酵母ツーハイブリッドスクリーンを用いた非耕作植物病原体から細菌のエフェクターの機能をUnravelling

本手順の全体的な目的は、Candidatus phytoplasma malefactorのタンパク質とMalus domestica由来のホストタンパク質との相互作用を同定することにより、病原性の戦略およびホスト・病原体システムを解明することです。この手法は、多くの異なる生物学的研究分野における重要な疑問への回答に役立ち、本稿ではリンゴ増殖症の発症の根底にある分子メカニズムを解明するための植物研究に適用しています。この手法の主な利点は、単一の病原体エフェクターを用いて数千もの潜在的な相互作用因子をスクリーニングできることであり、感染研究において容易に実行可能な出発点となります。

まず、リンゴ増殖症に特有の症状がある感染樹を特定し、症状のない樹木を対照群とします。清潔な剪定鋏を用いて、根系の3つの異なる部位から、直径0.5〜1 cm、長さ約5 cmの根のサンプルを採取します。採取した根のサンプルを、適切にラベルを貼ったプラスチック袋に入れます。

その後、サンプルを保冷剤を入れたコールドボックスに入れ、次の処理まで4 °Cで保存します。根のサンプルを水で洗浄して土を取り除きます。次に、サンプルを滅菌済みのペトリ皿に移し、滅菌したメスを用いて根の表皮と皮層を除去します。

清潔で糸くずの出ないティッシュで、メスを拭きます。次に、器具を70% ethanolに浸し、直火で加熱滅菌します。メスを使用して、師管を掻き出します。

サンプルを細かく刻み、30-100 mgの断片を滅菌済みの2 mL反応チューブに分注します。サンプルを-80 °Cで保存するか、直ちにDNA抽出を行い、エフェクター遺伝子の増幅およびその後のベイトベクターへのエフェクターのクローニング用テンプレートとして使用します。感染樹からフィトプラズマポリスペシフィックDNAを抽出した後、テキストプロトコルに従ってベイトベクターにクローニングし、自己活性化および発現を試験します。

ATP 00189エフェクターを形質転換したNMY51を新しいSD-trpプレートにストリークし、赤色のコロニーが出現するまで30°Cで2〜3日間培養します。アガープレート上の赤色コロニーを用いて、小型振盪フラスコ内の3 mLのSD-trp培地に接種し、30°Cで120〜150 rpmの振盪条件下で一晩培養します。翌日、この一晩培養した培養液1 mLを用いて、振盪フラスコ内の20 mLのSD-trpに接種し、8時間増殖させます。

SD-trp培地を用いて、培養液のOD600を0.2に調整し、10 mLの培養液を用いて、SD-trp培地を100 mLずつ含む2本のフラスコに接種します。培養液を30°Cで一晩振盪培養します。次に、培養液のOD600を測定し、120 OD600ユニット分をペレット化します。

例えば、OD600が1.2と測定された場合は、サンプル100 millilitersを遠心分離して上清を捨て、あらかじめ温めておいた2xYPAD 800 millilitersを用いてペレットを2本のシェーカーフラスコに再懸濁し、30 degrees Celsiusでインキュベートします。酵母培養液を30 degrees Celsius、120-150 rotations per minuteでインキュベートしてください。テキストプロトコルに従い、OD600が0.6に達するまで、約1.5時間ごとにOD600を測定します。

テキストプロトコルに従って、サケ精子DNA、Te Lithium OAc、およびPEG Lithium OAcを調製した後、800 mLの酵母培養液を700 x Gで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。上清を除去し、ペレットを合計200 mLの滅菌2回蒸留水で再懸濁します。その後、再び細胞をペレット化し、上清を捨てます。

ペレットを16 millilitersのTe Lithium OAc mixで再懸濁し、サンプルを再度遠心分離します。その後、上清を捨て、9.6 millilitersのTe Lithium OAcを用いてペレットを再懸濁します。適切なサイズの反応容器を用いて、7 microgramsのpeak Add HAC DNA library vector、100 microlitersの2% salmon sperm DNA、および2.5 millilitersのPEG Lithium OAc mixを含むバイアルを12本準備します。

あらかじめ調製した酵母細胞懸濁液を600 microlitersずつ12本のバイアルそれぞれに加え、1分間激しく混ぜ合わせます。次に、反応液を30 degrees Celsiusのウォーターバスで45分間インキュベートし、15分ごとに混ぜ合わせます。その後、各バイアルに160 microlitersのDMSOを加え、激しく混ぜ合わせます。

次に、バイアルを42°Cでさらに20分間インキュベートします。細胞をペレット化した後、上清を除去し、3 mLの2xYPADを用いて各ペレットを再懸濁します。全12本のバイアルから回収した細胞を100 mLのシェーカーフラスコにまとめ、酵母を30°C、120 rpmで90分間インキュベートします。

インキュベーション後、細胞をペレット化して上清を捨て、10 mL セロロジカルピペットを用いて 4.5 mL の滅菌 0.9% 塩化ナトリウムを加え、慎重にピペッティングしてペレットを完全に再懸濁させます。懸濁液 50 µL を分取し、0.9% 塩化ナトリウムを用いて 1:10 から 1:1000 までの10倍希釈系列を作成します。その後、各希釈液 100 µL を SD-trp-leu 寒天を含む 90 mm ペトリ皿に播種します。

残りの希釈していない酵母懸濁液を、SD-trp-leu-His-adeアガールを含む直径150mmのペトリ皿16枚に塗布します。プレートを30°Cでインキュベートし、SD-trp-leuプレートの場合は3日間、SD-trp-leu-his-adeプレートの場合は4日間培養します。SD-trp-leu選択プレート上の各希釈段階におけるコロニー数を数えることで、トランスフェクション効率を決定します。

滅菌済みのピペットチップを用いて各クローンをピックアップし、新鮮なSD-trp-leu-his-ade選択プレートにストリークして転写します。プレートを30°Cで24時間インキュベートします。合計5回の継代に達するまで、毎日クローンの転写を繰り返します。

クローンを解析するため、滅菌フード内で、各クローンに対して1 mLのSD-trp-leu-his-adeを入れた滅菌済みの2 mL反応チューブを1本ずつ用意します。加熱した針を用いて各チューブに穴を開け、ガス透過性シーラーでその穴を塞ぎます。各バイアルに1つのクローンから新鮮なコロニー材料を接種し、30°C、150 rpmで24時間インキュベートします。

細胞をペレット化し、上清を捨てた後、ペレットを適切なバッファーで再懸濁し、新しい2 mL反応チューブに移します。懸濁液に100 µLの酸洗浄ガラスビーズを加え、チューブを5分間激しく混合します。最後に、テキストプロトコルに従ってプラスミドDNAを精製します。

自己活性化アッセイの予想結果とその解釈のまとめを、この表と図に示します。弱い自己活性化がある場合は trp-leu-his 欠乏培地で生育しますが、trp-leu-his-ade 欠乏選択プレートでは生育しません。一方、強力な自己活性化能を持つベイトを導入した酵母は、trp-leu-his-ade 欠乏培地で生育します。

ベイトとプレイの共形質転換が成功したかは、trpおよびleuを欠く選択培地での増殖によって判断されます。ベイトタンパク質とプレイタンパク質の相互作用は、NMY51のhisおよびade栄養要求性の相補を引き起こします。ここでは、酵母ツーハイブリッド実験におけるベイトとプレイの相互作用の例を示します。Malus domesticaのホスト相互作用パートナーであるMdTCP24およびMdTCP25が同定され、エフェクターを用いたde novo接ぎ木形質転換によって相互作用が確認されました。

一度習得すれば、必要な装置や材料、特に酵母を事前に適切に準備しておくことで、酵母ツーハイブリッド法は1日で実施可能です。本手順を行う際は、コンタミネーションを避け、常に無菌状態で作業することが重要です。本手順の後、検出されたタンパク質間相互作用を確認するために、例えば二分子蛍光相補法などの別の独立した手法を実施する必要があります。

酵母またはハイブリッド自体が偽陽性の結果を生じさせやすいため、この点は特に重要です。本手法の開発後、多くの異なる研究分野の研究者が、特に宿主-病原体相互作用におけるタンパク質-タンパク質相互作用に関与する分子原理をより深く理解する道が開かれ、その他多くの生物学的研究分野にも波及しました。さらに、この手法は、十分な設備を備えた分子生物学研究室であればどこでも容易に実施可能であることがわかるでしょう。

特定の化学薬品、メス、および裸火の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、本手順を実施する際は、常に特定の予防措置を講じる必要があります。つまり、手袋やゴーグルなどの個人用保護具および一般的な実験室安全設備を使用してください。