共焦点顕微鏡を使用してトランスフェクトされたヒト胚性腎細胞におけるアンジオテンシン受容体1a型の人身売買のライブセルイメージングと3D解析

この実験の全体的な目標は、アンジオテンシン 2 治療後のアンジオテンシン 1 型受容体リソソーム共局在の定量的な空間的および時間的証拠を取得することです。この方法は、リガンドシミュレーションに応答して発する内在化プロセスと同様に、Y型受容体と変異型受容体の細胞内処理の違いを検出するために考案されました。この技術の利点は、生命細胞イメージングにより、固定細胞や界面活性剤透過処理細胞からのアーチファクトが排除され、受容体局在の動的変化をリアルタイムで評価できることです。

まず、適切な開口数1.4の対物レンズを選択し、対物レンズを顕微鏡ステージの中央に配置します。高粘度、低自家蛍光浸漬油を対物レンズに一滴加え、トランスフェクションされた細胞の入ったチャンバーを顕微鏡ステージに移します。オイルが最初のスライドの底にちょうど触れるまで対物レンズをゆっくりと持ち上げ、薄暗いセルを見つけます。

関心のある健康な細胞を視野の中央で共焦点モードに切り替え、細胞が十分に広がり、腹側がカバースリップと密接に並置されていることを確認します。[Z スタック] ダイアログ ボックスを開き、[ライブ] をクリックし、セルの上部にフォーカスを合わせて、[開始] をクリックします。次に、セルの下部にフォーカスを合わせ、Z ステップ サイズ 1.00 マイクロメートルを入力して、[終了] をクリックします。

次に、上部の [Acquisition settings] で [XYZT Mode] を選択します。最後に、スキャンの時間間隔とスキャンの時間の長さを設定して、GFPタグ付きアンジオテンシンタイプ1A受容体のリソソームへのターゲティングを観察します。次に、リガンド刺激を開始するには、イメージング対象のウェルにリガンドの100倍ストック溶液を3マイクロリットル追加し、[開始]をクリックして、目的の期間と周波数の応答を3Dでイメージングします。

生細胞画像を解析するには、適切な3D画像定量化ソフトウェアを開きます。このプロトコルでは、Velocity.画像フィールド内を右クリックして、[プロパティ]を選択します。

GFPタグ付き受容体小胞、およびリガンド処理に応答したホール細胞強度を分析するための測定シーケンスを作成するための適切なXYおよびZ画像ピクセルプロパティを入力します。2Dメニューで、セルを観察するための拡張フォーカスモードを選択します。次に、フリースタイル領域ツールを使用して、セルの周囲に関心領域を描画し、画像を右クリックして[選択範囲に切り抜く]を選択します。

新しい画像アイテムが生成されます。画像名をクリックしてトリミングされたセル画像を選択し、測定タブを開きます。内在化された小胞のGFP発現を測定するには、FindingからFind Objectsを上のシーケンスボックスにドラッグします。

「オブジェクト検索」チャネルを「GFP」に設定し、設定アイコンを開いてしきい値を標準偏差に、下限を6に設定して、GFP強度が最も明るいオブジェクトを選択します。最小オブジェクト サイズを 0 マイクロメートルの 3 乗に設定します。次に、「測定」をクリックし、チャンネルと測定のタイプを選択します。

セル全体を識別するためのしきい値とフィルターを定義し、GFP の合計強度を測定するには、2 つ目の [オブジェクト検索] ボックスをドラッグします。次に、[オブジェクト検索] チャネルを GFP に設定し、標準偏差を 0 に設定して、任意の GFP 強度と最小オブジェクト サイズが 2 マイクロメートルの 3 乗のオブジェクトを選択します。Filter PopulationをPopulation two Find Objectsボックスにドラッグし、マイクロメートルの3乗の体積を選択し、100より大きいセル全体を選択して、すべての小さなオブジェクトを削除します。

次に、測定値を選択し、測定項目を作成して、すべての時点で測定を行います。測定されたGFP発現を小胞内および細胞全体の経時的に解析するには、画像名の下にある測定項目ファイル名をクリックしてください。合計データからGFPと小胞のデータを抽出するには、rawタブを開き、母集団1を選択します。

次に、分析されたタブを開き、データを右クリックして分析を選択し、続いて分析を母集団1に制限します。細胞全体のGFPの量を測定するには、両方を母集団2に変更します。「これらのデータの分析」と「集計方法」で、「GFP カラーチャネル」と「合計」を選択します。

次に、[データの整理基準と行] で、時点を選択します。リソソーム中のGFPの量のデータを抽出するには、母集団1のFind Objectsで、Find Objectsチャネルを赤チャネルに設定します。ダイアログボックス内のホイールアイコンで、使用するしきい値を標準偏差に、下限を6に設定して、最も明るい強度の赤いオブジェクトを選択し、最小オブジェクトサイズを0.017マイクロメートルの3乗に設定します。

測定値を選択し、測定項目を作成して、すべての時点で測定を行います。測定したリソソーム中のGFP発現を解析するには、画像名の下にある測定項目ファイル名をクリックしてください。生タブで母集団1を選択し、次に母集団1を選択し、GFPカラーチャネルを合計し、分析タブで合計し、前と同じように右クリックして赤い小胞のGFPの量を測定します。

リガンド刺激前、GFPタグ付きアンジオテンシン1A受容体は、主に原形質膜に局在していました。しかし、アンジオテンシン2を添加してから2.5分以内に、これらの受容体は内在化し、明るい小胞を形成し、後にクラスター化して大きなパラヌクリアゾーム小胞を形成します。アンジオテンシンの2つの誘導ラフリングは、これらの代表的なGFP発現測定データで観察されるように、全小胞GFP強度の定量化を複雑にします。

サイズフィルタリングでは、大きなフリルとクラスター化された小胞は区別されませんが、小さなオブジェクトのGFPは大きなオブジェクトのGFPよりも早く増加することがわかります。この代表的なオートフォーカスなしのGFP発現の時間経過において、内在化されたGFPを細胞全体のGFPの割合として測定しました。細胞内の全GFPを分析したところ、この細胞は経時的に目立った光白化を起こさなかったことが明らかになりました。

トランスフェクションされた細胞のリソソーム中のGFPの定量は、リソソーム内に存在するアンジオテンシン1A受容体の強度が、アンジオテンシン2回の投与後最大24分間変化しないことも示しています。この手順では、イメージング前およびイメージング中に細胞の健康状態を監視することを覚えておくことが重要です。この手順は時間がかかるため、細胞培養が何らかの形で異常である場合は実験を中止する必要があります。この手順に続いて、免疫染色とFRETまたはFLIMを使用して、受容体の細胞内局在を検出し、確認することができます。

ウェスタンブロットは、受容体輸送中に関与するシグナル伝達分子の同一性と変化に対処するために実施できます。このビデオを見れば、リソソームや他の細胞内コンパートメントを標的とするリガンド誘導膜貫通受容体を測定するためのライブセルイメージングと解析の方法について十分に理解できるはずです。