Name: 1,2- Azaborinesの合成とT4リゾチーム変異体とのタンパク質複合体の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぶ1,2-アザボリンの合成法とT4リゾチーム変異体とのタンパク質複合体調製法。パラジウム触媒を用いた確実な合成プロセスと、生体医科学研究への応用可能性を解説します。

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この研究は、国立衛生研究所NIGMS(R01-GM094541)とボストンカレッジの支援を受けました。

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<li>Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negishi+Cross-Coupling+Is+Compatible+with+a+Reactive+B-Cl+Bond%3A+Development+of+a+Versatile+Late-Stage+Functionalization+of+1%2C2-Azaborines+and+Its+Application+to+the+Synthesis+of+New+BN+Isosteres+of+Naphthalene+and+Indenyl%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl.</a> J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).</li>
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<li>Brown, H. C., Racherla, U. S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/280707532_Organoboranes_43_A_convenient_highly_efficient_synthesis_of_triorganylboranes_via_a_modified_organometallic_route">Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route.</a> J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).</li>
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</ol>

すべての著者は、この原稿に競合する金銭的利益がないことを宣言しています。

このプロトコルの最初の部分では、我々は以前に報告された方法12、13に基づいて、1,2- azaborinesの修正された合成を説明しました。 Triallylborane 22を準備するallyltriphenylスズやカリウムallyltrifluoroborateを使用して、ルートの代替として使用されたN -allyl- N -TBS- B -アリル塩化付加物（1）。この方法は、より多くの原子経済的で環境に優しいアプローチを可能にします。 N -TBS- B -Cl -1,2- azaborineの合成のために（3）、ワンポット二段階シーケンス（酸化続く閉環メタセシス）は、以前よりも高い、単離された収率をもたらした、使用されました中間体（2）（2工程にわたって52％対29％）の単...

複素環（ すなわち 、1,2- azaborines）を含むホウ素-窒素は、最近、アレーンのアイソスターとして大きな注目を集めています。この等電子性化学空間2、3、4を展開するために、既存の構造モチーフの多様化につながる可能性があります。 Azaborines特に化学が構造のライブラリーと機能的に関連する分子の合成を行った医薬品化学の分野で、生物医学研究5、6、7、8で使用するための潜在的な有用性を有します。重要なことに、しかし、一方、利用可能なアレーン含有分子に多数のよく発達した合成経路があり、azaborinesの合成のための方法の限られた数が報告されている9、10、 </s&gt; 11、12、13アップ。これは、ホウ素源と空気と合成配列の初期段階における分子の湿気に敏感な性質のためにオプションの限られた数の主です。 この記事の最初の部分では、（3）標準エアフリー技術を用いて、N -TBS- B -Cl-1,2- azaborineのマルチグラム規模の合成を説明します。この化合物は、さらに、構造的に、より複雑な分子14、15に官能化することができる汎用性の高い中間体として機能します。 3から出発して、タンパク質結合研究に使用するためのN -H- Bエチル-1,2- azaborineの合成および精製（5）について説明します。 5の揮発性のために、その効率的な分離は、反応温度、時間、およびDISTの正確な制御を必要とします推理条件。 第二部では、タンパク質発現およびT4リゾチーム変異体（L99A及びL99A / M102Q）17、18、19の単離のためのプロトコルは、20は、タンパク質結晶化およびタンパク質-リガンドの結晶複合体の調製に続いて、提示されます。 T4リゾチーム変異体L99A及びL99A / M102Qがazaborine分子17を含むNHの水素結合能を調べるために、生物学的モデル系として選択しました。標準的な分子生物学プロトコルを用いて、タンパク質を大腸菌 RR1株で発現させ、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導されます。タンパク質精製は、イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて行われます。タンパク質の結晶化は、吊り下げを使用し、高度に濃縮された精製されたタンパク質溶液（ゲル電気泳動によって純度&gt; 95％）を用いて行われます蒸気拡散法をドロップします。そのため、酸素に対する本研究のリガンドの感度が、タンパク質 - リガンド複合体は、空気を含まない条件下で製造されます。

<table><tbody><tr><td>テトラヒドロフラン(THF)、阻害剤フリー、HPLC用、&ge;99.9%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34865</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルエーテル (Et2O)、HPLC 用、&ge;99.9%、阻害剤フリー</td>の<td>シグマアルドリッチ</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>塩化メチレン&nbsp;(CH2Cl2)、(安定化/認定ACS)</td><td>Fisher</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Fisher</td><td>T290-4</td><td></td></tr><tr><td>Pentane、HPLC</td><td>Fisher</td><td>P399-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>A21-4</td><td></td></tr><tr><td>Calcium hydride (CaH2)、試薬グレード、95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208027</td><td></td></tr><tr><td>活性炭(Pd / C)、10 wt%Pd</td>、<td>Strem</td><td>46-1900</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M三塩化ホウ素溶液、ヘキサン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>211249</td><td>Highly toxic/Pyrophoric</td></tr><tr><td>Triethylamine、&ge;99.5%</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>471283</td><td></td></tr><tr><td>グラブス 1st 生成触媒&nbsp;</td><td>materia</td><td>C823</td><td></td></tr><tr><td>アセトアミド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0500</td><td></td></tr><tr><td>n-ブタノール、無水、99.8%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>281549</td><td></td></tr><tr><td>エチルリチウム溶液、0.5&nbsp;ベンゼン/シクロヘキサン中のM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>561452</td><td>高毒性/自然発火性</td></tr><tr><td>HCl溶液、Et2O中の2.0 M</td><td>Sigma Aldrich</td><td>455180</td><td></td></tr><tr><td>2-メチルブタン、無水、&ge;99%</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli、(Migula)CastellaniおよびChalmers(ATCC&reg; 31343&trade;)</td><td>ATCC</td><td>31343</td><td></td></tr><tr><td>T4 リゾチーム WT* (L99A)</td><td>Addgene</td><td>18476</td><td></td></tr><tr><td>T4 リゾチーム 変異体 (S38D L99A M102Q N144D)</td><td>Addgene</td><td>18477</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル-&β;-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性無水</td><td>Fisher</td><td>BP329</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性無水</td><td>Fisher</td><td>BP332</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Fisher</td><td>S642212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>フィッシャー</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>M4880</td><td>腐食性</td></tr><tr><td>サーモサイエンティフィックピアス DNaseI</td><td>フィッシャー</td><td>PI-90083</td><td></td></tr><tr><td>GE ヘルスケア&nbsp;セファロース高速フロー陽イオン交換メディア</td><td>フィ</td><td>ッシャー45-002-931</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP152-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>TCI</td><td>S0489</td><td>高毒性</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>フィッシャー</td><td>ICN806443&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ザルトリウス&nbsp;ビバスピン 20 遠心濃縮器</td><td>フィッシャー</td><td>14-558-501</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム 一塩基性</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>2-ヒドロキシエチルジスルフィド</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>380474</td><td></td></tr><tr><td>N-パラトン&nbsp;</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-643</td><td></td></tr><tr><td>4 RC透析メンブレンチューブ12,000〜14,000ダルトンMWCO&nbsp;</td><td>フィッシャー</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;CryoLoop</td><td>Hampton Research</td><td></td>の<td>ループ形状の極低温チューブ</td></tr><tr><td>CryoTong</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>cryogenic tong</td></tr><tr><td>Coot</td><td></td><td></td><td>Electron density images is generated from the software</td></tr></tbody></table>

1,2- azaborinesの合成とt4リゾチーム変異体とのタンパク質複合体の調製

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

標準的なエアフリー技術を用いた1,2-アザボリンの一般的な合成と、蒸気拡散によるT4リゾチーム変異体とのタンパク質複合体調製について説明します。酸素および水分に敏感な化合物は、真空ガスマニホールドまたはグローブボックスを使用して、不活性雰囲気(N2)下で調製および分離されます。アザボリン合成の一例として、揮発性N-H-B-エチル-1,2-アザボリンを蒸留とカラムクロマトグラフィーによる5ステップシーケンスにより合成・精製し、生成物を単離するデモを行っています。T4リゾチーム変異体L99AおよびL99A/M102Qは、大腸菌RR1株で発現します。化学細胞溶解とそれに続くカルボキシメチルイオン交換カラムを使用した精製の標準的なプロトコルは、結晶化に十分に高い純度のタンパク質を提供します。タンパク質の結晶化は、吊り下げ式蒸気拡散法を使用して、さまざまなpH範囲でさまざまな濃度の沈殿剤で行われます。低分子との複雑な調製は、不活性雰囲気下での蒸気拡散法によって行われます。結晶複合体のX線回折分析は、タンパク質結合部位と1,2-アザボリンとの間の結合相互作用の明確な構造的証拠を提供します。

1,2- azaborinesするための模式的な合成経路は、図1に示されています。このプロトコルは、5つの異なるホウ素 - 窒素含有分子の合成に適用されます。 図2は 、所望の生成物（3）の形成を監視するために、ステップ1.3の過程で測定された11 B NMRスペクトルを表します。タンパク質の精製は、低圧クロマトグラフィーシステムを用いて行った代表的なクロマトグラムを図3に示されています。集めた画分の純度は、SDS-PAGEによって決定しました。 T4リゾチーム変異体L99Aの結晶は、図4に示されています。 図5は、非モデル化された電子密度と結合したリガンド5と洗練後の結合空洞とL99A結合ポケットを示しています。

1,2-アザボリンの合成とT4リゾチーム変異体とのタンパク質複合体の調製のためのプロトコールが提示されます。

1,2- Azaborinesの合成とT4リゾチーム変異体とのタンパク質複合体の調製

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

本プロトコルの目的は、1, 2-Azaborineを合成するための一般的な手法と、生物医学研究におけるその潜在的な応用について記述することです。この手法の主な利点は、至る所に存在するベンゼン骨格のホウ素含有アイソステアとして融合した1, 2-azaborine化合物を確実に合成できることです。ここで述べる前駆体は、さらに機能化させることで、より複雑な分子へと展開することが可能です。1, 2-アザボリンを用いたタンパク質複合体の調製を行うことで、今後の生物医学研究への応用に向けた知見が得られます。この手順を開始するには、テキストプロトコルに記載されている通りに環閉鎖生成物を調製します。トルエン中のこの調製済み生成物に、14 gのパラジウム炭素を加えます。次に、フラスコをボックスから取り出します。窒素でパージし、冷却水を導入したオーブン乾燥済みの24/40還流冷却器をフラスコに取り付けます。フラスコをオイルバスに設置し、攪拌しながら反応液を135 degrees celsiusで激しく還流させます。反応液を16時間還流し続けます。その後、フラスコをオイルバスから取り出し、反応液を室温まで冷却します。冷却後、反応フラスコの還流冷却管を取り外し、セプタムに交換します。オーブン乾燥させたルアーロック針を装着したシリンジを用いて、5 milliliterを分注します。この分注量をねじ口付きNMRチューブに移します。ホウ素-11 NMRを用いてサンプルを分析します。反応が不完全な場合は、反応フラスコをグローブボックスに移します。次に、パラジウム炭素をさらに3 g加えます。その後、フラスコをグローブボックスから取り出します。窒素でパージし、冷却水を導入した24/40還流冷却器をフラスコに装着します。オイルバスを用い、攪拌しながら135 °Cで激しく還流させ、24時間加熱します。別の分取試料を$^{11}\text{B NMR}$で分析し、反応が完結していることを確認します。その後、反応フラスコをグローブボックスに戻します。ペーパーワイプを充填したフラッシュクロマトグラフィー用カラムに反応混合物を通過させます。次に、ろ液を攪拌子を入れた1 Lの丸底フラスコに回収します。50 millilitersのトルエンでカラムを洗浄します。ろ液の容器をグローブボックスから取り出し、窒素ラインを備えた真空ガス管に接続します。フラスコの下にウォーターバスを配置し、溶媒をトラップするために液体窒素を入れたデュワー瓶を設置します。高真空バルブを開き、ろ液からすべての揮発性物質の除去を開始します。その後、反応混合物をグローブボックスに戻します。混合物を、撹拌子を入れたオーブン乾燥済みの24/40 250 milliliter 丸底フラスコに移します。残留している反応混合物をジクロロメタンで洗浄し、フラスコに移します。フラスコにセプタムを装着し、密閉します。フラスコをグローブボックスから真空マニホールドへ移動させ、接続します。高真空バルブを開き、残留溶媒を除去します。次に、速やかにセプタムを取り除き、スクープラを用いて水素化カルシウムを加えます。丸底フラスコを本文のプロトコルに詳述されている蒸留装置に接続し、オイルバスの温度を100 °Cに設定します。蒸留が完了後、熱源を取り除き、装置を室温まで冷却します。冷却した装置を窒素で再加圧し、エアフリー保存フラスコのプラグバルブをしっかりと閉じます。グローブボックス内で、単離した生成物をフラスコからバイアルに移し、バイアルをグローブボックス内のフリーザーで保存します。タンパク質を精製した後、精製溶液を透析膜チューブに移します。透析チューブを、100 millimolar リン酸ナトリウム、550 millimolar 塩化ナトリウム、および 0.2% アジ化ナトリウムを含む 4 L の溶液が入った容器に入れます。4 °C で一晩攪拌します。翌日、最終濃度が5 mMになるように2-メルカプトエタノールを透析済み試料に加えます。次に、遠心濃縮器を用いて溶液を40 mg/mLまで濃縮します。試料を5,000 RPM、6 °Cで遠心分離し、濃縮後に生じた沈殿物を除去します。次に、24ウェルプレートを用いて、テキストプロトコルに記載されている通り、リザーバー溶液を用いてさまざまな条件を設定します。各ウェルの縁にグリースを塗布し、密閉します。シリコン化ガラスカバーガラス上で、5 µLの濃縮タンパク質溶液と5 µLのリザーバー溶液を混合します。リザーバー溶液が入ったウェルの上に、カバーガラスを裏返しに置きます。結晶を成長させるため、プレートを4 degrees celsiusで保存します。クライオチューブのループを用いて、成長した結晶を回収し、6 milliliterマイクロ遠心チューブに移します。母液を50 µL加えます。次に、チューブをグローブボックスに移します。調製したアザボリン配位子 5 µLを、チューブのスナップキャップの内側に移します。チューブにキャップをし、蒸気拡散による平衡化のため、グローブボックス内の冷蔵庫に2〜7日間保存します。その後、N Paratoneの液滴をガラススライドに滴下します。マイクロピペットを用いて、結晶をスライドに転送します。次に、クライオチューブのループを用いて結晶をすくい上げ、水溶液からN Paratoneへと移します。N Paratoneで保護された結晶を、液体窒素の入ったデュワー瓶に急速浸漬させます。クライオトングを用いて、急冷した結晶をループに固定します。次に、テキストプロトコルに記載されている手順に従って、収集した結晶データを解析します。本研究では、既報の手法に基づいた1, 2-azaborineの改良合成法を提示します。N-allele NTBSB-allele塩化物付加体を調製するために、Tri-allele borineを使用します。NTBS BCl 1（2-アザボリン）の合成には、ワンポット2段階シーケンスが採用されており、これにより従来の手法よりも高い単離収率が得られます。N-H-B-エチル-1, 2-アザボリンの合成は、以前に報告された手法で使用されていたクロム錯体の代わりにエチルリチウムを用いて、2段階で達成されます。タンパク質は低圧クロマトグラフィーシステムを用いて精製されます。280ナノメートルで測定したクロマトグラムに、T4リゾチーム変異体L99am102qと一致するピークが確認されます。次に、タンパク質を晶析させ、リガンドと複合体化させます。この手順を行う際は、化合物の分解を防ぐため、グローブボックスや真空ガス操作装置などの無酸素条件下でアザボリン合成を行う必要があることに注意してください。本技術の開発により、従来の生物学的領域再利用ポケットにおける炭素系芳香族化合物と比較した、アザボリン特有の化学的および物理的特性を探索する道が開かれました。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

アデノウイルス粒子は、非天然アミノ酸類似体azidohomoalanineまたはアジド糖のいずれかを含むように設計されています...

Bioorthogonalクリックケミストリーを介したウイルス表面の化学選択的修飾

シスのジアステレオ選択的ワンポット調製するためのプロトコル- N-TS-iodoaziridinesが記載されている。 diiodomethyllithium、N-TSアルジミンに加えて、アミノ宝石二ヨウiodoaziridines中間の環の生成が実証されている。また、迅速かつ定量的クロマトグラフィーによる精製のための最も適切な固定相を評価するためのプロトコルが含まれる。...

クロマトグラフィーのための最適な固定相の定量的な選択を伴う合成とIodoaziridinesの精製

ここでは、アジド含有アミノ酸を遺伝的に取り込み、続いてアジドを分子プローブとカップリングすることにより、抗体フラグメントに化学プローブを部位特異的に導入するプロトコールを提示します。これは、ひずみ促進型アジド-アルキン環化付加(SPAAC)によるものです。...

ひずみ促進アジド - アルキン環付加することにより、効率的で部位特異的抗体ラベリング

2-[4-tolenesulfonyloxybutyl] から生成された 1 azoniabicyclo [4.1.0] ヘプタン開発など二環性 aziridinium イオン置換多官能ピペリジン、レジオ ・立体特異的で azepanes の準備のため利用したアジリジンさまざまな求核剤とリング拡張。この非常に効率的なプロトコルでは、fagomine、febrifugine アナログ balanol など自然の製品を含む多様な azaheterocycles...

安定した二環性 Aziridinium イオンと開環の Azaheterocycles の合成のための準備

3-アロイル-N-ヒドロキシ-5-ニトロインドールを、一段階の熱手順で共役末端アルキノンと共役末端アルキノンを用いた4-ニトロニトロゾベンゼンのシクロ添加により合成した。ニトロソアレンおよびアルキノンの調製は、対応するアニリンおよびアルキノール上の酸化手順を通じてそれぞれ十分に報告された。...

アルキノンスを用いた4-ニトロニトロイソベンゼンのシクロ添加による3-アロイル-N-ヒドロキシ-5-ニトロインドールの直接、レジオ選択的および原子経済的合成

本研究では、ビエマミドBおよびDを含むアルカロイドの不斉合成に使用されるアジリジン-2-カルボキシレートの鏡像異性体と、(-)-エピアロ-イソムスカリンの両方を調製する。...

エナンチオピュア非活性化アジリジンの調製およびビエマミドB、D、および エピアロイソムスカリンの合成

このプロトコルでは、変異型L274G-メチオニンtRNA合成酵素(MetRS*)を発現するマウス株を使用して、アジドノールロイシン(ANL)による細胞種特異的タンパク質標識を実行する方法と、標識された細胞種特異的タンパク質の単離に必要な手順について説明します。生きたマウスにおける2つの可能なANL投与経路を、(1)飲料水と(2)腹腔内注射によって概説します。...

変異型メチオニンtRNA合成酵素マウス株を用いた複合体組織からの細胞型特異的タンパク質精製・同定

非活性化および活性化アジリジンを含む連続したビサジリジンを不斉有機触媒アジリジン化によって合成し、次いで酸性または塩基性条件下で化学選択的開環反応を行った。非活性化アジリジン環は酸性条件下では反応性の低い求核剤で開環しますが、活性化されたアジリジン環は塩基性条件下でより反応性の高い求核剤で開きます。...

位置選択的開環反応のための連続ビサジリジンの調製

本プロトコルは、カチオン性ペプチドMel4およびペプチド模倣RK758の抗菌活性および細胞毒性の産生および評価方法を記述しています。化学合成、組換え発現、標準化された機能的アッセイを統合することで、ペプチドおよび小分子模倣者の生産と試験の効率的なワークフローを提供します。...

抗菌ペプチドおよびその模倣体の生産と試験

X線自由電子レーザーおよびシンクロトロン源での連続結晶学のための脂質立方晶相における膜タンパク質微結晶の調製と送達の手順を説明します。これらのプロトコールは、可溶性タンパク質微結晶の取り込みおよび送達にも適用できるため、液体注入と比較してサンプル消費量を大幅に削減できます。...

準備とシリアルフェムト秒結晶学のための脂質立方相におけるタンパク質微結晶の配達

学ぶ1,2-アザボリンの合成法とT4リゾチーム変異体とのタンパク質複合体調製法。パラジウム触媒を用いた確実な合成プロセスと、生体医科学研究への応用可能性を解説します。

1,2- Azaborinesの合成とT4リゾチーム変異体とのタンパク質複合体の調製

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