非侵襲的インビボ活性化可能な蛍光イメージング剤を用いた炎症性MMP活性の蛍光イメージング
May 8th, 2017
この論文は、炎症の二つの異なる実験モデルにおいて、キーマトリックスメタロプロテアーゼのインビボ活性を視覚化するために活性化光イメージングプローブを用いた蛍光イメージングの応用について説明します。
この手順の全体的な目標は、光学イメージングを使用して活性化可能なプローブを視覚化し、炎症の実験モデルにおける主要なマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)のin vivo活性を評価することです。この方法は、炎症性疾患の根底にある生物学的メカニズムに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、速く、安価で、習得しやすいことです。
さらに、さまざまな生物学的プロセスを標的とする多種多様なプローブが利用可能です。関節リウマチ誘発の場合、最初にマイクロメーターを使用して、各動物の足首の直径をすべて測定します。次に、第1のマウスを尾部で優しく持ち上げ、グルコース6リン酸イソメラーゼまたはGPIに対する抗体を含む希釈したKBNマウス血清を200マイクロリットル腹腔内に注入する。
その後、動物をケージに戻し、6日目まで毎日足首の腫れを測定します。接触過敏症の感作のために、麻酔をかけたマウスの腹部の2 x 2センチメートルの領域を慎重に剃るために小動物の毛のトリマーを使用し、100マイクロリットルのピペットを使用して、露出した皮膚に新たに調製された5%TNCB溶液の80マイクロリットルを適用します。処置中のどの時点でも皮膚を傷つけないようにすることは非常に重要です。これは、動物内で非特異的な蛍光シグナルを引き起こし、研究結果に影響を与える可能性があるためです。
回復期に体温が低くならないように、動物をそっとケージに戻します。6日後、ピペットを使用して20マイクロリットルの1%TNCB溶液を右耳の両側に塗布し、続いて100マイクロリットルの1%TNCBを2日おきに最大10日間塗布し、耳の厚さを毎日測定します。in vivo MMP活性を測定するには、まず活性化可能な光学イメージング色素を穏やかにボルテックスし、マウスごとに2ナノモルの色素を含む0.5ミリリットルのインスリン注射器をロードします。
次に、ポリエチレンカテーテルに取り付けられた30ゲージの針を別のシリンジに装備し、最初のマウスの尾を温水に入れます。静脈が拡張したら、針の切断端が尾の遠位側で20度の角度でカテーテルを拡張した尾静脈に挿入し、シリンジを再度吊り下げてカテーテルの正しい配置をテストします。.カテーテルが適切に配置されている場合は、シリンジを交換し、プローブの2ナノモルを注入します。
次に、光学イメージングプローブシリンジを0.9%生理食塩水を含むシリンジと交換し、25マイクロリットルの生理食塩水を尾静脈に注入して、ポリエチレンチューブのデッドボリュームを完全にクリアします。次に、光学イメージングスキャナーのイメージングスキャナーボックスを摂氏37度に設定し、視野の中央にあるスキャナーボックスに最大5匹のマウスを配置します。注入の24時間後、イメージングソフトウェアを開き、システムを初期化して、CCDカメラを動作温度まで冷却します。
システムの準備ができたら、イメージングプローブの蛍光に応じて適切な波長とイメージングパラメータを設定します。in vivoイメージングシステムの取得コントロールパネルがポップアップします。次に、「Acquire sequence」をクリックして測定を開始します。
取得した画像を保存するには、目的の保存場所を選択します。さらに、画像ラベルの編集ウィンドウでさらに情報を追加できます。ここでは、明確に増強された蛍光シグナルは、対照動物で観察された最小限のシグナルと比較して、疾患誘発後6日目に関節リウマチマウスの前足と足首で観察できます。
実験動物および対照動物の器官におけるMMP活性の生体分布解析は、関節リウマチマウスの関節のみの足首および前足におけるシグナルの増強を示している。興味深いことに、関節リウマチマウスの両腎臓でもMMPシグナルの増強が観察されましたが、肝臓と腸は関節リウマチの状態に関係なく強力なMMPシグナルを示しています。右耳への 5 つの TNCB チャレンジによって誘発される慢性的な接触過敏反応では、健康な左の対照耳と比較して、炎症を起こした右耳で MMP 活性が大幅に増加しました。
関節炎および健康な足首または足の信号強度の半定量的分析は、関節炎の足首で7倍に増強されたMMP信号強度を示し、健康な動物のそれと比較して前足で検出されたMMP信号強度が3倍高いことを示しています。急性および慢性の接触過敏反応耳も、1つのチャレンジだけで5番目のチャレンジまで上昇したままであっても、MMP信号の大幅な増加を示します。この方法は、さまざまな実験動物モデルに容易に導入でき、生体内での基礎となる生物学的プロセスと治療法の長期的な追跡調査を可能にします。
この手順を試行する際には、各光学イメージングプローブの注入手順と取り込み時間が異なることを覚えておくことが重要です。したがって、新しい蛍光色素と光学イメージングプローブごとに縦断的研究を完了する必要があります。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、最大5匹の動物を10分以内に完了させることができます。
この方法は、in vivoでの炎症のメカニズムについての洞察を提供することができますが、がんや神経変性などの他の疾患の研究にも適用できます。このビデオを見れば、炎症性疾患のモデルで活性化可能なイメージングプローブを用いたin vivo光学イメージングの使用方法を十分に理解できるはずです。
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概要
この論文では、活性化可能な光学イメージングプローブを使用して、炎症の2つの異なる実験モデルにおける主要なマトリックスメタロプロテイナーゼのin vivo活性を視覚化する方法を説明しています。この方法は、炎症性疾患における基礎となる生物学的メカニズムに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。
主要な研究コンポーネント
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- イメージング技術
背景
- マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMPs）は炎症において重要な役割を果たします。
- MMPの活性を理解することで、炎症性疾患への洞察が得られます。
- 蛍光イメージング技術はリアルタイムでの観察に有用です。
- 活性化可能なプローブは生物学的システムにおけるイメージングの特異性を高めます。
研究の目的
- 炎症モデルにおけるMMPのin vivo活性を視覚化する。
- 光学イメージング技術の有効性を評価する。
- 炎症反応の基礎となる生物学的メカニズムを探求する。
使用された方法
- 活性化可能な光学イメージングプローブの使用。
- 炎症の実験モデル。
- 視覚化のための蛍光イメージング技術。
- in vivoでのMMP活性の評価。
主な結果
- 生体モデルにおけるMMP活性の成功的な視覚化。
- 蛍光プローブの使用の実現可能性を示しました。
- 炎症のダイナミクスに関する洞察を提供しました。
- イメージング技術の利点を強調しました。
結論
- この方法は迅速で、費用対効果が高く、学習が容易です。
- 異なる生物学的プロセスに対応する様々なプローブが利用可能です。
- このアプローチは炎症性疾患の理解を進めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Non-invasive in vivo fluorescence optical imaging of MMP activity enables real-time visualization of protease-driven tissue remodeling in inflammatory disease models. This approach supports target validation by linking MMP activity to disease progression in rheumatoid arthritis and contact hypersensitivity models. The method provides quantitative, longitudinal readouts that aid in mechanistic de-risking and predictive confidence for anti-inflammatory therapeutic candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing MMP activity as a functional readout of inflammatory pathway activation.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct, non-invasive measurement of target engagement in live animals.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating MMP signal intensity with disease severity across models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline MMP activity in disease vs. control states.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible fluorescence outputs suitable for assay optimization and compound screening.
- Scalability: Facilitates platform reuse across inflammation models with minimal revalidation due to consistent probe behavior.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with translational biomarker strategies by detecting MMP activity in target tissues such as joints and inflamed ears.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation via longitudinal tracking of MMP dynamics.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying target modulation in response to therapeutic intervention.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through preclinical efficacy testing, particularly for inflammation-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by imaging MMP activation in response to pro-inflammatory stimuli.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative, reproducible signal detection in diseased tissues.
- Analytics: Provides semi-quantitative intensity measurements that allow cross-group comparison and therapeutic effect assessment.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by demonstrating MMP activity in disease-relevant tissues over time.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability across multiple inflammatory disease models and probe sets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in MMP-driven disease models.
- Operational Value: Offers standardization, reproducibility, and ease of implementation across diverse animal models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions through objective, imaging-based target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by linking MMP inhibition to phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent probe handling and intravenous injection techniques.
- Depends on access to a calibrated in vivo imaging system with NIR capabilities.
- Necessitates standardization of imaging parameters and probe dosing across study groups.
- Involves adaptation considerations for different disease models and anatomical sites of interest.
- Includes practical limitations such as probe uptake time and signal variability requiring longitudinal validation per dye.
