液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達

本実験手順の全体的な目的は、液晶ベースのナノ粒子をデリバリープラットフォームとして用い、疎水性カーゴを生きた哺乳類細胞の細胞膜の親油性部分へ制御して届けることです。この手法は、水溶性の低い疎水性カーゴの効率的なデリバリーおよび細胞内取り込みをどのように実現するかといった、ドラッグデリバリー分野における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、膜標的型の疎水性カーゴを細胞膜へより特異的にデリバリーでき、同時に細胞毒性を低減できる点にあります。

本手順の実演は、私の研究室のポストドクターであるDr.Okhil Nagが行います。まず、テキストプロトコルに記載されている通りにDiO液晶ナノ粒子の調製から開始してください。次に、HEPESバッファー中のDiO液晶ナノ粒子1.0 milliletersに、調製したばかりのNHSS/EDCワーキングソリューションを20 microliters添加します。

5分間撹拌します。次に、コレステロールPEGアミンのストック溶液20 µLをこの混合液に加え、2時間撹拌します。2時間後、卓上ミニ遠心機を用いて、反応混合液を最大速度で30秒間、短時間遠心分離します。

次に、上清をDulbecco'sリン酸緩衝生理食塩水で平衡化したPD 10サイズ排除クロマトグラフィーカラムに通します。ゲル電気泳動によって、DiO液晶ナノ粒子表面へのPEGコレステロールの共有結合的な接合が成功したことを確認するため、テキストプロトコルに従ってアガロースゲルを調製します。ゲルが凝固したら、チャンバー内でゲルが浸るのに十分な量のTBE泳動緩衝液を加えます。

次に、ゲルのウェルにDiO液晶ナノ粒子サンプルを35 µL加え、110 Vの電圧で20分間電気泳動を行います。励起フィルターを488 nm、蛍光フィルターを500〜550 nmに設定したゲルイメージングシステムを用いて、ゲルの画像を撮影します。14 mmのNo.1カバーガラスインサートを装着した直径35 mmの組織培養ディッシュを用意し、DPBSを用いて牛フィブロネクチンで37 °Cで2時間コーティングします。

2時間後、培養皿からフィブロネクチンコーティング溶液を除去します。T25フラスコからHEK 293 T17細胞を回収するため、まず細胞単層を3 mLのDPBSで洗浄し、次に2 mLのtrypsin EDTAを加えます。フラスコを37 °Cで約3分間インキュベートします。

細胞がフラスコから剥離したら、4 mLの完全培地をフラスコに加えてトリプシンを中和します。細胞カウンターを用いて懸濁液中の細胞濃度を測定します。その後、増殖培地を用いて細胞濃度を約80,000 cells/mLに調整します。

細胞懸濁液を3 mLディッシュに加え、インキュベーターで一晩培養します。翌日、細胞はほぼ70%のコンフルエンシーに達し、使用可能な状態になります。高い割合の細胞を確実かつ効率的に標識するためには、適切な細胞密度が極めて重要です。

対応するストック溶液を希釈し、デリバリー培地を用いてDiO、DiO液晶ナノ粒子、およびDiO液晶ナノ粒子PEGコレステロールの溶液をそれぞれ1 mLずつ調製する。セロファンピペットを用いて培養皿から増殖培地を除去し、細胞単層をHEPES DMEMで2回洗浄する。洗浄は、ピペットを使用してHEPES DMEMを皿の端に緩やかに加え、その後除去することで行う。

調製したDiOフリー溶液またはDiO液晶ナノ粒子デリバリー溶液を0.2 milliliters、培養皿の中央に添加します。その後、適切な時間、培養皿をインキュベーターに戻します。インキュベーション時間が長すぎると、非膜領域への非特異的な細胞標識が起こります。

インキュベーション後、セロロジカルピペットを用いてデリバリー溶液を除去します。DPBSを1回あたり2 mL使用し、細胞単層を2回洗浄します。4%パラホルムアルデヒドを用い、室温で15分間細胞単層を固定します。

ピペットを用いてパラホルムアルデヒド溶液を除去し、2 mLのDPBSで細胞を1回静かに洗浄します。これで、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、膜上の蛍光シグナルの有無をイメージングする準備が整いました。加熱インキュベーションチャンバーを備えた顕微鏡ステージ上で、共焦点顕微鏡を用いて生細胞サンプルのイメージングを行い、膜の標識状態を評価します。

直ちにイメージングを行わない場合は、培地を0.05%アジ化ナトリウム含有DPBSに置換し、ディッシュを4°Cで保存します。本手法では、FRETドナーとしてDiOを、FRETアクセプターとしてDiIを細胞に共ラベルします。前述と同様に、まずDiO液晶ナノ粒子PEGコレステロールで細胞をラベルし、続いてDiIフリーでラベルします。

染色後、セロロジカルピペットを用いて2 mLのDPBSで細胞を1回洗浄し、2 mLの生細胞イメージング溶液に置換します。加熱インキュベーションチャンバーを備えた顕微鏡ステージ上で、FRETイメージングが可能な共焦点顕微鏡を用いて生細胞サンプルの画像を撮影します。DiOドナーを488 nmで励起し、32チャンネルのスペクトル検出器を用いて490 nmから700 nmまでのDiOドナーとDiIアクセプターの両方の全放出スペクトルを収集するように設定し、4時間にわたって30分間隔で実験を行います。

次に、DiO液晶ナノ粒子PEGコレステロールおよびDiIで染色した細胞から、DiOドナーとDiIアクセプターの両方の時間分解放出強度を測定します。最後に、テキストプロトコルに記載されている通り、画像の時間分解アクセプター・ドナーFRET比を算出します。遊離のDiOは、2種類のラベルを付加した膜リン脂質で対比染色された細胞の細胞膜ではなく、細胞内部に非特異的に蓄積します。

これはマージ画像で視覚化できます。逆に、DiO液晶ナノ粒子PEGコレステロールは、二重標識された膜リン脂質との共局在によって視覚化されるように、細胞の細胞膜のみを特異的に標識します。FRETでは、DiOドナーからDiIアクセプターへのエネルギー転移の増加が観察されることで、液晶ナノ粒子から膜脂質二重層へのDiOの分配が確認されます。

DiOとDiIの間のFRET、およびDiOとDiIの放出光の変化により、時間の経過に伴いDiOからDiIへのFRETが増加することが確認されました。DiO液晶ナノ粒子PEGコレステロールナノ粒子は、生存率90%と最小限の細胞毒性を示しましたが、遊離のDiOでは生存率約50%と著しい毒性が認められました。このビデオを視聴することで、カーゴを封入した液晶ナノ粒子の合成方法、細胞標的化のためのバイオ機能化、および細胞へのデリバリー成功を確認するためのカーゴ封入細胞のイメージング方法について、十分に理解できるはずです。

一般的に、この手法に不慣れな方は、水溶液から細胞膜へDiOを特異的に届けることが大きな課題となるため、苦労することがあります。私たちはまず、抗がん剤ドキソルビシンを細胞内に届けるために液晶ナノ粒子プラットフォームを使用し、それが薬物の細胞内取り込みキネティクスを調節できることを確認したことで、この手法を着想しました。本手順に従うことで、水媒体から細胞への輸送において特に困難を伴う、幅広い疎水性カーゴの細胞内デリバリーにこのアプローチを適用することが可能です。

この手法を用いることで、脳イメージング用の電位感受性色素や光力学治療用の光力学薬など、膜標的薬および生物活性分子をより効率的に届けることが可能になります。