Name: 蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学ぶ 共焦点顕微鏡を用いた生細胞内ミトコンドリアカルシウムと膜電位の同時測定法。遺伝子操作不要でリアルタイムにミトコンドリア機能を解析し、疾患研究に応用可能です。

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私たちは、財政支援のために博士Kirstin Elgassおよび技術支援のためのモナッシュマイクロイメージングから博士サラ・クリード、およびウェルカム・トラストおよび医学研究評議会、英国に感謝します。 MMcKは、オーストラリアの研究評議会今後のフェローシップ制度（FT120100459）、ウィリアム・バックランド財団、オーストラリアのミトコンドリア病財団（AMDF）、医学研究、モナッシュ大学のハドソン研究所がサポートされています。この作品は、ビクトリア州政府運用インフラ支援スキームによってサポートされていました。

細胞の調製<ol><li> 10〔10cmの細胞培養皿または75 cmの培養培地中で2フラスコで細胞を増殖mlの5％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）および1×ペニシリン/ストレプトマイシン（P / Sを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） ）] 37℃/ 5％CO 2で。 </li><li>細胞を採取するために、その後、5ミリリットル1×リン酸緩衝生理食塩水（1×PBS）で洗浄し、吸引してメディアを取り出します。次に（w / v）のトリプシン/ 0.25％1.5 mlの0.25％を追加し、吸引によって1×PBSを取り外し（/ Wをv）のエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、2分間、37℃/ 5％CO 2でインキュベートします。 5ミリリットルの培養培地に再懸濁した後、細胞を除去するために静かに皿やフラスコをタップします。 </li><li>血球計数器に再懸濁した細胞の12μLを追加することによって、細胞をカウントします。 </li><li>食器や共焦点イメージングのためのチャンバーカバースリップでプレートの細胞。 注：これらは、倒立顕微鏡で使用するために設計された適切なプラスチックやガラスボトムを持っています。 </li><li>プレート細胞番目ので、〜80％の密集度は、撮影日に達成されます。例えば、約2×10 4 143B骨肉腫細胞は、一日の撮像前に8ウェルチャンバースライドの1ウェルに播種することができます。 </li><li>細胞が付着し、回復できるようにするために、37℃/ 5％CO 2で一晩細胞をインキュベートします。 </li></ol> TMRMとのFluo-4イメージング用2.バッファ<ol><li> 156ミリモルのNaCl、3mMのKClを、2mMのMgSO 4を、1.25mMのKH 2 PO 4、10mMのD-グルコース、2mMのCaCl 2を、10 mMのHEPES pH値7.35を含有する記録液（RS）を準備します。 -20ºCでの分量を保存するRS。 </li><li> 6のNaCl、130mMの塩化カリウム、7.8のMgCl 2、1 mMのKH 2 PO 4、0.4mMのCaCl 2を、2mMのEGTA、10mMのHEDTA、2mMのリンゴ酸、2 mMのグルタミン酸、2 mMのを含む細胞内培地（IM）を準備ADPおよび20mMのHEPES pHは7.1。リンゴ酸、グルタミン酸およびADPの200mMのストック溶液を、別々に調製等分し、-20℃で保存することができます。これらの目ocksは、使用直前にIMに添加することができます。 </li><li> Ca 2+フリーのハンクス緩衝塩溶液（HBSS）は、商業的供給業者から事前に準備を得ることができます。 500μMの最終濃度でエチレングリコール - ビス（βアミノエチルエーテルに）-N、N、N &#39;、N&#39;-四酢酸（EGTA）を加えます。 </li><li> 100％メタノール中の10mMテトラメチルローダミン、メチルエステル、過塩素酸塩（TMRM）のストック溶液を準備します。このストックから、蒸留H 2 O中に2μMのワーキングストックを作ります</li><li> 100％エタノール中10mMベラパミルのストック溶液を準備します。 </li><li>ジメチルスルホキシド（DMSO）中のFluo-4アセトキシメチルエステル（フルオ-4、AM）の1mg / mlの（w / v）のストック溶液を調製します。 注：フルオ4は、AMは、Ca 2+に結合すると蛍光が増大するカルシウム指示薬です。フルオ4はフッ素で置き換えられ2個の塩素置換基で、フルオ-3のアナログです。これは、488nmで増加した蛍光励起及びより高い蛍光シグナルレベルを生じます。ザAMエステル基は、細胞膜を透過することができる非荷電のFluo-4分子をもたらします。細胞内に一旦、AMエステルは細胞内に捕捉されるのFluo-4の帯電した形で、その結果、非特異的エステラーゼによって切断されます。 </li><li> 100％エタノール中で1 mMのカルボニルシアニドp型trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）のストック溶液を準備します。 </li><li>蒸留H 2 Oの株式25 mg / mlとの溶液（w / v）のジギトニンを準備</li><li> DMSO中の100μMタプシガルジンのストック溶液を準備します。 </li><li>蒸留H 2 O中の40mMの塩化カルシウム（CaCl 2）のストック溶液を調製します</li></ol> TMRMとのFluo-4、AMを用いた細胞の3染色<ol><li> 20 nMのTMRMとRS染色溶液を調製し、5μg/ mlの（w / vで）のFluo-4、AMおよびプルロニックF-127 RSのように0.005％の界面活性剤。 注：この界面活性剤があるFluo-4、AMの可溶化を促進する非イオン性ポリオールです。注：10μMのベラパミルもinhibiに添加することができますそれは、分析される細胞型で発現される場合に、原形質膜の多剤輸送体によるT TMRM輸出。 </li><li>ピペットで細胞から培養培地を取り除き、100μlの1×PBSで洗浄しました。 </li><li>ピペットで1×PBSを削除し、室温で45分間、250μlのRS染色液中で細胞をインキュベートします。 注：のFluo-4、AMが細胞に入ると、AMエステルは細胞のエステラーゼによって切断されます。室温でインキュベートすることのFluo-4、AMは、ミトコンドリアを入力することを可能にする、エステラーゼ活性を阻害します。 </li><li>ピペットでRS染色溶液を除去し、過剰のFluo-4、AMおよびTMRMを削除するには、のCa 2+μlの100のフリーHBSSを細胞を洗浄。 </li><li> 25 / mlの（w / v）のジギトニン、200 nMのTMRMとIMで1μMのタプシガルジンとIMイメージングソリューションを準備します。 注：ジギトニンの濃度は、ミトコンドリア内膜の透過化が起こらないことを確実にするために調整する必要があります。これは、強度を評価することによって経験的に決定することができますジギトニンの異なる濃度でTMRM信号の。 </li><li>ピペットでのCa 2+フリーのHBSSを削除して、細胞へのIMイメージングソリューションの300μlのを追加します。室温で10分間平衡化した細胞を残します。細胞は、今のCaCl 2添加物の撮像のための準備が整いました。 </li></ol> 4.細胞イメージング<ol><li>倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡上に皿やIMイメージング溶液中の細胞とチャンバーカバーガラスを置きます。 </li><li> TMRMとのFluo-4の励起および発光スペクトルのための顕微鏡レーザーの設定を使用します。例えば、それぞれTMRMとのFluo-4を励起し543nmでのHe-Ne及び473nmのアルゴンレーザーラインを使用しています。細胞への光損傷を最小限に抑えるために、約5％の低レーザーパワーを使用してください。 </li><li>画像ごとに25秒をスキャンするために顕微鏡を設定します。 TMRMとのFluo-4信号のベースライン測定値を確立するために10分間細胞をスキャンします。 注：フルオ4信号は、カルシウムコンセントを休んで弱いまたは検出不能であってもよいです配給。 </li><li> IMのイメージングソリューションの300μlの中の細胞への直接の40mMのCaCl 2ストック溶液3μlの追加（1：100希釈）をピペットで軽く混ぜます。必要に応じてのCaCl 2を添加し、混合しながら画像のスキャンを一時停止します。 注：Maxchelator WEBMAXCは（拡張として、最終的な遊離Ca 2+イオン濃度の[Ca 2+] IM撮像溶液中でそのようなソフトウェアを用いて計算することができる<a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> ）又はキレート化剤11。最終の遊離Ca 2+イオン濃度の計算方法の詳細な説明は、の[Ca 2+]は、以下のセクション6に記載されています。 </li><li>希望TMRMまたはのFluo-4の信号は、通常8〜10の追加の周りに、到達するまでのCaCl 2の追加ごとに4分を繰り返した後、約4分間の画像走査を続けます。 </li><li> 1 mMのFCCPの100希釈（最終C：ピペットを使用して、1を追加します。ΔΨmを放散する細胞に直接、10μMのoncentration）。さらに5分間画像セル。実験は完了です。 </li></ol> 5.画像解析<ol><li>撮像が完了すると、http://downloads.openmicroscopy.org/bioからバイオフォーマットプラグイン（ダウンロード &#39;bioformats_package.jar&#39;で例示ImageJソフトウェア、画像分析ソフトウェアを使用してのFluo-4とTMRMシグナルの強度を決定します-formats /とに保存 &#39;C：プログラムファイル ImageJのプラグイン」フォルダ）。 </li><li> ImageJの中で（例えば.oifファイル）画像ファイルを開きます。選択ツールをクリックして、ミトコンドリアが含まれている関心領域（ROI）を選択します。 ROIを選択するには、最初のTMRM信号を使用してください。 </li><li>開く]&gt; [ツール]&gt; [ROIマネージャー分析」、強度測定のために選択されたROIを含むように「追加」をクリックします。複数のROIを測定するための単一の画像上で選択することができます。すべてのROIまで、前の手順を繰り返しますsがROI Managerに追加されました。 </li><li> 「詳細&gt;マルチ測定」をクリックし、「すべてのスライスを測定する &#39;が選択され、「スライスごとに1つの行が「選択解除されていること、そして、TMRMの平均蛍光強度のテーブルとのFluo-4の信号を得るために、「OK」をクリックしていることを確認してください各時点での各ROIのため。 </li><li> TMRMとのFluo-4の信号の平均強度および標準偏差を計算するために、すべてのROIからのデータを使用してください。 </li></ol> 6.最終的な無料のCa 2+イオン濃度の[Ca 2+]の計算<ol><li>遊離Ca 2+イオン濃度IM撮像溶液中の[Ca 2+]は、Maxchelator WEBMAXC EXTENDED（などのソフトウェアを用いて決定することができる<a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> ）またはキレート剤11。 =温度を24℃、pH値= 7：たとえば、次のようにWEBMAXCの変数がEXTENDEDに設定します。1、イオン強度= 0.162、EGTA = 0.002 M、HEDTA = 0.01 M、のCa 2+ = 0.0004 MおよびMg 2+ = 0.0078 M.これは、最終的な遊離Ca 2+イオン濃度62 nMでの[Ca 2+]になります。これらのプログラムは、このような試薬の純度、測定およびpH決意の精度として、アカウントにすべての変数を取ることができないことに注意してください。遊離Ca 2+濃度を測定するための最も正確な方法は、較正された Ca 2+選択性電極を使用することです。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

カルシウムは筋収縮、神経伝達および細胞増殖13を含む多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしています。細胞カルシウム濃度の増加は、多くの場合、直接ATP世代3を上昇させるために、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を刺激することができるカルシウムで、エネルギー需要と関連しています。我々が効果的にミトコンドリアのカルシウム蓄積を監視すると、この機能は遺伝的要因と薬理学的薬剤の両方に影響されるかを比較できるようにする能力を持っていることが不可欠です。 プロトコル内の重要なステップこのプロトコルは、フルオ4、AMおよびTMRMと同時に、ミトコンドリアのカルシウム蓄積とΔΨmを監視する機能について説明します。染色プロセス中、のFluo-4の効果を最適化するために、室温で細胞をインキュベートすることが重要である、ミトコンドリアを検出するAMカルシウム。室温でのインキュベーションは、ミトコンドリア膜を通過し、ミトコンドリアマトリッ...

ミトコンドリアは、ローカルの Ca 2+緩衝液1として作用することにより、細胞内Ca 2+濃度の調節において重要な役割を果たしています。 Ca 2+のCa 2+ユニポーター、ミトコンドリア内膜（ΔΨmの）2を横切って存在する電気化学的勾配によって駆動されるプロセスを介してミトコンドリアに入ります。いったんミトコンドリアマトリックス内部に、Ca 2+がクエン酸回路3の3律速デヒドロゲナーゼを刺激することによって、酸化的リン酸化を活性化することができます。この刺激は、正のカルシウムイオンがミトコンドリアマトリックスにミトコンドリア内膜を横切るように一時的に放散されΔΨmを 、保持しています。ミトコンドリア内のCa 2+濃度が非常に高くなる場合は、ミトコンドリア透過性転移は、ΔΨmの損失で、その結果、開始することができ、cessatio酸化的リン酸化のNおよび経路4シグナル 、細胞死の誘導。 ミトコンドリアは細胞内カルシウムの空間的なバッファリングで果たす重要な役割は、ミトコンドリアのカルシウムの正確なモニタリングが重要なことができます。様々な方法は、ローダミン系染料の使用を含む、ミトコンドリアのカルシウムを監視するために確立されています。そのような染料、Rhod-2 AMは、6はミトコンドリアのCa 2+レベル5を測定するためにミトコンドリアに分割に非常に効果的です。ただし、注意がいくつかの染料は、リポソームのような他の細胞小器官に蓄積し、または細胞質ゾルに留まるとして使用する必要があります。それにもかかわらず、下流の分析は、ミトコンドリア7のものから、これらの信号を区別するために使用することができます。 ミトコンドリアのカルシウムを監視するための別の技術は蛍光レポーターが8を構築し利用します</s<html> &gt;アップ。これらの遺伝的にコードされたプローブの利点は、特に、例えば、ヒトCOXサブユニットVIIIのN末端標的化シグナルを内因性のN末端ペプチドを用いて、ミトコンドリアを標的とすることができるということです。このシステムは、9シグナリングミトコンドリアカルシウムを調査するために非常に有用であることが証明されている、ミトコンドリア標的エクオリンプローブを生成するために使用されてきました。これらの遺伝的にコードされたプローブの主な欠点は、（特定の細胞型のために実行可能ではなく、変数の結果を生成することができる）の一過性発現によって、または（時間がかかる場合）安定な発現系を作成することにより、細胞内に導入する必要があることです。 上記概説した問題を回避するために、我々は同時に、ミトコンドリアのCa 2+とΔΨ メートルを測定するための新しいプロトコルを開発しました。このプロトコルは、透過性細胞への外因性のカルシウムを追加し、以前に記載された方法に基づいていますS = &quot;外部参照&quot;&gt; 10。私たちのプロトコルは、他の方法に比べて3の主な利点があります：まず、我々は、ミトコンドリアのCa 2+とのΔΨ メートル 、非常に異なるスペクトル特性を有する2つの染料を監視するために、AMとTMRMをのFluo-4を使用します。第二のFluo-4信号のみがミトコンドリアのCaを検出しているように、細胞を透過処理されている2+およびCa 2+他の細胞小器官または細胞質ゾルに局在化していません。第三に、ミトコンドリアのCaを検出するためのFluo-4の使用は2+遺伝的にコードされたプローブを使用している場合に存在する任意の細胞トランスフェクションまたは形質転換の問題を否定する、高速かつ簡単な細胞染色を可能にします。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100xペニシリン/ストレプトマイシン(p / s)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0.25%トリプシン/ 0.25%EDTA</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>8ウェルチャンバーカバースリップ</td><td>同上</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<サブ2>2</サブシ</td><td>グマ>アルドリッチ</td><td>M2670&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>E4378&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEDTA</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>H8126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>リンゴ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ free Hank'緩衝塩溶液(HBSS)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>テトラメチルローダミン・メチルエステル・過塩素酸塩 (TMRM)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>ベラパミル</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>フルオ-4 アセトキシメチルエステル (フルオ-4, AM)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>シアン化カルボニルp-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>ジギトニン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>タプシガルギン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T9033</td><td></td></tr><tr><td>プルロニックF-127&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>P3000MP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 細胞培養皿</td><td>Corning</td><td>COR430167</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 細胞培養フラスコ</td><td>Corning</td><td>COR430641</td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

別にATPを生成する際に、それらの本質的な役割から、ミトコンドリアはまた、地元のカルシウム（Ca 2+）として機能緊密細胞内Ca 2+濃度を調節するためにバッファリングします。これを行うには、ミトコンドリアは、Ca 2+を封鎖するために彼らの内膜（ΔΨmの）全体に電気化学ポテンシャルを利用しています。ミトコンドリアへの Ca 2+の流入は、酸化的リン酸化（OXPHOS）錯体を介して電子伝達を増加させる、クエン酸サイクルの三律速デヒドロゲナーゼを刺激します。この刺激は、正のカルシウムイオンがミトコンドリアマトリックスにミトコンドリア内膜を横切るように一時的に放散されΔΨmを 、保持しています。 ここでは、同時に、共焦点顕微鏡を用いて、ミトコンドリアに生細胞におけるCa 2+取り込みおよびΔΨmを測定する方法について説明します。細胞を透過性により、ミトコンドリアのCa 2+することができます蛍光色素テトラメチルローダミンを用いて、ΔΨmの、メチルエステル、過塩素酸塩（TMRM）の測定を、蛍光の Ca 2+指示薬のFluo-4、AMを使用して測定します。このシステムの利点は、同時にミトコンドリアの Ca 2+及びΔΨMの正確な測定を可能にする蛍光色素との間の非常に小さなスペクトルの重なりがあることです。 Ca 2+アリコートの連続添加を用いて、ミトコンドリアの Ca 2+取り込みを監視することができ、およびCa 2+は 、ミトコンドリア膜透過性遷移とΔΨの損失を誘発する濃度を決定mです 。

私たちは、カルシウムの12の増加をバッファリングする143B細胞のミトコンドリアの能力にMT-ND5変異の影響を調べるために、このプロトコルを使用しています。ここに示した例では、制御143B細胞はTMRMとのFluo-4、ジギトニンで透過処理の前にAMを負荷しました。イメージングの5分後、1の8の順次追加：40mMの外因性のCaCl 2の100希釈の[Ca 2+]算出された最終遊離Ca 2+イオン濃度で、行われました。 それぞれのCaCl 2を添加した後、TMRM信号は、ミトコンドリアへのCaの流入として2+イオンを減少させ、ミトコンドリア膜電位ΔΨmを（ 図1）を消費します。呼吸がΔΨmを維持するため...

ミトコンドリアは、それらが細胞内の細胞質ゾルのCa 2+シグナル伝達を形成することができ、カルシウム（Ca 2+）隔離する彼らの内膜（ΔΨm）を横切って電気化学ポテンシャルを利用することができます。我々は、同時に、蛍光色素、共焦点顕微鏡を使用して、生細胞中のミトコンドリアの Ca 2+取り込みおよびΔΨmを測定するための方法を記載します。

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

本手法の全体的な目的は、共焦点顕微鏡を用いて、生細胞におけるミトコンドリアのカルシウム取り込みとミトコンドリア膜電位を同時に測定するための簡便な方法を提供することです。この手法は、ミトコンドリアが局所的なカルシウム貯蔵庫としてどのように機能し、細胞内カルシウム濃度を厳密に調節しているかといった、ミトコンドリア研究における重要な疑問を解明するのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝子操作を行うことなく、生細胞においてミトコンドリアカルシウムとミトコンドリア膜電位の両方を特異的に同時測定できる点にあります。この手法はミトコンドリア病の病理におけるカルシウム調節に関する知見を提供できるだけでなく、尿中のカルシウム調節が重要となる他の新しい変性疾患の研究にも活用できます。本手順では、細胞を10 cmの細胞培養ディッシュまたは75 cm²のフラスコを用い、37 °Cの培養液中で24時間培養します。細胞を回収するには、吸引により培地を除去し、5 mLのPBSで細胞を洗浄します。その後、PBSを吸引して除去します。次に、Trypsin EDTAを1.5 milliliters加え、細胞を37 °Cで2分間インキュベートします。続いて、ディッシュを軽く叩いて細胞を剥離させます。それらを5 mLの培地で再懸濁します。その後、血球計数計を用いて細胞数をカウントします。共焦点イメージングの前日に、細胞をディッシュまたはチャンバー付きカバーガラスに、コンフルエンシーが60〜70%になるように播種します。その後、細胞を37 °Cで一晩インキュベートし、細胞を接着・回復させます。この手順の中で、TMRM、Fluo 4 AM、および界面活性剤を用いて記録用染色液を調製します。培地を除去し、100 µLのPBSで細胞を洗浄します。次にPBSを除去し、100 µLのrecord染色液中で細胞を室温で45分間インキュベートします。その後、record染色液を除去し、100 µLのカルシウムフリーHBSSで細胞を洗浄して、過剰なFluo 4 AMおよびTMRMを除去します。次に、digitonin、TMRM、およびthapsigarginを含む細胞内イメージング溶液を調製します。次に、カルシウムフリーのHPSSを除去し、300 µLのIMイメージング溶液を細胞に加えます。塩化カルシウム添加によるイメージングを行う前に、細胞を室温で10分間静置して平衡化させます。細胞への光損傷を最小限に抑えるため、レーザー出力は約5%の低出力で使用してください。顕微鏡レーザーの設定を、TMRMおよびFluo 4 AMの励起および蛍光スペクトルに合わせて調整します。細胞への光損傷を最小限に抑えるため、レーザー出力は約5%の低出力に設定し、高ゲインを使用してください。次に、顕微鏡を25秒ごとに画像をスキャンするように設定します。10分間細胞をスキャンし、TMRMおよびFluo 4信号のベースライン値を測定します。次に、画像スキャンを一時停止し、300 µLのIMイメージング溶液中の細胞に、40 mM 塩化カルシウムストック溶液を3 µL直接添加します。ピペットで穏やかに混合してください。カルシウム溶液を細胞に添加する際は、顕微鏡ステージ上のディッシュを動かさないよう注意してください。約4分間、画像スキャンを継続します。その後、目的のTMRMまたはFluo 4シグナルが得られるまで、4分ごとに塩化カルシウムの添加を繰り返します（通常は8〜10回程度の添加となります）。続いて、1 mMのFCCPを1/100に希釈した溶液を細胞に直接添加し、内膜電位を消失させます。その後、実験が終了するまでさらに5分間、細胞のイメージングを行います。イメージングが完了したら、画像解析ソフトウェアを用いてFluo 4およびTMRMシグナルの強度を測定します。測定するには、画像を開き、選択ツールをクリックして、ミトコンドリアを含む関心領域（ROI）を選択してください。Analyze、Tools、ROI Managerを開くことで、測定したい複数の関心領域（ROI）を選択できます。[Add]をクリックして、選択したROIを強度測定に含めます。すべてのROIがROIマネージャーに追加されるまで、前の手順を繰り返します。マルチメジャー（multi measure）機能を選択し、各関心領域（ROI）におけるTMRMおよびFluo 4信号の平均蛍光強度を測定します。「Measure All Slices」が選択され、「One Row Per Slice」が選択解除されていることを確認してください。その後、「Okay」をクリックして、各タイムポイントにおける各ROIのTMRMおよびFluo 4信号の平均蛍光強度のテーブルを取得します。次に、データを統合して、TMRMおよびFluo 4シグナルの平均強度と標準偏差を算出します。本実験では、digitoninによる透過処理を行う前に、143B細胞にFluo 4 AMおよびTMRMをプレロードしました。塩化カルシウムを添加するたびに、カルシウムイオンがミトコンドリアに流入してミトコンドリア膜電位が消失するため、TMRMシグナルが減少します。透過性遷移後もわずかな膜電位が維持されていることがわかります。これは、10 µMのFCCPを添加することで膜電位の消失が依然として誘導されるためです。ここで、Fluo 4シグナルで示されるミトコンドリア内カルシウム濃度は、培地中の遊離カルシウム濃度が0.32 µMに達した際の2回目の塩化カルシウム添加後に上昇し始めます。その後の塩化カルシウムの添加ごとに、ミトコンドリア内カルシウムは漸増しました。ここでは、ミトコンドリアの膜電位とカルシウムの同時測定画像を示しています。赤色のシグナルはTMRMを、緑色のシグナルはFluo 4を示しています。この手法を習得し、適切に実施すれば、約2時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、透過処理した細胞に外因性カルシウムを添加し、共焦点顕微鏡を用いてミトコンドリアカルシウム濃度とミトコンドリア膜電位を同時に測定する方法について十分に理解できるはずです。FCCPおよびジギトニンを用いた操作は極めて危険であるため、本手順を実施する際は、常に個人用保護具（PPE）の着用などの予防措置を講じることを忘れないでください。

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生物学

このプロトコルは、蛍光イメージングによるミトコンドリアのカルシウムフラックスのリアルタイム測定のための方法を説明します。方法は、選択的にミトコンドリアで発現する循環permutated YFPベースのデュアル励起レシオメトリックカルシウムセンサー（レシオメトリックpericam -...

遺伝的にコードされたカルシウムのセンサを用いたアポトーシス時のミトコンドリア内カルシウム濃度の動的変更の監視

我々は、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いた生細胞における遅いフラックスから（マイクロ秒）急激なカルシウムのイベントを分離する方法を提示する。方法は、細胞に数百画素のラインスキャンを記録することによって、カルシウムの指標の蛍光強度の変動を測定する。ヒストグラム解析により、異なるカルシウムフラックスの時間スケールを分離することができます。...

心筋細胞における高速カルシウムフラックスの測定

ミトコンドリアの融合は、時間をかけてネットワークを介してミトコンドリアのマトリックスphotoconvertedをターゲットとしたGFPの平衡を追跡することによって測定した。これまでのところ、1つだけのセルが同時に時間の長い運動解析に供することができます。我々はこれにより、データ収集プロセスをスピードアップ、同時に複数のセルを測定する手法を提案する。...

並列共焦点顕微鏡を使用して複数のセルの動力学的データの取得の高速化、高解像度、MTPA-GFPベースのミトコンドリア融合アッセイ

このビデオでは、単離されたミトコンドリアにおけるミトコンドリアカルシウムの取り込みを測定するためのプレートリーダーベースのアッセイについて説明しています。このアッセイは、カルシウム感受性蛍光色素の蛍光シグナルを解析し、ミトコンドリアのカルシウム取り込みとカルシウム過剰の動態を研究します。...

ミトコンドリアカルシウム取り込みアッセイ:単離されたミトコンドリアにおけるカルシウム取り込みを測定するためのプレートリーダーベースの方法

このビデオでは、培養細胞におけるミトコンドリアカルシウムの取り込みを測定するための共焦点顕微鏡イメージングベースのアッセイについて説明しています。このアッセイでは、カルシウム感受性蛍光色素Rhod-2/AMを使用して、透過処理された培養細胞のミトコンドリアカルシウムを測定します。...

培養細胞におけるミトコンドリアカルシウム取り込みを測定するためのカルシウム注入アッセイ

このビデオは、マウスの脳動脈セグメントの内皮細胞における細胞内カルシウムレベルと膜電位の変化を同時に測定する方法を示しています。単離された内皮チューブには蛍光カルシウムインジケーターが充填され、細胞内カルシウム放出を誘導する薬剤で治療され、膜電位が変化します。インジケーターの蛍光性によりカルシウムレベルの測定が可能となり、細胞内に記録電極を挿入して膜電位の変化を測定します。...

マウス脳内皮における細胞内カルシウム電位と膜電位の同時測定

このプロトコルが Ca2 +保持能力と Ca2 +を調べる方法を説明することを目的 - トリガー SH SY5Y 分離ミトコンドリアの膨潤ミトコンドリア細胞ステップバイ...

ミトコンドリアの Ca2 +保持容量測定と Ca2 +-ミトコンドリアの膨潤アッセイをトリガー

ここでは、ミトコンドリアの分離および培養細胞のミトコンドリアの Ca2 +流入の測定のための 2 つのプロトコルを提案する.我々 のプレート リーダー ベース Ca2 +インポート詳細分離ミトコンドリアの試金を使用して、Ca2 +敏感なカルシウム グリーン-5N を染めます。培養細胞の Ca2 +染料ロード-2/AM...

ミトコンドリアの分離と培養細胞におけるミトコンドリアのカルシウム流入の解析

ここで説明は、(1) たてそのまま脳血管内皮「チューブ」と内皮細胞のカルシウムと膜内皮由来過分極電位 (2) 同時計測を隔離するためのプロトコルです。さらに、これらのメソッド内皮細胞カルシウムと個々...

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

この手法では、蛍光ベースのライブイメージングを使用して、HeLa細胞内のミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを視覚化し、定量的に測定するための効果的なワークフローについて説明します。...

HeLa細胞におけるライブイメージングを用いたミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの蛍光ベースの定量

学ぶ 共焦点顕微鏡を用いた生細胞内ミトコンドリアカルシウムと膜電位の同時測定法。遺伝子操作不要でリアルタイムにミトコンドリア機能を解析し、疾患研究に応用可能です。

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

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