蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

この手順の全体的な目標は、共焦点顕微鏡法を使用して、生細胞内のミトコンドリアカルシウム取り込みとミトコンドリア膜電位を同時に測定する簡単な方法を提供することです。この方法は、ミトコンドリアが細胞内のカルシウム濃度を厳密に調節するための局所的なカルシウム貯蔵庫としてどのように機能するかなど、ミトコンドリア分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝子操作を必要とせずに、ミトコンドリアカルシウムとミトコンドリア膜電位の両方を生命細胞で同時に特異的に測定できることです。

この方法は、ミトコンドリア病理学におけるカルシウム調節についての洞察を提供することができますが、小便器のカルシウム調節が重要な場合、他の新しい変性疾患の研究にも使用できます。この手順では、10 cmの細胞培養皿または75平方cmのフラスコで、37°Cの培養培地で24時間細胞を増殖させます。細胞を採取するには、吸引によって培地を取り除き、5ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。

その後、吸引によってPBSを除去します。次に、1.5ミリリットルのトリプシンEDTAを加え、細胞を摂氏37度で2分間インキュベートします。次に、皿を軽くたたいて細胞を取り除きます。

それらを5ミリリットルの培養培地に再懸濁します。その後、血球計算盤で細胞をカウントします。共焦点イメージングの前日に、細胞を60〜70%のコンフルエント度で皿またはチャンバーカバースリップにプレートします。

次に、細胞を摂氏37度で一晩インキュベートし、細胞が付着して回復するのを待ちます。この手順では、TMRM、Fluo 4 AM、および界面活性剤を含む記録染色溶液を調製します。培地を取り出し、100マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄します。

次に、PBSを除去し、細胞を100マイクロリットルの記録染色溶液で室温で45分間インキュベートします。その後、記録染色液を除去し、100マイクロリットルのカルシウムフリーHBSSで細胞を洗浄して、余分なFluo 4 AMおよびTMRMを除去します。次に、ジギトニン、TMRM、およびタプシガルギンを含む細胞内イメージング溶液を調製します。

次に、カルシウムを含まないHPSSを取り外し、300マイクロリットルのIMイメージング溶液を細胞に加えます。細胞を室温で10分間平衡化させてから、塩化カルシウム添加物でイメージングします。約5%の低レーザー出力を使用して、セルへの写真の損傷を最小限に抑えます。

顕微鏡レーザーの設定を使用して、TMRMおよびFluo 4 AMの励起スペクトルと発光スペクトルを測定します。レーザー出力は約5%と低く、高ゲインでセルの光損傷を最小限に抑えます。次に、25秒ごとに画像をスキャンするように顕微鏡を設定します。細胞を10分間スキャンして、TMRMおよびFluo 4シグナルのベースライン読み取り値を確立します。

次に、画像スキャンを一時停止し、3マイクロリットルの40ミリモル塩化カルシウムストック溶液を300マイクロリットルのIMイメージング溶液の細胞に直接追加します。ピペットでやさしく混ぜます。細胞にカルシウム溶液を添加する際は、顕微鏡ステージ上でディッシュを動かさないように注意してください。

画像スキャンを約4分間続けます。次に、目的のTMRMまたはFluo 4信号(通常は約8〜10回の追加)に達するまで、塩化カルシウムの添加を4分ごとに繰り返します。その後、1ミリモルのFCCPを1〜100希釈して細胞に直接追加し、内膜電位を消散させます。

次に、実験が終了する前に、さらに5分間細胞を画像化します。イメージングが完了したら、画像解析ソフトウェアを使用してFluo 4およびTMRM信号の強度を決定します。これを行うには、画像を開き、選択ツールをクリックして、ミトコンドリアを含む関心領域を選択します。

複数の関心領域を測定対象として選択するには、分析、ツール、ROIマネージャーを開きます。「追加」をクリックして、選択した ROI を強度測定に含めます。すべての ROI が ROI マネージャーに追加されるまで、前の手順を繰り返します。

各関心領域のTMRMおよびFluo 4シグナルの平均蛍光強度を測定するには、よりマルチな測定機能を選択します。[Measure All Slices] が選択され、[One Row Per Slice] が選択されていないことを確認します。次に、[OK] をクリックして、各時点における各 ROI の TMRM シグナルと Fluo 4 シグナルの平均蛍光強度の表を取得します。

次に、データを組み合わせて、TMRM信号とFluo4信号の平均強度と標準偏差を計算します。この実験では、143B細胞にFluo 4 AMとTMRMをプリロードしてから、ジギトニンで透過処理しました。塩化カルシウムが添加されるたびに、ミトコンドリアへのカルシウムイオンの流入によりミトコンドリア膜電位が消散するため、TMRMシグナルは減少します。

透過性遷移後には、10マイクロモルのFCCPを添加しても膜電位の崩壊が引き起こされるため、膜電位の崩壊が依然として明らかです。ここで、Fluo 4シグナルで示されるミトコンドリアのカルシウム濃度は、2回目の塩化カルシウム添加後、培地中の遊離カルシウムが0.32マイクロモルに達すると増加し始めます。その後の塩化カルシウムの添加ごとに、ミトコンドリアカルシウムが漸進的に増加しました。

ここに示されているのは、ミトコンドリアカルシウムの膜電位の同時測定の画像です。赤の信号はTMRMを示し、緑の信号はFluo 4を示します。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約2時間で完了します。

このビデオを見れば、透過処理した細胞に外因性カルシウムを添加して共焦点顕微鏡でミトコンドリアのカルシウムレベルとミトコンドリア膜電位を同時に測定する方法を十分に理解できるはずです。FCCPやジギトニンでの作業は非常に危険であり、この手順を実行するときは常にPPEを着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。