Name: フォルスコリン誘発性腸オルガノイドに腫れ：インビトロアッセイ嚢胞性線維症患者における薬物反応を評価するための (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 学ぶフォルスコリン誘発性腫れアッセイを用いて、嚢胞性線維症患者由来の腸オルガノイドでCFTR機能と薬物反応を評価する方法。個別化医療への応用が可能です。

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この作品は、オランダCF財団（NCFS）、ZonMW（40-00812-98-14103）、ウィルヘルミナ小児病院研究基金とCZ、およびZilverenkruis / AchmeaのHIT-CFプログラムによってサポートされていました。我々はS. HEIDA・ミッシェル、M. Geerdink、KMデウィンター・ド・グルート、およびG. Berkers（小児呼吸器科、ウィルヘルミナこども病院、UMCユトレヒト）、及びRHJ Houwen（小児消化器科、ウィルヘルミナに感謝したいと思います患者に接近し、CFバイオバンクの生成のための生検を取得するための小児病院、UMCユトレヒト）。

<ol><li>De Boeck, K., Amaral, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+therapies+for+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Progress in therapies for cystic fibrosis.</a> Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).</li>
<li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+genetics%3A+from+molecular+understanding+to+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).</li>
<li>Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+disease+liability+of+variants+in+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene.</a> Nature Genet. 45 (10), 1160-1167 (2013).</li>
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<li>Van Goor, F., Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+CF+airway+epithelial+cell+function+in+vitro+by+a+CFTR+potentiator%2C+VX-770%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106 (44), 18825-18830 (2009).</li>
<li>Van Goor, F., Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+the+F508del-CFTR+protein+processing+defect+in+vitro+by+the+investigational+drug+VX-809%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108 (46), 18843-18848 (2011).</li>
<li>Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+VX-770+in+persons+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D-CFTR+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation.</a> N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).</li>
<li>Ramsey, B. W., Davies, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>De Boeck, K., Munck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+a+non-G551D+gating+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation.</a> J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).</li>
<li>Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+corrector+%28lumacaftor%29+and+a+CFTR+potentiator+%28ivacaftor%29+for+treatment+of+patients+with+cystic+fibrosis+who+have+a+phe508del+CFTR+mutation%3A+a+phase+2+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial.</a> Lancet Respir Med. 2 (7), 527-538 (2014).</li>
<li>Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).</li>
<li>Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1569199313001136">Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function.</a> J Cyst Fibros. 13 (1), 29-36 (2014).</li>
<li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).</li>
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<li>Sato, T., Vries, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Stange, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li>
<li>Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+opportunities+for+CFTR-targeting+drug+development+using+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids.</a> Rare Diseases. 1 (1), e27112(2014).</li>
<li>Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rectal+forceps+biopsy+procedure+in+cystic+fibrosis%3A+technical+aspects+and+patients+perspective+for+clinical+trials+feasibility%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility.</a> BMC gastroenterology. 13, 91(2013).</li>
<li>Ommen, D. D. Z. -V., Vijftigschild, L. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+premature+termination+codon+suppression+by+read-through+agents+in+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids.</a> J Cyst Fibros. 15 (2), 158-162 (2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+correction+of+distinct+CFTR+folding+mutants+in+rectal+cystic+fibrosis+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids.</a> Eur Respir J. , (2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiator+synergy+in+rectal+organoids+carrying+S1251N%2C+G551D%2C+or+F508del+CFTR+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations.</a> J Cyst Fibros. , (2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+responses+to+CFTR-modulating+drugs+using+rectal+organoids+derived+from+subjects+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 8 (344), 344ra84(2016).</li>
<li>Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+electrical+measurements+with+the+Ussing+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber.</a> J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).</li>
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<li>Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+sources+of+Wnt+regulate+intestinal+stem+cells+and+promote+formation+of+Paneth+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B22-adrenergic+receptor+agonists+activate+CFTR+in+organoids+and+subjects+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis.</a> Eur Respir J. 48 (3), 768-779 (2016).</li>
<li>Dekkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioassay+using+intestinal+organoids+to+measure+CFTR+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma.</a> J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).</li>
<li>Graeber, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+Current+Measurements+Detect+Activation+of+Mutant+CFTR+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+with+the+G551D+Mutation+Treated+with+Ivacaftor%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor.</a> Am J Respir Crit Care Med. 192 (10), 1252-1255 (2015).</li>
<li>Van Goor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ivacaftor+potentiation+of+multiple+CFTR+channels+with+gating+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%3A+Official+Journal+of+the+Eur+Cyst+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11 (3), 237-245 (2012).</li>
</ol>

Hans Cleversは、オルガノイド培養とフォルスコリン誘発性腫脹アッセイの特許の発明者です。Jeffrey M Beekmanは、フォルスコリン誘発性腫脹アッセイの特許の発明者です。シルビア・F・ボジとロバート・フリースは、オルガノイド・テクノロジーの独占的ライセンスを保有するハブレヒト・オルガノイド・テクノロジー財団(HUB)に雇用されています。そうでなければ、著者は開示するものは何もありません。

ここでは、ヒト結腸直腸オルガノイドの発生、拡大、凍結、融解のための完全なプロトコルを提供します。我々はいくつかの時間前に17人のオルガノイド培養を確立しているが、それは時々 、ハンズオントレーニングすることなく、他の研究室で技術の確立が困難であることが判明しました。私たちは、これらのプロトコルは、このような訓練を置き換えることを期待しています。 Wnt-3A条件培地は、長期オルガノイド文化の確立と維持に成功するために最も重要な試薬の1つです。低活性とのWnt-3A-conditonedの媒体にさらされたときに実際に、オルガノイド培養は「クラッシュ」かもしれません。 Wnt-3A条件培地を、社内で行われるので、活性媒質を生成する際に考慮しなければならないいくつかの側面があります。アクティブのWnt-3Aは、L細胞および疎水性の安定化のための適切な増殖シグナルを提供する高品質のウシ胎児血清（FBS）を含む培地中で産生することができますWnt-3A分子。 Wnt-3Aのアクティビティが低い（ すなわち、低TOP / FO...

CFは、上皮陰イオンチャネルをコードする嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）遺伝子の変異によって引き起こされます。 CFは、全世界で約85,000人1に影響を与えます 。 2,000 CFTR変異が同定されている（ <a href="http://www.genet.sickkids.on.ca">www.genet.sickkids.on.ca</a> ）。この多様性は、部分的に観察された疾患表現型（広範囲の説明<a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a> ）2、3。 CFTR突然変異の6つのクラスは、CFTRタンパク質の発現と機能に及ぼす影響に基づいて定義されている：（I）NO合成、（II）損なわれ、人身売買、（III）、不良チャネル開閉、（IV）変更されたコンダクタンス、通常の（V）減少したレベルCFTRの機能、および（VI）損なわれ、細胞表面安定4。臨床状態と共通のCFTR突然変異がよく研究されていますが、CFTR機能と関係poorl残りますyは特に希少な「孤児」変異（の大規模なグループのために、個々のレベルで理解<a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a> ）1、3。 最近では、薬物は、突然変異特異的にCFTRタンパク質を標的と開発されています。 CFTRタンパク質を標的とする2つのクラスの薬物は、現在臨床で使用され、異なる作用様式を有します。このようなVX-770などの増強、頂端局在変異CFTRのオープン確率を高め、セル5への添加時に直接作用します。このようなVX-809のような補正器は、小胞体局在ミスフォールドCFTRの人身売買を復元し、効果は6観察される前に、細胞とのプレインキュベーションを必要とします。 CFTR増強、VX-770は、同様に他の8の場合と同様に、G551D変異7、8の被験者のために登録されていますCFTRは、S1251N 9を含む、変異をゲーティング。一緒に、これらの変異は、すべてのCF科目の5パーセントによって運ばれています。他の臨床試験では、VX-770、補正VX-809と組み合わせたが、肺機能にはまだかなりの影響を制限していることが示された患者10の百分の45から50によって運ばF508del突然変異についてホモ接合性の被験者における増悪率の減少を引き起こすしています11。 CF患者の残りの50％以内の薬物応答性被験体を同定するために、従来の臨床試験では、コストと時間がかかり、非常にまれなCFTR遺伝子型を持つ個人のために実行可能ではありません。小説、費用対効果の高い、パーソナライズされた方法は、CFTR突然変異のいずれかのタイプを運ぶ個人へのCFTRモジュレーターの増加数と一致することが重要です。今までは、特定のCFTR変異を有する患者群のトライアル含めることは、hでの変異CFTR遺伝子のトランスフェクションを用いた研究によって導かれていますチャンバー5、6、12をアッシングで電気生理学的研究に続いeterologous電池システム、。適切なCFの動物モデルの不足のために、CF肺の外植片の材料から誘導される空気-液体界面分化気管支上皮細胞における薬効研究は、薬物開発の13、14、15のために使用されています。しかし、肺の外植組織や侵襲的処置の限られた利用可能性はあまり一般的CFTR突然変異の分析を妨げる末期疾患のない被験者からの気管支細胞を取得し、パーソナライズされたファッションで薬物検査を防止することができます。これらの制限を克服するために、人工多能性幹細胞から誘導される大腸オルガノイド、鼻の気道細胞、および気道の細胞のような「簡単なアクセス」組織は、現在、パーソナライズされた薬物治療のために検討されています。 16、17の形で任意の胃腸器官からの培養上皮幹細胞へのプロトコルを確立しました。ヒト結腸/直腸のために、培養条件は、小分子（ニコチンアミド、A83-01と組み合わせ定義された成長因子（上皮増殖因子（EGF）、ガストリンは、Wnt-3A、Rスポンジン3（Rspo3）、及びノギン）を含みます基底膜マトリックスおよびSB202190）。これらの条件下では、単一の幹細胞または小さな組織フラグメントは、閉じた、嚢胞性に外側に向い、その基端側で高い偏上皮によって形成された3D構造を成長させます。すべての細胞型は、典型的には、それらの正常な比率と位置で表示されます。オルガノイドは、毎週の機械的破壊と再メッキにより長期間にわたって拡張することができます。それらは、遺伝的および表現型的に安定であり、長期的な拡大、バイオバンキング17を可能にする、保存することができます。彼らはに適しています2Dセルライン18のために開発された全ての標準的な細胞生物学/遺伝子操作および分析技術。 我々は最近、CFTRの機能を容易にフォルスコリン誘発性腫脹（FIS）アッセイ19、20に大腸オルガノイドで測定することができることを実証しました。コレラ毒素の代わりにフォルスコリン（FSK）や、にさらされたとき、オルガノイドは急速に、それらの環状アデノシン一リン酸（cAMP）のレベルを増加させるCFTRチャンネル19の開口部に回転もたらします。健康な個体から、または残存機能に関連したCFTR変異を有する被験者からのオルガノイドは、その後オルガノイドの内腔へのイオンと水輸送の結果、分泌性下痢のin vitroでの同等物として膨潤します。 CFTR-nullの個人由来オルガノイドによって示されるように大腸オルガノイドのFIS応答は以前に、完全にCFTR依存性であることが示されました特定の薬理学的CFTR阻害剤19を使用することによりND。大きな被写体固有のデータセットは、生検を取った後、数週間以内に導出することができます。 ここでは詳細に説明FISアッセイのために、オルガノイドは、どの年齢で及び限ら不快21を得ることができる直腸生検から培養されます。オルガノイドは、簡単に再密閉し、新しいオルガノイドを形成する単一の陰窩に機械的破壊によって毎週継代します。 FISアッセイを実行するために、これらの破砕少しオルガノイドの〜30-80は、96ウェルプレート19の各ウェルに播種します。アッセイの日に、オルガノイドをカルセイン緑、それがライブイメージングを容易にする、生きた細胞内に保持される蛍光細胞透過性色素で染色します。そして、細胞内cAMPを上昇させ、それによってCFTRを活性化するFSKは、オルガノイド膨潤を促進するために添加されます。頂端CFTRに作用増強を同時にワット追加されますフォルスコリンi番目、CFTRの人身売買を復元補正器に対し、FSKの添加前に24時間を追加されます。オルガノイド膨潤は、フォルスコリン添加時の各時点での全蛍光オブジェクトの合計面積の相対的増加を計算する自動画像解析によって定量化されます。 3Dオルガノイド腫れはアッシングチャンバーで2D培養気道細胞内の既存の電気生理学的CFTRの読み出しを超える利点と欠点を提供します。主な利点は、膨潤アッセイのスループットです。細胞を培養し、培養液の単一タイプを使用してアッセイであり、経験豊富な技術者は、12の患者サンプルで週当たり約1200のデータポイントを文化毎週25オルガノイドサンプルまで定量することができますしながら。私たちは、従来のプレートあたりの重複または三重測定により、単一の実験条件を入力して、三つの独立インキュベーション時点でそのような測定を繰り返します。合計で、約300〜500秒イングルオルガノイド構造は、次に限定された技術的な変動とCFTR機能の非常に正確な測定につながる実験条件、毎に測定されています。この精度は、私たちは明らかにCFTRモジュレーターに残存機能とレスポンスの違いを定義することができ、容易に同一のCFTR突然変異19、22、23、24、25を運ぶ患者間の遺伝的背景の影響をピックアップすることを可能にします。データの品質は、容易に顕微鏡画像から評価することができます。 FISは完全にCFTR依存性であるが、それはその読み出し流体輸送へのイオン輸送のカップリングによる、CFTR機能のための間接的なアウトカム指標です。これは、経上皮イオン電流26を測定アッシングチャンバーで直接CFTR機能の測定、とは対照的です。アッシングチャンバは、頂端または側底Cの選択刺激を可能にします（オルガノイドアッセイは許可されません）ompartments。側底膜を透過性にすることにより、頂端CFTR依存性アニオン分泌を選択的に27で測定することができます。

<table><tbody><tr><td>高度なダルベッコ '栄養混合物F-12ハム(Ad-DF)500 ml&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック:&nbsp;Invitrogen</td><td>#12634</td><td>4°Cで保存;C</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック:&nbsp;Invitrogen</td><td>#35050</td><td>4°Cで保存;C</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp;Invitrogen</td><td># 15630-056</td><td>4 °C;C</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック:&nbsp;Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td>は -20 °C で保存されています。C</td></tr><tr><td>96 ウェル培養プレート</td><td>Cellstar</td><td>#655180</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェル培養プレート</td><td>Cellstar</td><td>#662160</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル培養プレート</td><td>Cellstar</td><td>#657160</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS)</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#14190-094</td> 4<td>°C;C</td></tr><tr><td>ダルベッコs モディファイド イーグルス ミディアム&nbsp;(DMEM)500ミリリットル&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック:&nbsp;Invitrogen</td><td>#31966-021</td><td>Wnt-3Aコンディショニング培地生産用。4°で保管。C</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Bovogen</td> <td>#SFBS LOT#11113</td><td>Wnt-3A 調整培地生産用。-20 &deg;C</td></tr><tr><td>L Wnt3A細胞株</td><td>ATCC</td> <td>#CRL-2647</td><td>Wnt-3Aコンディチオエンド培地生産用。</td></tr><tr><td>TOP/FOPプラスミド</td><td>ミリポア&nbsp;</td><td>#17-285</td><td>Wnt活性測定用</td></tr><tr><td>pTK-Renilla</td><td>Promega&nbsp;</td><td>#E2241</td><td>Wnt活性測定用</td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td> <td>#CRL-1573</td><td>Wnt活性測定用</td></tr><tr><td>デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム</td><td>Promega&nbsp;</td><td>#E1910</td><td>Wnt活性測定用</td></tr><tr><td>ゼオシン&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック:&nbsp;Invitrogen</td> <td>#R250-01</td><td>Wnt-3A細胞株選択</td></tr><tr><td>B27サプリメント&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック:&nbsp;Invitrogen</td><td>#17504-044</td><td>-20 °Cで保存;C</td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Sigma Aldrich</td> <td>#A9165-5G</td>は<td>-20°Cで保存されています。C</td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> <td>#N0636-20°C;C</td></tr><tr><td>ヒト上皮増殖因子 (hEGF)</td><td>PrepoTech</td> <td>#AF-100-15</td> を <td>-20 °C で保存。C</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> <td>#G9145-20°Cで保存。C</td></tr><tr><td>TGFbI型受容体阻害剤(A83-01)&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>#2939</td><td>は -20 &deg で保存されています。C</td></tr><tr><td>Y-27632 二塩酸塩 (RhoKi)</td><td>Selleckchem</td><td></td> <td>#S1049-20 °C;C</td></tr><tr><td>p38 MAPK阻害剤(p38i)(SB202190)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> <td>#S7067-20°Cで保存;C</td></tr><tr><td>プリモシン</td><td>InvivoGen</td> <td>#ant-pm-1</td><td>を -20 °C で保存。C</td></tr><tr><td>Human Noggin (hNoggin)</td><td>PrepoTech</td><td>#120-10C</td> -<td>20°Cで保存;C</td></tr><tr><td>ヒト R-spondin 3 (hRspo-3)</td><td>R&D Systems</td><td>#3500-RS/CF</td> は <td>-20 °C で保管されています。C</td></tr><tr><td>バンコマイシン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>#861987- 250mg</td><td>を -20 °C で保存。C</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#15710-049</td><td>-20 °C;C</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#431788</td><td>4°C;C</td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>コーニング</td><td>#354230</td><td>-80 °C;C</td></tr><tr><td>TryplEエクスプレス&nbsp;</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#12605-010</td> オル<td>ガノイドの凍結</td></tr>用 <tr><td>回復細胞培養凍結 Medium</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#12648010</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Life Technologies: Gibco</td> <td>#C3100MP</td><td>-20 °C;C</td></tr><tr><td>フォルスコリン</td><td>R&D Systems</td><td>#1099-50 mg</td><td>を -80 °C で保存。C</td></tr><tr><td>ルマカフトル (VX-809)</td><td>セレックケム</td><td></td> <td>#s1565-80°Cで保管。C</td></tr><tr><td>イバカフトル (VX-770)</td><td>セレックケム</td><td></td> <td>#s1144-80°Cで保管。C</td></tr><tr><td>試薬名/材料</td><td>溶媒</td><td>ストック 濃度</td><td>最終濃度</</td></tr><tr><td>>GlutaMax</td><td></td><td>200 mM</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td>1 M</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td></td><td>10K U/ml 10K &micro;g/ml</td><td>100 U/ml 100 & マイクロ;g/ml</td></tr><tr><td>ゼオシン&nbsp;</td><td></td><td>100 mg/ml&nbsp;</td><td>125 &マイクロ;g/ml</td></tr><tr><td>B27サプリメント&nbsp;</td><td></td><td>100x</td><td>1x</td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>MiliQ H2O</td><td>500 mM</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>DPBS</td><td>1 M</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>ヒト上皮成長因子 (hEGF)</td><td>DPBS 0.1% BSA</td><td>0.5 mg/ml</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>ガストリン</td><td>DPBS</td><td>100 & マイクロ;M</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>TGFb I型受容体阻害剤(A83-01)&nbsp;</td><td>DMSO</td><td>5 mM</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632 二塩酸塩 (RhoKi)</td><td>DMSO</td><td>10 mM</td><td>10 &micro;M</td></tr><tr><td>p38 MAPK阻害剤(p38i)(SB202190)</td><td>DMSO</td><td>30 mM</td><td>10 & micro;M</td></tr><tr><td>プリモシン</td><td></td><td>50 mg / ml&nbsp;</td><td>100 & マイクロ;g/ml</td></tr><tr><td>ヒト Noggin (hNoggin)</td><td>DPBS 0.1%BSA</td><td>100 & マイクロ;g/ml</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>ヒト R-spondin 3 (hRspo-3)</td><td></td> <td>ロットごとに異なります</td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>バンコマイシン</td><td></td><td>10 mg/ml</td><td>50 & マイクロ;g / ml</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td></td><td>10mg /</td><td>ml50&マイクロ;g/ml</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>MiliQ H2O</td><td>0.5 M</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>DMSO</td><td>10 & micro;g/ml</td><td>3.3 ng/ml</td></tr><tr><td>フォルスコリン</td><td>DMSO</td><td>10 mM</td><td>可変</td></tr><tr><td>ルマカフトル (VX-809)</td><td>DMSO</td><td>20 mM</td><td>可変</td></tr>イ<tr><td>バカフトル (VX-770)</td><td>DMSO</td><td>20 mM</td><td>可変</td></tr></tbody></table>

フォルスコリン誘発性腸オルガノイドに腫れ：<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ嚢胞性線維症患者における薬物反応を評価するための

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

最近開発された嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)調節薬は、嚢胞性線維症(CF)の被験者における変異型CFTRチャネルの表面発現および/または機能を修正します。これらの薬剤から利益を得る可能性のある被験者の特定は、CFTR変異の広範な不均一性、および個々の薬剤の有効性に寄与する他の未知の要因のために困難です。ここでは、in vitroで個々のCFTR機能とCFTRモジュレーターへの応答を測定するためのシンプルで比較的迅速なアッセイについて説明します。三次元(3D)上皮オルガノイドは、標準的なオルガノイド培地での直腸生検から成長します。確立されると、オルガノイドは将来の分析のためにバイオバンク化できます。このアッセイでは、30-80個のオルガノイドを基底膜マトリックス中の96ウェルプレートに播種し、その後、薬物に曝露します。1日後、オルガノイドをカルセイングリーンで染色し、フォルスコリン誘発性腫脹を37°Cの共焦点生細胞顕微鏡法でモニターします。フォルスコリン誘発腫脹は完全にCFTRに依存しており、異なるCFTR変異および同一のCFTR変異を持つ個人の薬物応答を区別できるように十分に感度と精度があります。In vitroでの膨潤反応は、治療に対する臨床反応と相関しています。このアッセイは、CFTR変異とは無関係に、薬物反応性個体の同定に費用対効果の高いアプローチを提供します。また、将来のCFTR変調器の開発にも役立つ可能性があります。

図1Aは、BMMに埋め込まれた陰窩の代表新鮮な分離を示しています。陰窩は、CF対象の大腸生検からのものです。通常、オルガノイドは、それぞれのcrypt（ - C 図1A）から生成されます。 CFTRの機能不全に、大腸のCFオルガノイドのほとんどは、嚢胞性ではなく、むしろコンパクト突起とbuddings（ 図2A - 2B）です。しかし、いくつかのCFは、特に高い残留機能で、文化をオルガノイド野生型オルガノイド培養（ 図2D）のように、嚢胞性形状（ 図2C）でいくつかのオルガノイドを持っています。 文化を拡張またはFISアッセイをシードするためにオルガノイドを継代する前に、 図3（a）...

このプロトコルは、嚢胞性線維症(CF)の被験者の培養組織におけるCFTR機能とCFTRモジュレーター応答を測定するためのアッセイを説明しています。生検由来の腸管オルガノイドはcAMP駆動型で腫脹しますが、これはCFオルガノイドでは応答が欠損(または大幅に減少)し、CFTRモジュレーターへの曝露によって回復する可能性があります。

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

この手順の総合的な目的は、嚢胞性線維症患者から作製した腸管オルガノイドを用い、フォルスコリン誘発腫脹（FIS）アッセイを通じて、CFTR調節治療の有効性における個々のCFTR機能を評価することです。この手法は、嚢胞性線維症分野における重要な課題に対処するものです。特に、既存の薬剤または試験的な薬剤から長期的に利益を得られる患者の特定に寄与します。この手法の主な利点は、年齢に関わらず、あらゆる嚢胞性線維症（CF）患者から容易に入手可能な組織を用いてオルガノイドを生成できることです。この手法の意義は嚢胞性線維症の個別化医療にまで及び、コスト効率よく個別に薬剤有効性を検証するという現在の急務に応えるものです。本手順の実演は、Hubrecht Organoid TechnologyのMarvin Statia氏とJeffrey BeekmanグループのAnnelot Vonk氏が行います。最適なフォルスコリン誘発腫脹アッセイデータを得るためには、複数の出芽を伴う大きなオルガノイドを含む培養物を使用することが不可欠です。そのような培養物を特定した後、15 mLコニカルチューブ1本にサンプル名を、もう1本のチューブに「洗浄用」とラベルを貼ります。次に、P1000ピペットを使用して、基底膜マトリックスのドロップを乱さないように、オルガノイド培養ウェルから培地を慎重に吸引します。そして、各ウェルに1 mLの基礎培地を加えます。次に、ピペットを用いて各ウェルの基底膜マトリックスのドロップを分散させ、得られたオルガノイド懸濁液をサンプル名が記載された15 mLチューブに移します。各ウェルをさらに1 mLの基礎培地で洗浄し、その洗浄液をサンプルチューブに回収します。すべてのサンプルを回収した後、基礎培地を加えてサンプルチューブの最終容量を12 millilitersにし、あらかじめ濡らした5 milliliterピペットを用いて溶液を混合します。次に、オルガノイドを遠心分離し、ペレットを1 milliliterの新鮮な基礎培地で再懸濁します。同じp1000ピペットチップにフィルターのないp10チップを被せ、懸濁液を20回ピペッティングして混ぜ合わせます。次に、両方のチップを廃棄し、5 mLピペットを用いて、サンプルに4 mLの新鮮な基礎培地を加えます。チューブを約70度に傾け、あらかじめ液に浸して濡らした新しいP1000ピペットチップを用いて、溶液を2〜3回激しく混ぜ合わせます。チューブを傾けた状態で10秒間保持します。次に、同じp1000ピペットを使用して、サンプルの上層1 mLを洗浄済みチューブに4回分転移させます。最後のサンプルを回収した後、遠心分離によってオルガノイドを回収し、ペレットを120 µLの50% basement membrane matrixに再懸濁します。

forskolin-induced-swelling-intestinal-organoids-an-vitro-assay-for

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

ここでは、収穫維持、および病原体関連分子パターン（のPAMPs）とリステリア菌でマウス小腸オルガノイドを治療するためのプロトコルが記載されているだけでなく、遺伝子発現やタンパク質のための適切な正規化技術を重視。...

ザ<em&gt; ex vivoで</emマウス腸オルガノイドの&gt;文化とパターン認識受容体刺激

ここで人間の鼻粘膜上皮細胞の三次元回転楕円体文化を生成する手法について述べる。回転楕円体は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR) ドライブに刺激される-依存イオンと液分泌、「CFTR...

個別の嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ研究のひと鼻腔上皮細胞スフェロイドの生成

ヒト鼻上皮細胞からの インビトロ...

ヒト鼻上皮オルガノイドの培養とイメージング

このプロトコルは、膜電位の変化を測定することによって電気発生膜タンパク質を研究するための方法を記載しています。このアッセイは、上皮細胞株で内因的に発現する複数のイオンチャネルの機能的読み出しのためのプラットフォームを提供します。...

2つの上皮細胞株における2つの内因性イオンチャネルのハイスループット機能研究のための膜電位の蛍光ベースのアッセイ(英語)

ここでは、デュアルチャンバー透過性サポートシステムにおけるイヌ腸オルガノイドの培養を記述するプロトコルを提示する。透過性支持体におけるオルガノイド播種、単層維持、およびその後の薬物透過性実験が記載されている。...

デュアルチャンバー透過性サポートシステム内の犬腸オルガノイド

生検由来の腸オルガノイドと臓器オンチップ技術は、領域特異的な腸機能を再要約するためにミクロ生理学的プラットフォームに組み合わされます。...

ヒトオルガノイドと臓器オンチップ技術を組み合わせて腸領域特異的機能をモデル化

このプロトコルは、嚢胞性線維症(CF)の新しい診断アッセイである直腸オルガノイド形態分析(ROMA)について説明しています。形態学的特徴、すなわち真円度(円形度指数、CI)および内腔の存在(強度比、IR)は、CFTR機能の尺度である。189人の被験者の分析は、CFと非CFの間の完全な識別を示しました。...

直腸オルガノイド形態分析(ROMA):嚢胞性線維症の診断アッセイ

オルガノイド-線維芽細胞共培養は、 in vivo...

オルガノイド共培養を用いた食道線維芽細胞の機能特性評価と可視化

ここでは、ラット腸管オルガノイドを作製し、いくつかのダウンストリームアプリケーションで使用するためのプロトコルを紹介します。ラットはしばしば好ましい前臨床モデルであり、堅牢な腸オルガノイド系は、in vivo研究に付随するin...

ラット腸管オルガノイドの作製と操作

このプロトコールは、免疫染色による細胞接着、オルガノイド形態、および遺伝子発現のための生体機能的自己組織化ペプチドを評価することを目的としています。結腸直腸癌細胞株を使用して、集中的なテストのためのオルガノイドを取得する費用対効果の高い方法を提供します。...

超短自己組織化ペプチドマトリックス中のSW1222細胞株由来結腸直腸癌オルガノイドの作製とキャラクタリゼーション

この研究では、小腸と大腸に由来するブタオルガノイドの2D単層を生成するためのプロトコルを概説しています。これらの単層の成長は、TEER値の増加によって特徴付けられ、堅牢な上皮の完全性を示します。さらに、これらの単分子膜は、フォルスコリンの適用後のUssingチャンバー実験で生理学的分泌応答を示します。...

天然腸の生理学的特性を反映した二次元ブタ腸管オルガノイド

学ぶフォルスコリン誘発性腫れアッセイを用いて、嚢胞性線維症患者由来の腸オルガノイドでCFTR機能と薬物反応を評価する方法。個別化医療への応用が可能です。

フォルスコリン誘発性腸オルガノイドに腫れ：

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