ホスト表現型の検討でカダヤシアフィニス続き抗生物質治療

この研究は、抗生物質により、皮膚や腸のmicrobiomeコミュニティ組成の変化を以下のモデル魚のホストへの影響を明らかにするためのメソッドが含まれます。

この実験システムの全体的な目標は、抗生物質治療後の宿主生物への悪影響を調べることです。したがって、この方法は、マイクロバイオームの破壊によって媒介される宿主の健康に対するenbac関連の副作用など、マイクロバイオーム分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。したがって、この技術の主な利点は、このシステムが脊椎動物の宿主の生理学的表現型を調べるのに簡単で安価であり、粘膜マイクロバイオームへの非侵襲的な混乱を可能にすることです。

この手法の意味するところは、動物のマイクロバイオームの混乱が大きな副作用を引き起こす可能性があることを特徴づけています。まず、以前に入手して凍結したEdwardsiella ictaluriの感染性株をE.Ictaluri選択的差動培地寒天培地にストリークします。培養物を摂氏27度で2日間インキュベートします。

純粋に分離されたコロニーを培養物から移し、40ミリリットルの栄養ブロスを含む150ミリリットルのフラスコに接種します。フラスコを摂氏27度、150RPMの振とうインキュベーターに2日間置きます。インキュベーション後、E.Ictaluri培養物を所望の感染性用量量に較正するために、PBSTを使用して培養物のサンプルをOD 650000000.2に希釈します。

ガンブシアアフィニスを採取し、水柱内のリファンピシンで魚を3日間処理した後、抗生物質処理された対照魚群と未処理の対照魚群の両方を、130ミリリットルの新鮮な人工池の水(APW)が入った個々のプラスチックカップに約10時間移し、魚組織からの薬物除去を行います。次に、魚を130ミリリットルのきれいなAPWが入った個々の8オンスのプラスチックカップに再度分離します。各魚に致死量のE.Ictaluri培養物を投与し、魚を摂氏27度で24時間インキュベートします。

E.Ictaluri浴の後、各魚を130ミリリットルのAPWが入った新しいカップに移します。魚に餌を与えずに、1週間の魚の死亡率を記録します。収集した糞便を滅菌ビニール袋に集めてから、滅菌済みの15ミリリットルの円錐管に移し、PBSTを使用して糞便のストック濃度を500〜800ミリグラム/ミリリットルに作成し、先端を切り落とした1ミリリットル以上のプラスチックピペットを使用して、APWで15ミリグラム/ミリリットルまたは10ミリグラム/ミリグラムの糞便物質のカップあたり130ミリリットルを準備します。

抗生物質で処理した魚または未処理の魚を溶液の個々のカップに移し、その後、魚を摂氏25度で2日間インキュベートし、この期間中の死亡率を綿密に観察および記録します。魚を土で処理するには、1〜キログラムの豊富な有機表土(深さ約7〜15センチ)を集め、きれいなプラスチック容器に移します。18.2グラムの土壌と130ミリリットルのAPWが入った個々のプラスチックカップを準備し、手で土壌をよく混合し、抗生物質で処理された魚または未処理の魚をカップに移し、摂氏25度で3日間放置します死亡率を記録します。

抗生物質治療後のAPWで10時間の休息期間の後、魚を塩化ナトリウムとAPWの17.5ミリグラム/ミリリットルを含む個々のカップに移し、魚の死亡率を36時間以上観察し、硝酸塩毒性の課題を実行し、以前と同様に10時間の休息期間の後、魚を硝酸ナトリウム1ミリリットルあたり10または17.5ミリグラム/ミリリットルとAPWの130ミリリットルを含む個々のカップに分けます。高用量の硝酸ナトリウムでの死亡率については1日、低用量の魚については4日間にわたって魚を観察します。グループでの3日間の抗生物質または対照曝露を完了した後、個々の魚について、8オンスの発泡スチロールカップに150ミリリットルのAPWを入れ、充填されたカップの重量を量った後、魚をカップに移し、初期評価のために総体重を記録します。

魚1匹につき2ペレットの餌を毎日魚に与え、食べ残しのペレットを視覚的に記録して消費量を監視します。4週間にわたる各週の終わりに、最初に新鮮なAPWのカップを計量して魚の重量を決定し、重量を記録し、次に魚をディップネットに注ぎ、新しいカップに移してから、カップを再度計量します。魚の群れの場合は、150ミリリットルのAPWをカップに入れ、スケールを風袋引きします。

魚をAPWの新しい容器に移すときは、魚を両方のグループにまとめてから、グループの合計重量を記録します。1か月にわたって、毎週末に計量を繰り返します。腸の通過時間を分析するには、360マイクロリットルの滅菌脱イオン水と52ミリグラムのゼラチンを滅菌1.7ミリリットルのチューブに加え、ゼラチンが溶けて完全に溶解するまで摂氏60度のヒートブロックに置きます。

人間と乳棒を使用して、金魚のフードフレークを微粉末に挽き、20マイクロリットルの魚油とともに40ミリグラムの粉末をチューブに加えます。混合後、1.6ミリグラムのFitCデキストランを加えます。20マイクロリットルの高温の液体をラボベンチのパラフィルムに分注し、すばやく冷まして固めます。

パラフィルムをペトリ皿の半分に置き、密封されたプラスチック容器内の滅菌水に浮かべます。固まった滴は、魚が食べるのに硬すぎる前に、冷蔵庫で最大4日間保管します。給餌の直前に、かみそりの刃を使用して滴を4分の1に切ります。

魚を餌なしで2日間個々の発泡スチロールカップに順応させ、餌の4分の4を魚のカップに入れ、魚がそれぞれ何個の餌を食べるかを30分間観察します。モニタリングを開始するには、個々の魚を80ミリリットルのAPWが入ったカップに移し、2時間ごとに1ミリリットルのサンプルを採取します。ラベル付きの1.7ミリリットルのチューブに摂氏4度で保管してください。

アッセイが完了したら、1 ミリリットルのサンプル全体をキュベットに入れ、蛍光分光光度計を使用して、495 ナノメートルの励起と 520 ナノメートルの蛍光を同時に記録します。ここに示すように、抗生物質によってマイクロバイオームが変化した魚は、対照の魚よりも E.Ictaluri 感染にかかりやすかったです。治療を受けた魚と対照の魚の平均死亡時間の差は有意ではなかった。

これは、グループの人数が少ないためと思われます。このグラフは、リファンピシンに曝露された魚は対照魚よりも浸透圧ストレスを受けやすいことを示しており、この分析では、塩分濃度が1ミリグラム/ミリリットルを超えると魚が急速に死に至りました。この表に示されているように、水柱の毒素硝酸塩に曝露された場合、抗生物質治療への事前曝露は生存に影響しませんでした。

1ミリグラム/ミリリットルでは、90時間後に抗生物質を治療した群と対照群の両方で50%の致死率が観察されました。水槽内の対照魚を用いたこの実験では、FitCデキストラン標識餌の2つのセクションまたは1つのセクションを魚に給餌し、周囲の水中の蛍光を経時的に測定することにより、食物の通過時間を調べました。この手順に続いて、総体脂肪貯蔵の測定や皮膚粘液産生の定量化などの他の方法を実行して、メカニズムを理解し、宿主の悪影響に寄与する可能性のある交絡因子を絞り込むことができます。