フォルスコリン誘発性腸オルガノイドに腫れ：インビトロアッセイ嚢胞性線維症患者における薬物反応を評価するための

この手順の全体的な目標は、嚢胞性線維症患者から生成された腸オルガノイドにおけるフォルスコリン誘発腫脹(FISアッセイ)を使用して、CFTR調節治療の有効性における個々のCFTR機能を評価することです。この方法は、嚢胞性線維症分野の重要な問題に対処します。最も注目すべきは、既存または実験的な薬剤から長期的に利益を得ることができる患者を特定するのに役立つことです。

この技術の主な利点は、簡単にアクセスできる組織を使用して、年齢に関係なく任意のCF患者からオルガノイドを作製できることです。この技術の意味は、嚢胞性線維症の装具療法にまで及び、費用対効果が高く、個別の方法で薬効をテストするという現在の緊急のニーズに対処します。この手順のデモンストレーションは、Hubrecht Organoid TechnologyのMarvin StatiaとJeffrey BeekmanグループのAnnelot Vonkです。

最適なフォルスコリン誘発腫脹アッセイデータを得るためには、複数の出芽を持つ大きなオルガノイドを含む培養物を使用することが不可欠です。そのような培養物を特定したら、15ミリリットルの円錐形チューブ1本にサンプル名をラベルし、1本のチューブを洗浄済みとして標識します。次に、p1000ピペットを使用して、基底膜マトリックスの滴下を乱さずに、オルガノイド培養ウェルから培地を慎重に吸引します。

そして、各ウェルに1ミリリットルの基礎培地を追加します。次に、ピペットを使用して各ウェルの基底膜マトリックス滴を分解し、得られたオルガノイド懸濁液をサンプル名付きの15ミリリットルチューブに移します。各ウェルをもう1ミリメートルの基礎培地ですすぎ、サンプルチューブ内の洗浄液を引き出します。

すべてのサンプルを採取したら、サンプルチューブを基礎培地で最終容量12ミリリットルまで満たし、プレウェット5ミリリットルピペットを使用して溶液を混合します。次に、オルガノイドを中心とし、ペレットを1ミリリットルの新鮮な基礎培地に再懸濁します。同じp1000ピペットチップをフィルターなしのp10チップで覆い、懸濁液を20回評価してみてください。

次に、両方のチップを廃棄し、5ミリリットルのピペットを使用して、4ミリリットルの新鮮な基礎培地をサンプルに加えます。チューブを約70度傾け、新しいプレウェットp1000ピペットチップと溶液を2〜3回激しく混合します。チューブを傾けた位置に10秒間保持します。

次に、同じp1000ピペットを使用して、サンプルの上部1ミリリットルを洗浄したチューブに4回移します。最後のサンプルが回収された後、遠心分離によってオルガノイドを回収し、ペレットを120マイクロリットルの50%基底膜マトリックスに再懸濁します。次に、3マイクロリットルの液滴をガラス顕微鏡スライドに置き、光学顕微鏡下で液滴内に少なくとも30〜50個のオルガノイドが存在することを確認します。

次に、96ウェルプレートの各ウェルの中央に3マイクロリットルのオラガノイド液滴をプレートし、プレートを摂氏37度のインキュベーターに15分間置いて、基底膜マトリックスを固めます。次に、100マイクロリットルのフルコロン培地とVX809、またはフルコロン培地のみを適切なオルガノイドウェルに加え、プレートをインキュベーターに18〜24時間戻します。翌日、リピーターピペットを使用して各ウェルに10マイクロリットルのカルシウム溶液を追加し、マルチチャンネルピペットでウェルを1回再懸濁して混合していることを確認し、プレートをさらに30分間インキュベーターに戻します。

細胞を染色している間に、ライブセルイメージング共焦点顕微鏡のライブイメージングツールを37°Cと5%の二酸化炭素にプリセットして、イメージングチャンバーを事前にインキュベートします。インキュベーションの終了時に、プレートを共焦点顕微鏡のプレートホルダーに移し、スマートセットアップオプションを使用してAlexaフロア488トラックを選択します。次に、5つのex-lensとスキャンエリアを0.6倍に設定してズームアウトし、ウェル全体をキャプチャします。

レーザー出力と検出器の感度を調整して、背景上のカルシウムグリーン標識オルガノイドを最適に検出できるようにします。また、ビット深度を 8 に、フレーム サイズを 512 x 512 ピクセルに設定します。時系列オプションを使用して、測定時間、周波数、および間隔を設定します。

また、個々のウェルの位置を手動で決定するタイルオプション。次に、100マイクロリットルの新たに調製したフォルスコリン、またはVX770を対応するウェルに追加し、最初にイメージングするウェルから始めて、測定を開始します。嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)の機能不全により、ほとんどの結腸嚢胞性線維症オルガノイドはコンパクトなサイズで、遺伝子型にもよりますが、フォルスコリン刺激の60分後には膨潤しないか、腫脹がほとんど現れません。

しかし、フォルスコリン刺激の前にCFTRモジュレーターでCFオルガノイドを処理すると、オルガノイドの腫れが増加します。膨潤を定量化するために、カルシウムグリーンの総表面積を各時点で測定できます。これらのテクニックを習得すると、適切に実行すれば、3時間または4時間で完了することができます。

この手順を試す前に、最も重要なステップは、腸オルガノイドの培養条件の最適化です。なぜなら、良質な培養物がFISアッセイの最適な性能を決定するからです。このビデオをご覧いただければ、腸管オルガノイド培養の取り扱い方法と、その後、フォルスコリン誘発性腫脹アッセイを使用してCFTR活性とCFDRモジュレーターの応答を測定する方法について十分に理解することができます。