増殖するように形質転換された餌ベクトルのできないことによって特徴づけられる自己活性化を示しません。 餌に応じて、Y2H画面は選択プレート上で増殖する多数の酵母クローンを得ることができます。全てのクローンを分析し、可能な冗長性をチェックする必要があります。正規化されたcDNAライブラリーが使用された場合でも、インタラクターは、多くの異なるクローンで表される可能性が高いです。ライブラリーのクローニング技術によって、完全な遺伝子の断片のみが、いくつかの餌ベクターに挿入することも可能です。 （cDNAから）を増幅し、相互作用物質の完全長遺伝子をサブクローニングし、1対1 Y2H分析（ 図2）での相互作用をテストするために新たにすることが賢明です。 <img aLT = &quot;図2&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; 図2：Y2H 実験で、ベイトとプレイとの間の相互作用の例。酵母ツーハイブリッド（Y2H）画面を実施し、陽性の相互作用因子のクローンからプラスミドを精製しました。獲物ベクターは、配列決定したとマルスのx domesticaホスト相互作用パートナーMdTCP24とMdTCP25が同定されました。 （何の相互作用因子がY2Hライブラリ画面で確認されなかったために）ネガティブコントロールMdTCP34として並列にサブクローニングしました。完全長遺伝子は、餌ベクター（共cistronically活性化ドメインADを発現する）およびデノボ DNA結合ドメイン（BD）に接続された細菌のエフェクターATP_00189を発現ベイトベクターで同時形質転換にサブクローニングリンゴのcDNAから増幅しました。この数字は28から取得されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">拡大表示するにはここをクリックしてください。</a>この図のバージョン。

細菌のエフェクタータンパク質は、成功した感染を確立するために重要です。このプロトコルは、その自然の植物宿主における細菌のエフェクタータンパク質のタンパク質性結合パートナーの実験的同定を記載します。酵母ツーハイブリッドスクリーニングを介してこれらのエフェクターの相互作用を同定することは、分子病原性戦略の解明に重要なツールとなっています。

酵母ツーハイブリッドスクリーンを用いた非耕作植物病原体から細菌のエフェクターの機能をUnravelling

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

本手順の全体的な目的は、Candidatus phytoplasma malefactorのタンパク質とMalus domestica由来のホストタンパク質との相互作用を同定することにより、病原性の戦略およびホスト・病原体システムを解明することです。この手法は、多くの異なる生物学的研究分野における重要な疑問への回答に役立ち、本稿ではリンゴ増殖症の発症の根底にある分子メカニズムを解明するための植物研究に適用しています。この手法の主な利点は、単一の病原体エフェクターを用いて数千もの潜在的な相互作用因子をスクリーニングできることであり、感染研究において容易に実行可能な出発点となります。まず、リンゴ増殖症に特有の症状がある感染樹を特定し、症状のない樹木を対照群とします。清潔な剪定鋏を用いて、根系の3つの異なる部位から、直径0.5〜1 cm、長さ約5 cmの根のサンプルを採取します。採取した根のサンプルを、適切にラベルを貼ったプラスチック袋に入れます。その後、サンプルを保冷剤を入れたコールドボックスに入れ、次の処理まで4 °Cで保存します。根のサンプルを水で洗浄して土を取り除きます。次に、サンプルを滅菌済みのペトリ皿に移し、滅菌したメスを用いて根の表皮と皮層を除去します。清潔で糸くずの出ないティッシュで、メスを拭きます。次に、器具を70% ethanolに浸し、直火で加熱滅菌します。メスを使用して、師管を掻き出します。サンプルを細かく刻み、30-100 mgの断片を滅菌済みの2 mL反応チューブに分注します。サンプルを-80 °Cで保存するか、直ちにDNA抽出を行い、エフェクター遺伝子の増幅およびその後のベイトベクターへのエフェクターのクローニング用テンプレートとして使用します。感染樹からフィトプラズマポリスペシフィックDNAを抽出した後、テキストプロトコルに従ってベイトベクターにクローニングし、自己活性化および発現を試験します。ATP 00189エフェクターを形質転換したNMY51を新しいSD-trpプレートにストリークし、赤色のコロニーが出現するまで30°Cで2〜3日間培養します。アガープレート上の赤色コロニーを用いて、小型振盪フラスコ内の3 mLのSD-trp培地に接種し、30°Cで120〜150 rpmの振盪条件下で一晩培養します。翌日、この一晩培養した培養液1 mLを用いて、振盪フラスコ内の20 mLのSD-trpに接種し、8時間増殖させます。SD-trp培地を用いて、培養液のOD600を0.2に調整し、10 mLの培養液を用いて、SD-trp培地を100 mLずつ含む2本のフラスコに接種します。培養液を30°Cで一晩振盪培養します。次に、培養液のOD600を測定し、120 OD600ユニット分をペレット化します。例えば、OD600が1.2と測定された場合は、サンプル100 millilitersを遠心分離して上清を捨て、あらかじめ温めておいた2xYPAD 800 millilitersを用いてペレットを2本のシェーカーフラスコに再懸濁し、30 degrees Celsiusでインキュベートします。酵母培養液を30 degrees Celsius、120-150 rotations per minuteでインキュベートしてください。テキストプロトコルに従い、OD600が0.6に達するまで、約1.5時間ごとにOD600を測定します。テキストプロトコルに従って、サケ精子DNA、Te Lithium OAc、およびPEG Lithium OAcを調製した後、800 mLの酵母培養液を700 x Gで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。上清を除去し、ペレットを合計200 mLの滅菌2回蒸留水で再懸濁します。その後、再び細胞をペレット化し、上清を捨てます。ペレットを16 millilitersのTe Lithium OAc mixで再懸濁し、サンプルを再度遠心分離します。その後、上清を捨て、9.6 millilitersのTe Lithium OAcを用いてペレットを再懸濁します。適切なサイズの反応容器を用いて、7 microgramsのpeak Add HAC DNA library vector、100 microlitersの2% salmon sperm DNA、および2.5 millilitersのPEG Lithium OAc mixを含むバイアルを12本準備します。あらかじめ調製した酵母細胞懸濁液を600 microlitersずつ12本のバイアルそれぞれに加え、1分間激しく混ぜ合わせます。次に、反応液を30 degrees Celsiusのウォーターバスで45分間インキュベートし、15分ごとに混ぜ合わせます。その後、各バイアルに160 microlitersのDMSOを加え、激しく混ぜ合わせます。次に、バイアルを42°Cでさらに20分間インキュベートします。細胞をペレット化した後、上清を除去し、3 mLの2xYPADを用いて各ペレットを再懸濁します。全12本のバイアルから回収した細胞を100 mLのシェーカーフラスコにまとめ、酵母を30°C、120 rpmで90分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞をペレット化して上清を捨て、10 mL セロロジカルピペットを用いて 4.5 mL の滅菌 0.9% 塩化ナトリウムを加え、慎重にピペッティングしてペレットを完全に再懸濁させます。懸濁液 50 µL を分取し、0.9% 塩化ナトリウムを用いて 1:10 から 1:1000 までの10倍希釈系列を作成します。その後、各希釈液 100 µL を SD-trp-leu 寒天を含む 90 mm ペトリ皿に播種します。残りの希釈していない酵母懸濁液を、SD-trp-leu-His-adeアガールを含む直径150mmのペトリ皿16枚に塗布します。プレートを30°Cでインキュベートし、SD-trp-leuプレートの場合は3日間、SD-trp-leu-his-adeプレートの場合は4日間培養します。SD-trp-leu選択プレート上の各希釈段階におけるコロニー数を数えることで、トランスフェクション効率を決定します。滅菌済みのピペットチップを用いて各クローンをピックアップし、新鮮なSD-trp-leu-his-ade選択プレートにストリークして転写します。プレートを30°Cで24時間インキュベートします。合計5回の継代に達するまで、毎日クローンの転写を繰り返します。クローンを解析するため、滅菌フード内で、各クローンに対して1 mLのSD-trp-leu-his-adeを入れた滅菌済みの2 mL反応チューブを1本ずつ用意します。加熱した針を用いて各チューブに穴を開け、ガス透過性シーラーでその穴を塞ぎます。各バイアルに1つのクローンから新鮮なコロニー材料を接種し、30°C、150 rpmで24時間インキュベートします。細胞をペレット化し、上清を捨てた後、ペレットを適切なバッファーで再懸濁し、新しい2 mL反応チューブに移します。懸濁液に100 µLの酸洗浄ガラスビーズを加え、チューブを5分間激しく混合します。最後に、テキストプロトコルに従ってプラスミドDNAを精製します。自己活性化アッセイの予想結果とその解釈のまとめを、この表と図に示します。弱い自己活性化がある場合は trp-leu-his 欠乏培地で生育しますが、trp-leu-his-ade 欠乏選択プレートでは生育しません。一方、強力な自己活性化能を持つベイトを導入した酵母は、trp-leu-his-ade 欠乏培地で生育します。ベイトとプレイの共形質転換が成功したかは、trpおよびleuを欠く選択培地での増殖によって判断されます。ベイトタンパク質とプレイタンパク質の相互作用は、NMY51のhisおよびade栄養要求性の相補を引き起こします。ここでは、酵母ツーハイブリッド実験におけるベイトとプレイの相互作用の例を示します。Malus domesticaのホスト相互作用パートナーであるMdTCP24およびMdTCP25が同定され、エフェクターを用いたde novo接ぎ木形質転換によって相互作用が確認されました。一度習得すれば、必要な装置や材料、特に酵母を事前に適切に準備しておくことで、酵母ツーハイブリッド法は1日で実施可能です。本手順を行う際は、コンタミネーションを避け、常に無菌状態で作業することが重要です。本手順の後、検出されたタンパク質間相互作用を確認するために、例えば二分子蛍光相補法などの別の独立した手法を実施する必要があります。酵母またはハイブリッド自体が偽陽性の結果を生じさせやすいため、この点は特に重要です。本手法の開発後、多くの異なる研究分野の研究者が、特に宿主-病原体相互作用におけるタンパク質-タンパク質相互作用に関与する分子原理をより深く理解する道が開かれ、その他多くの生物学的研究分野にも波及しました。さらに、この手法は、十分な設備を備えた分子生物学研究室であればどこでも容易に実施可能であることがわかるでしょう。特定の化学薬品、メス、および裸火の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、本手順を実施する際は、常に特定の予防措置を講じる必要があります。つまり、手袋やゴーグルなどの個人用保護具および一般的な実験室安全設備を使用してください。

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