Name: 治療用抗体の実験室規模の産生および精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学ぶ治療用抗体の実験室規模産生法。HEK-293細胞を用いた血清フリー培養系で安定細胞株を構築し、親和性クロマトグラフィーで精製する。高収率かつ再現性のある抗体生産プロトコルを確立できます。

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この研究はシドニー大学の支援を受けました。pVITRO1-トラスツズマブ-IgG1/κは、Andrew Beavil（Addgene plasmid # 61883）からの贈り物でした。pVITRO1-トラスツズマブ-IgG1/κに関する有益な議論をいただいたTihomir S. Dodev氏に感謝します。

注：適切な哺乳動物発現ベクターは、このプロトコルを使用する必要があります。ここでは、2つの発現カセットを含有する単一の構築物が使用される（ すなわち、重鎖および軽鎖の発現は別個のプロモーターによって駆動されます）。トラスツズマブ重鎖および軽鎖は、以前にベクターにクローニングしました。このベクターは、非営利のプラスミドリポジトリ13を経て得られたアンドリューBeavilからの贈り物でした。 1.回復とベクターDNAのスケールアップ注：ベクターDNAは、 大腸菌 XL-1ブルー株における軟寒天穿刺培養として受信されました。ベクターは、ハイグロマイシン耐性を運びます。 <ol><li>ストリーク単離コロニー/ mlのハイグロマイシン75μgので調製したルリア・ベルターニ（LB）寒天プレートその後、穿刺培養のソフト寒天に、無菌接種刺しやループを挿入します。 18-24時間、37℃でプレートをインキュベートします。 </li><li> 75 / mlのハイグロマイシンを含む5ミリリットルのTerrificブロス（TB）にシングルコロニーを接種します。 Incu225rpmで振盪しながら18-24時間、37℃でお譲り文化。 </li><li>優しくクライオバイアルに200μlの80％グリセロールで文化の800μLを混合することにより、ベクターDNAのグリセロールストックを準備し、-80℃で凍結する一晩培養を使用してください。 <ol><li>バッフル振とうフラスコ（ すなわち、1 /千希釈）で75 / mlのハイグロマイシンを含む100 mlのTBの一晩培養物100μlを加えます。 225rpmで振盪しながら18-24時間、37℃で培養をインキュベートします。 </li></ol></li><li>一晩培養した後、抽出し、以下の例外を除いて、MIDI /マキシ調製キットの製造業者の説明書に従ってDNAを精製。水（pHは7.0〜8.5）で最終工程、溶出または再懸濁DNA中。 </li><li>その後、-20℃でDNAを保存260および280nmでの濃度と吸光度の測定値によるDNAの純度を確認してください。 注：オプション（推奨）：身元を確認するために、ベクター特異的プライマーを用いて配列DNA。 </li></ol> 2。 HEK-293細胞の安定なトランスフェクション<ol><li>エルレンマイヤーフラスコ中の0.1％の非イオン性界面活性剤を補充した無血清培地中で標準的なプロトコールに従ってHEK-293細胞（浮遊細胞）の成長、維持。 2×10 5細胞/ mlとサブカルチャー4日毎に維持します。 5％CO 2および120rpmで回転しながら37℃で培養細胞。 注：トランスフェクション前に細胞なし4未満日間培養されている必要がありますし、これ以上の4週間。血清含有培地中で単層として増殖させたHEK-293細胞は、この手順のために使用することができます。 </li><li>トランスフェクション前の日に、種子HEK-293 10％の熱不活性化ウシ胎児血清（を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）2mlの12ウェルプレートのウェル中に3×10 5細胞/ mlの細胞FBS）。トランスフェクションの日に、細胞が80〜90％の密集度に達したことを確認してください</li><li>その後、一緒に混ぜてトランスフェクション培地で別々にDNAおよびポリエチレンイミン（PEI）を希釈します。<ol><li> 300μlのトランスフェクション培地にウェルあたり1.25μgのベクターDNA（12ウェルについては15μg）を希釈します。 5分間、室温でインキュベートします。 </li><li> 300μlのトランスフェクション培地中：; 1mg / mlのPEI溶液2.5μlの（PEIへのDNAの2比すなわち 1 12ウェルについての30μl）を希釈します。 5分間、室温でインキュベートします。 </li><li>穏やかに混合し、15分間室温でインキュベートし、希釈したPEIに希釈されたDNAを追加します。 </li></ol></li><li>プレートの各ウェルにDNA / PEI混合物の滴下の50μLを加えます。 24時間37℃、5％CO 2でのトランスフェクション混合物は、次いで、プレートを置く配布する優しく板岩。 </li><li>ウェルBハイグロマイシン、10日間、37℃、5％CO 2にプレートを戻すML /50μgのを追加。 注：10日目では、非トランスフェクトされた細胞は死んだと切り離さプレートの表面から、安定的にトランスフェクト細胞が生存可能となり、一方、プレートに取り付けられています。 </li><li>を含むウェル内のメディアを交換します1/4体積の無血清培地と3/4の体積のDMEM 10％FBSを補充した（ すなわち 0.5ミリリットルの無血清培地+ 1.5ミリリットルDMEM = 7.5％の最終血清濃度）と4日間インキュベートします。 </li><li> 10％FBS（+ 1ミリリットルDMEM = 5％の最終血清濃度すなわち 1ミリリットルの無血清培地）を補充した1/2容量の無血清培地および1/2容量のDMEMでウェル中の培地を交換し、4日間インキュベートします。 </li><li> 10％FBS（ すなわち 1.5ミリリットルの無血清培地+ 0.5ミリリットルDMEM = 2.5％の最終血清濃度）を補充した3/4の体積の無血清培地と1/4の体積DMEMでウェル中の培地を交換し、4日間インキュベートします。 </li><li> 0.1％の非イオン性界面活性剤（すなわち、0％の最終血清濃度）を補充した無血清培地の2ミリリットルでウェル中の培地を交換し、4日間インキュベートします。 注：無血清適応の間に細胞に50μg/ mlのハイグロマイシンB選択圧を維持します。無血清培地に適応した細胞をウェルの表面から切り離し、私をクラスタ化することができますn個のサスペンション。 50μgの追加のサプリメントと培養条件のために2.1をステップを参照してください/ Bをmlハイグロマイシン</li><li>ピペットを用いて、静かに別のチューブに12ウェルプレート、プール細胞中の懸濁培養物を混ぜます。 <ol><li>血球計数器を用いて、2×10 5細胞/ mlの三角フラスコ中で30 mlの無血清培地にプールの細胞および種子を列挙する。 5％CO 2および120rpmで回転しながら37℃で培養細胞。 4日ごとに継代培養し、展開します。 </li></ol></li><li>液体窒素中で凍結保存のための1×10 7細胞/バイアルで10バイアルを得るために必要な細胞密度まで培養サイズを拡大し続けます。 10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含有する無血清培地中の細胞を凍結します。 注：抗体を含有する馴化培地は、タンパク質産生を確認するために、それぞれの継代培養で回収または精製条件を最適化するために使用することができます。馴化培地を収穫し、継代培養のための細胞を維持、で培養物を遠心分離します5分間300×gでは、その後のフィルター滅菌上清を0.22μmのフィルターを通して。濾過した上清を、1〜2週間、または長期保存のために-20℃、4℃に保持することができます。 </li></ol>バッチ生い茂る文化から3.大規模抗体産生注：抗体産生は、既存のセルがセットアップされるために、バッチ過剰に増殖培養容量に基づいて、必要な細胞密度に展開されているステップ2.11からに追跡することができます。そうでない場合は、凍結保存から解凍された細胞は、一旦、適切な細胞密度および体積に膨張し、この段階で始まります。様々な培養サプリメントは、抗体産生を最適化するために使用されてもよいです。抗体の収量を増加させるトリプトンの使用は、このプロトコルで示されています。 <ol><li>種子細胞は、2つの三角フラスコ中の100mlの無血清培地中で2×10 5細胞/ mlで（補充-未及び栄養補充した培養物からの抗体の収率を比較します）。 37での文化 °C、5％CO 2 </sUB&gt;および120 rpmで。 </li><li> 24時間後、栄養添加した培養に最終濃度0.5％にトリプトンを追加します。無血清培地で未添加した培養の音量を均等化。 </li><li> 8日目から、細胞生存率を監視するために、血球計数器を用いて毎日培養物の細胞数を実行します。細胞生存率が80％未満になると、培養上清を収穫。 <ol><li> 15分間、3000×gでの培養物の遠心分離により収穫上清その後のフィルター滅菌（抗体を含む）上清を0.22μmのフィルターを通して。 4°C（短期）で上清を保存したり、-20℃（長期）で凍結。 </li></ol></li></ol>自動化された高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）システムを用いたアフィニティークロマトグラフィー4.抗体精製注：以下の手順は、一般に、ほとんどの自動化システムにも適用することができます。精製は、室温または4℃（FPLCシステムを冷却室に保管されている場合）で行うことができます。スカウト一連の試験は（結果の項を参照）馴化培地から精製した抗体の最大の回収を確実にするために、バッファ、溶出緩衝液及びpH結合、適切なカラムマトリックスなどの最適な精製条件を同定することができます。最適な条件は、精製された抗体またはタンパク質に依存しています。精製は、自動化されたFPLCシステムで行いました。精製を、5mlのプロテ​​インAカラムを用いて室温で行いました。 <ol><li>超純水を使用して、以下の緩衝液を準備した後、0.22μmのフィルターでろ過推奨pHに調整します。 <ol><li> 0.14 MのNaCl、0.0027 MのKCl、0.01 MのNa 2 HPO 4および0.001 M KH 2 PO 4：以下を混合することにより、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.4（結合緩衝液）の1 Lを用意。必要に応じてバッファをフィルタリングする前にpHを調整します。 </li><li> 0.1Mグリシン - 塩酸pHは2.7（溶出バッファー）の500ミリリットルを準備します。バフをフィルタリングする前にpHを調整しますえー。 </li><li> 1 MトリスpHは9.0（中和緩衝液）の50ミリリットルを準備します。 </li></ol></li><li>コンピュータとすべてのシステム電源と通信接続が行われていることを確認します。デバイスは、ソフトウェア「システムコントロール」モジュールで表示されるはずです。確保UVセルは、280 nmの波長に設定されています。オプション：接続して使用する場合にはpH計を校正。 </li><li>システムを洗浄するために超純水でA、B及び試料ポンプの入口管を浸します。チューブ内の空気またはシステム内の空気の疑いがある場合、注射器でポンプをパージします。システムコントローラを介して、または自動化された方法を介して手動操作により水を使用してシステムを洗ってください。その圧力、導電率、UV 280トレースとpHは一貫性を維持し、カラムの圧力限界は、メーカーの仕様通りに超えていないことを確認します。 注：異常が先に進む前に対処する必要があり、システム内の空気や閉塞を示すことができます。 </li><li>システムコントローラモジュールでは、1で流量を開始ml /分を手動でいずれかの負荷のポンプAを経由して（サンプルループをバイパスして）または列を接続を開始する位置（サンプルループを介して）注入します。外し、システムの列位置の入口のチューブとカラム入口に接続されたストッパーを外します。 <ol><li>水は、列にシステムのチューブを取り付ける柱の上にシステム・チューブ滴下から流れることを可能にします。カラム入口を有し、水の滴で溢れフィッティング入口は、気泡のない接続を保証します。 </li></ol></li><li>下流の出口でカラムの出口を取り付け、すべてのフィッティングがしっかりと固定されていることを確認します。列仕様で概説されるようになりましたシステムに接続されている列で、最大圧力限界と流量の制限を超えないようにしてください。 </li><li>水の5カラム容量（CV）でカラムを洗浄します。必要に応じてUV 280トレースが安定するまで、カラム洗浄を続けます。 </li><li>バッファトンの結合に溶出緩衝液とサンプルポンプ内のバッファ、Bの結合でAの入口チューブを浸しO正しいバッファにシステムを平衡化。手動操作によってPumpWashを使用してバッファに入口管を埋めます。 </li><li>ソフトウェアの「メソッドエディタ」モジュールでは、セットアップに使用されることが意図されているカラムのアフィニティークロマトグラフィー法をメソッドウィザードを使用します。 注：自動化されたFPLCシステムは、方法の推奨設定（ すなわち流量と圧力限界）で予め充填し、精製のために選択した列（メーカー、マトリックスおよびサイズ）に基づいてステップを実行しています。 <ol><li>プロテインAアフィニティークロマトグラフィーのための次の実行の手順を実行します。 <ol><li>結合緩衝液の5 CVでシステムを平衡化し、廃棄物容器にフロースルーを収集します。 </li><li>カラムにロードしたサンプルと別々の容器にフロースルーを収集する（ボリュームがメソッドに手動で指定されてロードされます）。 </li><li>結合緩衝液の5 CVで洗浄システムと別の容器にフロースルーを収集します。 </li><li> 5 CVのisocratでカラムを溶出溶出を使用したIC分別はフラクションコレクターによって画分として精製された抗体のサンプルをバッファリングし、収集します。 </li><li>結合緩衝液の5 CVでシステムを平衡化し、廃棄物容器にフロースルーを収集します。 </li></ol></li></ol></li><li>この方法は、設定された後、馴化培地の体積がカラムに適用されるように指定して、メソッドを保存します。 注：メソッドで指定されたボリュームは、サンプルの実行中に空気の導入を回避するために、実際の量よりも5〜10ミリリットル以下でなければなりません。このプロトコルで使用される指定されたボリューム90〜120 mlです。 </li><li>馴化培地を含む容器にサンプルポンプチューブを水没。 </li><li>指定された出口チューブを介して、サンプルフロースルーを収集するために別の容器を準備します。 注：エラーが実行中に発生したり、列の結合能が列または精製rに再適用するフロースルーを必要とする超過した場合に、フロースルーを収集することが重要ですepeated。 </li><li>フラクションコレクターに収集チューブを準備します。 1ミリリットルの画分体積あたりの中和バッファー100μlを加えます。 FPLCシステムが自動的に収集チューブに分画を溶出します。 </li><li>ソフトウェアの「システムコントロール」モジュールでは、この方法を実行するために開きます。 注：メソッドの実行は、メソッドの変数をチェックするフラクションコレクターのセットアップと結果のファイル名と保存場所を定義含む一連のページで開始されます。 </li><li>実行を開始するためにSTARTをクリックしてください。ランは、「システムコントロール」モジュールで監視することができます。 </li><li>精製実行の完了時に、システムソフトウェアの「評価」モジュールで得られたクロマトグラムを確認してください。 </li><li>別のチューブ、緩衝液交換にすべてのタンパク質含有画分を合わせ、カットオフ30kDaの分子量を有する遠心分離フィルター装置を用いて、PBS中で濃縮しました。メーカーのに従って遠心分離ステップを実行します指示。 </li><li>製造業者の指示に従ってビシンコニン酸アッセイ（BCA）を用いて抗体の濃度を測定します。 </li><li>別の精製ランが実行される場合、結合バッファーとリピートの一等地のサンプルポンプチューブは、4.9から4.14を繰り返します。 </li><li>精製の実行が完了した時点で、超純水にA、Bおよびサンプルポンプの入口管を浸漬し、ステップ3で実行されるようなシステムとカラムを洗浄。 </li><li>システム及び列を格納するために20％エタノールで繰り返し洗浄手順でA、B、サンプルポンプチューブを浸します。 </li><li>下流の出口からカラムを外し、カラムストッパーを交換し、その後、入口でカラムを切断し、ストッパーを交換して、システムにチューブを再接続します。 4℃で列を保管してください。 </li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

このプロトコルは、HEK-293細胞にトランスフェクションは、安定な発現および治療用抗体の精製を詳細に説明します。抗体遺伝子の安定な発現は、治療用抗体の開発および製造のための抗体産生細胞株を生成するための最初のステップです。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞は、治療用タンパク質のための最適な発現プラットフォームまま、HEK-293細胞株は、これらの細胞中で産生されたタンパク質は、近いマッチが自然ポストの点で、ヒトタンパク質を生じるためにされていることを実現して隆起を得ています-translationalの修正および機能14、15。 CHO（ 例えば 、CHO-DG44およびCHO-K1）、ならびに非免疫グロブリン分泌性マウスB細胞株としてNS0およびSP2 / 0などの哺乳動物細胞株は、主にバイオ医薬品製造に使用されます。これらの細胞株に基づく発現系は、選択PROCに基づいています高生産クローンを誘導し、特定の選択的な薬剤<sup clas...

治療用抗体の成功は、次世代の治療薬の波が開始されるように、抗体の開発に多額の投資を駆動し続けます。抗体市場は良好な特性4を有する抗体断片1、抗体-薬剤コンジュゲート2、二重特異性抗体3と操作された抗体により再形成されることが期待されます。医薬品の関心を集めて別のクラスは、バイオシミラーです。バイオシミラーの抗体は、すでに規制当局の承認を受けている治療用抗体の製品を複製する「高度に類似」しています。提案されたバイオシミラーは、その構造、機能、動物の毒性、臨床安全性と有効性、人間の薬物動態（PK）、薬力学（PD）および免疫原性5、6に関して創始抗体と同等でなければなりません。 承認rをバイオシミラーの抗体のATEは、製品の最終品質に厳しい制約のために遅れています。このような最終処理工程に至る細胞株及び培養条件の特定等の正確な製造プロセスは、独自のままであり得ます。詳細は何ですか、抗体の製造は、本質的に非常に類似した製品を製造するの挑戦に追加できる変動率を伴います。総合的な物理化学的および生物物理学的特徴との比較は非常に困難である、まだバイオシミラー抗体の特性を実証する多くの研究が文献7、8、9に浮上しています。 治療用抗体の生成は、それぞれの抗体のための遺伝子を保持するベクターを哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションから始まります。ベクター設計、細胞株および培養条件は、元の設定に重要な考慮事項でありますPRESSIONシステム。 抗体のDNA配列は、特許を含む医薬品銀行（www.drugbank.ca）、IMGT（www.igmt.org）や研究出版物から供給することができます。例えば、トラスツズマブのシーケンスは、医薬品銀行（：DB00072 DB ID）を介して利用可能です。可変領域のアミノ酸配列は、所望の宿主種における合成のための遺伝子の設計及び最適化を行うことができます。それは修飾アミノ酸配列に対して行われていないバイオシミラー抗体のために重要です。合成された後、抗体遺伝子を選択した適当なベクターにサブクローニングすることができます。 ヒトIgG抗体は、2つの同一の重鎖と2つの同一の軽鎖からなります。両鎖の密調節された発現は、哺乳動物細胞10における異種IgGタンパク質の最適な生産に不可欠です。鎖間ジスルフィド結合を形成する必要があり、翻訳後修飾の数であることを持っているだけでなく、イントラタンパク質生合成の間にtroduced。ベクトルの数は、抗体遺伝子を（材料の表を参照）を発現するように設計されていますが利用可能です。これらの抗体に特異的ベクターは、通常、それぞれの鎖のように可変領域のみがクローニングを必要とする重鎖及び軽鎖の双方のための定常領域を発現します。 二つの独立した構築物（コトランスフェクション）を用いた細胞のトランスフェクションは、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を送達するための最も一般的なアプローチです。すなわち、各遺伝子は、それ自身のプロモーターにより駆動され、小胞体に組み立てられる前に、別個の抗体鎖として転写されます。一方、多シストロン性ベクターは、mRNA 11の内部領域から許可翻訳有する単一のmRNA転写物として複数の遺伝子の発現を可能に組み込まれた内部リボソーム侵入部位（IRES）要素を有します。この例では、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子はARRANGに接続されています両方の抗体鎖10、12の同時発現を達成するement。 一過性にトランスフェクトされた細胞は、実験の限られた数を実行するのに十分なタンパク質を得ながら、ゲノム組込みのための選択を受けた安定にトランスフェクトされた細胞株は、高い収率を提供できます。より高いタンパク質の量は、in vitroでの特徴付けに関連するアッセイ開発を可能にし、そのようなクローン細胞株とリード候補の選択などの下流の用途を考慮して、抗体の質の指標を提供することができます。 この記事の目的は、哺乳動物発現系において産生さ治療抗体の安定な発現および精製を記載することです。実際、この方法は、バイオシミラーの抗体の発現に適用することができます。この方法は、時間がかかりSTEいえ、重要へ進む前に、抗体の最初の特徴付けのために使用することができますより大規模な製造のための望ましいクローンを同定するPS。また、この方法は、他のタンパク質だけでなく、抗体を発現するために使用することができます。 以下の詳細なプロトコルは、治療用抗体トラスツズマブの発現を記載します。これは、自動化されたクロマトグラフィー法によってHEK-293細胞株と抗体タンパク質の精製における安定なトランスフェクションに続いてベクターDNAの調製から成ります。

<table><tbody><tr><td>pFUSEベクターシリーズ</td><td>InvivoGen</td><td>N/A</td><td>共トランスフェクションが必要な別々のベクターで発現する重抗体遺伝子と軽抗体遺伝子。</td></tr><tr><td>mAbXpressベクトルシリーズ</td><td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td><td></td><td>重抗体遺伝子と軽抗体遺伝子を別々のベクターで発現させ、コトランスフェクションが必要です。参照:Jones, M. L. et al.組換えモノクローナル抗体のライゲーションに依存しない迅速な再フォーマットのための方法。J イムノール法。354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).</td></tr><tr><td>pVITRO1 vector</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>重い抗体遺伝子と軽い抗体遺伝子は、それぞれ1つのベクターで別々のプロモーターによって駆動されます。&nbsp;参照先:Dodev, T. S. et al. 組換え抗体の迅速なクローニングと発現のためのツールキット。Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).</td></tr><tr><td>GSベクターシリーズ</td><td>Lonza</td><td></td><td>Multi-cistronicベクターは、重抗体遺伝子と軽抗体遺伝子を共発現し、単一の転写産物として翻訳しています。</td></tr><tr><td>Multi-cistronic vector series 1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>重抗体遺伝子と軽抗体遺伝子を共発現し、単一の転写産物として翻訳したMulti-cistronicベクターです。参照:Li, J. et al. 組換えIgG抗体の哺乳類発現のための異なるベクターデザインの比較研究。J イムノール法。318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).</td></tr><tr><td>Multi-cistronic ベクター シリーズ 2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>重抗体遺伝子と軽抗体遺伝子を共発現し、単一の転写産物として翻訳したMulti-cistronicベクターです。参照:Ho, S. C. et al. 高モノクローナル抗体発現CHO細胞株の作製を強化するためのIRES媒介トリキストロニックベクター。Jバイオテクノール。157, 1, 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).</td></tr><tr><td>pVITRO1-トラスツズマブ-IgG1/&kappa;</td><td>Addgene</td><td>61883</td><td>トラスツズマブ抗体遺伝子を含む哺乳類発現ベクター with hygromycin resistance gene; pVITRO1-トラスツズマブ-IgG1/&kappa; Andrew Beavilからの贈り物でした。</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro</td><td>Agar Jomar Life Research</td><td>fas-hg-s</td><td>75 & micro を含む低塩 LB 寒天培地の調製に使用されます。g / mlハイグロマイシン。.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro TB</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-l</td><td>75 & micro;g/mlハイグロマイシン&nbsp;</td></tr><tr><td>グリセロール、BioXtra、&ge;99%</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>G6279</td>水<td>とオートクレーブで80%に準備します。室温で保存してください。</td></tr><tr><td>Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit</td><td>Astral Scientific</td><td>G221020</td><td>Plasmid Maxi Prep Kit; DNA を水 (pH 7.0-8.5) で溶出または再懸濁します。</td></tr><tr><td>FreeStyle 293-F Cells</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td>HEK-293細胞株は、無血清培地での懸濁培養に適合しています。</td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>293-F細胞株の維持と高タンパク質発現のために特別に配合された無血清培地です。</td></tr><tr><td>Kolliphor P188</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4894</td><td>非イオン性界面活性剤; 多元的 F-68; 水中で 10% まで調製し、0.22 &mu;mフィルター。4°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>熱不活化胎児ウシ血清</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレン、リニア、MW 25,000&nbsp;</td><td>株式会社ポリサイエンス</td><td>23966</td><td>1 mg / mlを水に調製します。.1 M HClでpH 7.0に調整し(溶液が透明になります)、0.22 &mu;mフィルター。-80°Cで保管してください。使用までC。</td></tr><tr><td>OptiPro SFM</td><td>Life Technologies</td><td>12309-050</td><td>トランスフェクション配合無血清培地</td></tr><tr><td>ハイグロマイシン B 溶液</td><td>Jomar Life Research</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AJA2225</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン (カゼインペプトン)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>LP0042B</td><td>PBSで20%に調製し、0.22 &mu;mフィルター。4°Cで保存してください。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)錠剤、pH 7.4、100 ml</td><td>Astral Scientific</td><td>09-2051-100</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Protein A High Performance、1 x 5 ml カラム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0403-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTApurifier 100</td><td>GE Healthcare</td><td>28406266</td><td>P-960 サンプルポンプと Frac-920 フラクションコレクターを含む自動 FPLC システム。</td></tr><tr><td>グリシンHCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸、一水和物</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOC2123</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム、三ナトリウム塩二水和物&nbsp;</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOCB0035</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl solution pH 9.0</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOSD8146</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803008/UFC903008</td><td>精製タンパク質のバッファー交換と濃縮に使用されます。</td></tr><tr><td>Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>BLItz System</td><td>fort&eacute;BIO</td><td>45-5000</td><td>バイオ層干渉法(BLI)測定に使用される装置です。</td></tr><tr><td>プロテインAバイオセンサーfort</td><td>&eacute;BIO</td><td>18-5010</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド/ビサアクリルアミド (37.5:1)、40% 溶液</td><td>アストラル サイエンティフィック</td><td>786-502</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム (APS)</td><td>アストラル サイエンティフィック</td><td>AM0486</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>アストラル サイエンティフィック</td><td>AM0761</td><td></td></tr><tr><td>クーマシー ブリリアント ブルー R-250</td><td>アストラル サイエンティフィック</td><td>786-498</td><td></td></tr><tr><td>プレシジョン プラス デュアルカラー プロテインスタンダード</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610374</td><td></td></tr></tbody></table>

治療用抗体の実験室規模の産生および精製

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

治療用抗体の生産を成功させることは、開発プロセスの早い段階から始まります。第1段階は、抗体遺伝子のベクター発現とそれに続く適切な細胞株への安定なトランスフェクションです。安定したクローンは、目的の生産および増殖特性を持つクローンを選択するためにスクリーニングを受けます。これは、時間のかかるプロセスではありますが、重要なステップです。このプロトコールでは、治療用抗体の発現のための抗体配列のベクター選択とソーシングを考慮します。この手法では、ポリエチレンイミン(PEI)を使用して、ヒト胚性腎臓293(HEK-293)細胞株の浮遊変異体を安定的にトランスフェクションするためのベクターDNAを調製する方法を示します。細胞は、トランスフェクション効率を最大化するために血清含有培地に接着細胞としてトランスフェクションされ、その後、無血清条件に適応されます。大規模生産、バッチ過成長培養としてのセットアップは、抗体タンパク質を生成するために使用され、自動高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)装置を使用してアフィニティークロマトグラフィーによって精製されます。この方法によって産生される抗体収量は、抗体の初期特性評価を開始するのに十分なタンパク質を提供することができます。これには、in vitroアッセイの開発や、リード候補のクローンスクリーニングという時間のかかる作業を支援するための物理化学的特性評価が含まれる場合があります。この方法は、バイオシミラー抗体の産生のための発現系の開発に転用することができます。

図1に示すようにトランスフェクトされたHEK-293細胞によるトラスツズマブの安定生産は、バイオレイヤー干渉法（BLI）を用いて確認しました。 IgGの標準曲線は、IgG抗体標準及びタンパク質バイオセンサー（ 図1A）との間の結合速度を測定することによって作製しました。粗上清のサンプルを同様に測定し、その濃度を、標準曲線（ 図1B）から補間します。上清濃度は、二週間の無血清適応後前過剰増殖バッチ培養のための細胞をセットアップする（継代培養で回収50ミリリットルからサンプリング）は、約25μgの/ mlであると測定されました。 無血清適応をプールし、精製条件を最適化するために使用された後、各継代において回収した上清。 図2に示すように、結合および溶出緩衝液のスカウトを行いました</strong&gt;。精製のステップは...

このプロトコルは、哺乳動物発現系における治療抗体の産生を記載しています。記載されている方法は、ベクターDNAの調製、安定なトランスフェクションおよびアフィニティークロマトグラフィーを用いた大規模な文化や精製の設定ヒト胚性腎臓293細胞株の無血清適応を含みます。

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

この手法の全体的な目的は、治療用抗体のラボスケール生産に向けた、高収量の無血清発現システムを構築することです。本手法では、安定細胞株の構築、サプリメントの添加、精製戦略の最適化など、抗体発現システムの設計における重要な検討事項に対処することができます。この技術の主な利点は、無血清培地に適応した安定細胞株を構築することで、治療用抗体を堅牢かつ再現可能な量で得られることです。まず、HEK-293細胞を、0.1%の非イオン性界面活性剤を添加した無血清培地を用いて、エルレンマイヤーフラスコ内で標準プロトコルに従って培養します。細胞を37°C、5% CO2、120 rpmの条件下でインキュベートしてください。培養密度を2 × 10⁵ cells/mLに維持し、4日ごとに継代します。トランスフェクションの前日に、10%熱不活化FBSを含むDMEM 2mLを用いて、12ウェルプレートの各ウェルにHEK-293細胞を3×10⁵ cells/mLの密度で播種します。トランスフェクション当日に、細胞のコンフルエンシーが80〜90%に達していることを確認してください。1ウェルあたり1.25 µgのベクターDNAを、300 µLのトランスフェクション培地で希釈します。次に、ウェルあたり300 µLのトランスフェクション培地を用いて、1 mg/mLのポリエチレンイミン（PEI溶液）2.5 µLを希釈します。両方の溶液を室温で5分間インキュベートします。その後、希釈したDNAを希釈したPEIに加えます。緩やかに混合し、室温で15分間インキュベートします。次に、DNA PEI混合液50 µLをプレートの各ウェルに滴下して加えます。プレートを緩やかに揺らしてトランスフェクション混合液を分散させ、37 °C、5% CO2条件下で24時間インキュベートします。翌日、ウェルあたり50 µg/mLのハイグロマイシンBを添加し、プレートをインキュベーターに戻して10日間培養します。トランスフェクション後、安定的にトランスフェクトされた細胞のみが生存し、接着したままとなります。無血清適応を行うには、ウェル内の培地を、無血清培地1/4量と10% FBS含有DMEM 3/4量の混合液に交換します。培養物を4日間インキュベートします。その後、培地を、無血清培地半分量と10% FBS含有DMEM半分量に交換します。そして、さらに4日間インキュベートします。次に、培地を、無血清培地3/4量と10% FBS添加DMEM 1/4量の混合液に交換します。そして、さらに4日間培養します。最後に、培地を0.1%非イオン性界面活性剤添加の無血清培地に交換し、さらに4日間培養します。安定細胞の適応が成功した後、ピペットを用いて12ウェルプレート内の懸濁培養液を穏やかに混合し、別のチューブに細胞を回収します。血球計数器を用いて

laboratory-scale-production-and-purification-of-a-therapeutic-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

タンパク質治療薬を製造するための製造の細胞株開発のハイスループット、自動化されたプラットフォームが記載されている。 BD...

タンパク質治療薬の製造細胞株の開発のためのハイスループット自動化されたプラットフォーム

このビデオは、マウス腫瘍異種移植モデルにおける腫瘍特異的抗体のin vivo局在を研究する技術を示しています。マウスにがん細胞を皮下注射して腫瘍形成を行うと、腫瘍特異的受容体に結合する蛍光標識抗体を注入し、イメージングによる抗体の局在をin...

腫瘍特異的抗体のin vivo局在を評価する技術

動画では、遺伝子発現から分泌まで、哺乳類の宿主細胞で抗体が産生される過程を説明しています。これには、転写、翻訳、シグナル認識、正しいフォールディング、そして最終的には分泌小胞を介した細胞外培地への放出が含まれます。...

哺乳類細胞からの組換え抗体の作製と精製

このビデオは、チャイニーズハムスター卵巣細胞から採取した細胞培養液からモノクローナル抗体を精製するアッセイを示しています。これは、サンプル中の抗体のFc領域に結合する固定化されたプロテインAを含む多孔質ガラス樹脂を使用しており、それらを汚染物質から効果的に分離します。低pH溶出バッファーを使用すると、相互作用が弱まり、精製された抗体の回収が容易になります。...

チャイニーズハムスター卵巣細胞が産生するモノクローナル抗体を精製する技術

動画では、安定的にトランスフェクションした哺乳類細胞を用いて抗体医薬を作製する方法を実演しています。トリプトンの補給は細胞分裂を刺激し、その結果、過剰増殖を引き起こし、より高い抗体収量をサポートします。抗体含有培地は、回収され、ろ過され、さらなる使用のために保存されます。...

トランスフェクションされた哺乳類細胞のバッチ過剰増殖培養による抗体産生

このビデオでは、抗体産生細胞培養から得られた培養上清からモノクローナル抗体を精製する技術を示しています。このプロセスでは、アガロースビーズと結合したプロテインAを架橋したマトリックスを使用し、上清中の抗体をビーズに固定化することで、汚染物質から効果的に分離することができます。低pHの溶出バッファーを適用することで、タンパク質A-抗体の相互作用が緩和され、抗体含有画分の収集が容易になります。...

モノクローナル抗体の精製のためのアフィニティークロマトグラフィー技術

この動画では、抗体マイクロアレイチップを用いて環境試料中のシアノバクテリア株を検出する方法を実演しています。さまざまな細菌を運ぶサンプルは、印刷された抗体と相互作用し、蛍光色素標識抗シアノバクテリア株抗体による免疫染色は、異なるスポットでの蛍光を通じて特定のシアノバクテリア株の存在を明らかにします。...

抗体マイクロアレイチップを用いたシアノバクテリア株検出技術

人間が消費する淡水貯留層にシアノバクテリア毒素が存在することは、水管理当局にとって大きな懸念事項です。水質汚染のリスクを評価するために、この記事では、抗体マイクロアレイチップを使用して、液体および固体サンプル中のシアノバクテリア株を野外で検出するためのプロトコルについて説明します。...

検出するための実験プロトコールシアノバクテリア抗体マイクロアレイチップと液体と固体試料中の

自動微生物反応器の収穫された細胞培養液(HCCF)からのモノクローナル抗体の精製およびその後の分析のための詳細なプロトコルが記載されている。分析を使用して重要な品質属性(CQA)を決定し、限られたサンプル量を最大化して重要な情報を抽出することも紹介します。...

自動化された微生物叢システムを用いた中国ハムスター卵巣細胞からのモノクローナル抗体の精製と分析

ここでは、マウス腫瘍異種移植片モデルにおける抗体のin...

標的抗原特異的治療抗体の腫瘍と組織分布の分析

学ぶ治療用抗体の実験室規模産生法。HEK-293細胞を用いた血清フリー培養系で安定細胞株を構築し、親和性クロマトグラフィーで精製する。高収率かつ再現性のある抗体生産プロトコルを確立できます。

治療用抗体の実験室規模の産生および精製

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