Name: 液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学ぶ液晶ナノ粒子を用いた疎水性貨物の標的細胞膜配達法。DiOナノ粒子調製とPEGコレステロール修飾により、哺乳類細胞への効率的な取り込みと低細胞毒性を実現する革新的なドラッグデリバリー技術です。

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DIO-LCNPとDIO-LCNP-PEG-Cholでの調製<ol><li>液晶ジアクリレート架橋剤（DACTP11、45 mg）を溶かし、3,3&#39;- dioctadecyloxacarbocyanine過塩素酸（DIO、2 mg）を、クロロホルム2ml中の重合のためのフリーラジカル開始剤（アゾビスイソブチロニトリル、1 mg）を。アクリレート官能化界面活性剤の水溶液（AC10COONa、7ミリリットル中13ミリグラム）にこれを追加します。 </li><li>水中で重合性界面活性剤に囲まれた有機材料の小滴からなるミニエマルジョンを生成するために5分間、80％の振幅で1時間混合し、超音波処理をかき混ぜます。 </li><li>油浴中で64℃に混合物を加熱 クロロホルムをゆっくりと界面活性剤によって安定化されたDIO含有NP懸濁液を残して、蒸発するように、架橋剤及び界面活性剤の両方の重合を開始します。 </li><li>任意の凝集を除去するために、0.2μmのシリンジフィルターを通してNP懸濁液（3回）をフィルタリングします。サントさらに使用するまで4℃で濾過さNP溶液を再。 </li><li> EDCカップリングを介したDIO-LCNPへのPEG-Cholでの結合。 <ol><li>チョル-PEG-NH 2を溶解・25mMのHEPES緩衝液（pH7.0）中のHCl（PEG-Cholで0.9ミリモル）。 </li><li> N -ヒドロキシスクシンナトリウム塩（NHSS、40ミリモル）、濃縮ストック溶液からのHEPES緩衝液中の1-エチル-3-（3-（ジメチルアミノ） -プロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC、400ミリモル）を含む作動溶液を調製します。 </li><li>すぐにHEPES緩衝液中DIO-LCNPの1.0ミリリットルにNHSS / EDCの新たに調製したワーキング溶液の20μlを添加し、5分間攪拌。 </li><li>この混合物にチョル-PEG-NH 2・HClをストック溶液20μlを加え、2時間撹拌します。 </li><li>簡潔には、卓上小型遠心機を用いて30秒間最高速度（〜2,000×gで）で反応混合物を遠心分離し、で平衡化したPD-10サイズ排除クロマトグラフィーカラム13を介して上清を渡しダルベッコのリン酸緩衝食塩水（DPBS、0.1×）。 </li></ol></li></ol> DIO-LCNPとDIO-LCNP-PEG-Cholでの2キャラクタリゼーション<ol><li> ゲル電気泳動によりDIO-LCNP表面にPEG-Cholでの成功共有結合を確認してください。 <ol><li>緩衝液;トリス - ホウ酸電気泳動（89 mMトリス（pHは7.6）、89 mMのホウ酸、および2 mMのEDTA TBE）の50ミリリットル（1×）でアガロースの0.5グラムを溶かし。アガロースを溶解し、マイクロ波オーブン中で溶液を加熱します。ソリューションは少し冷やすと電気ボックス内のゲルプレートに内容を注ぐできるようにします。サンプルウェルを作成するために、ゲルコームを挿入します。 </li><li>ゲルが固化した後、チャンバーにバッファを実行しているTBEの（チャンバー内のゲルを沈めるのに十分な）必要な量を追加します。 </li><li>ゲルのウェルに（グリセロール、5％v / vので改正）DIO-LCNPサンプルの35μlを添加して、110 Vの電圧で20分間実行します</li><li>画像ゲルイメージングシステムのWiを用いてゲルを番目の励起および発光フィルターはそれぞれ488 nmおよび500〜550 nmの、で。 </li></ol></li><li> PBS（pH約8、0.1×）でDIO-LCNP溶液（〜200倍希釈）を希釈し、DLS機器14で測定することにより、動的光散乱（DLS）により粒子サイズおよび分布を評価します。適切なゼータ電位測定器を使用して、DIO-LCNPsのゼータ電位を測定します。 </li></ol>配信実験とイメージングのための細胞培養皿の調製注：DIO-LCNP標識は、以前4に記載のように培養し（継代5と15の間）HEK 293T / 17ヒト胚性腎臓細胞上で行われます。送達実験および以下に説明するように後続の細胞イメージングを行います。 <ol><li> 20μgの濃度のウシフィブロネクチン（〜100μlでそれらをコーティングすることにより、（14ミリメートル第1カバーガラスインサートを装着）35ミリメートルの直径の組織培養皿を準備/ ml）をDPBS中で37℃で2時間。 </li><li>培養皿からフィブロネクチンコーティング溶液を除去します。収穫HEK最初の洗浄によってT-25フラスコから293 T1 / 7細胞をDPBS 3mLで、次いで、トリプシン-EDTA（0.5％トリプシン、0.25％EDTA）を2mlを添加することにより細胞単層。 </li><li> 〜3分間37℃でフラスコをインキュベートします。トリプシン-EDTAを削除し、インキュベーターにフラスコを返します。細胞をフラスコから分離された後、完全培地4mlを添加することによりトリプシンを中和フラスコに（; DMEMダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清、5％ピルビン酸ナトリウム、および5％の抗生物質/抗真菌剤を含有するように修正しました） 。セルカウンタでそれらをカウントすることにより、懸濁液中の細胞濃度を決定します。 </li><li>成長培地で〜8×10 4細胞/ mlに細胞濃度を調整します。一晩インキュベーター内で皿や文化に細胞懸濁液の3ミリリットルを追加します。翌日、細胞は〜70％コンフルエントであるべきであり、使用できる状態でなければなりません。十分な細胞密度は、細胞の割合が高いの堅牢かつ効率的な標識のために重要です。 </li></ol> 4.細胞DIOとDIO-LCNPsの配信および固定細胞のイメージング<ol><li>配信媒体にDIO、DIO-LCNP、およびDIO-LCNP-PEG-Cholの1 mlの溶液を調製する（HEPES-DMEM; DMEMは、25 mMのHEPESを含む）DIO 自由とDIO-LCNPsの原液を希釈することにより、細胞上でのインキュベーションのための適切なDIO濃度は〜1-10μM（DIO-LCNPの形で自由 DIOやDIOの濃度のいずれかで表される）になります。 </li><li>血清学的ピペットを用いて培養皿から培地を除去し、細胞単層を洗浄HEPES-DMEM（2ミリリットル各洗浄）で2回（ステップ3を参照）。穏やかに/皿の端からピペットを用いて、HEPES-DMEMを追加および削除することにより、洗浄液を実行します。 </li><li>培養皿の中心に準備されたDIO 無料またはDIO-LCNP配信ソリューションの0.2ミリリットルを追加し、私に料理を返します（実験の必要性に応じて、典型的には15または30分）の時間の適切な期間ncubator。より長いインキュベーション時間は、非膜状の領域のより非特異的な細胞の標識（ 例えば 、細胞質ゾル）に追加します。 </li><li>インキュベーション期間の後、血清学的ピペットを使用して配信ソリューションを削除します。 DPBS（2ミリリットル各洗浄）で細胞単層を2回洗浄します。静かに皿の縁から/へのDPBSの追加や削除によって洗浄液を実行します。 </li><li>室温で15分間（DPBS中で調製した）4％パラホルムアルデヒドを用いて、細胞単層を固定してください。 注意：パラホルムアルデヒドは、呼吸器刺激可燃性であり、疑いのある発癌物質。 </li><li>ピペットを用いて、パラホルムアルデヒド溶液を外し、静かに皿の縁から/へのピペットを用いてDPBSの追加や削除によってDPBS（2ミリリットル）で細胞を1回洗浄します。 </li><li>固定された細胞は、共焦点レーザ走査を用いて膜状蛍光シグナルの存在を撮像する準備ができています顕微鏡（CLSM）。すぐに撮影を行うか、あるいは、NaN 3を0.05％を含有するDPBSで培地を交換し、4℃で料理を保存します。 注意：NaNの3は有毒です。 NaN 3を使用する際に細心の注意を払って。 注：この方法で保存修正されたサンプルは、最適な結果を得るために48時間以内に画像化されるべきです。 </li></ol>ライブ細胞におけるDIOとDIO-LCNPsとFRETイメージングの5細胞送達注：この方法では、細胞は6μM（DIOがFRETドナーである）各DIO-LCNP-PEG-Cholの1,1&#39;-ジオクタデシル-3,3,3 &#39;、3&#39;-テトラメチル過塩素酸塩（DIIとcolabeledされています、 無料のDiI）はFRETアクセプタです。形質膜へのDIO-LCNP-PEG-Cholを、その取り込みからDIOの放出は、DiIをアクセプターへのDIOドナーからのエネルギー移動の観察された増加によって確認されました。 <ol><li> DIO-LCNP-PEG-CholのとDiIをFREで順次ラベル細胞Eステップ4に記載した方法を使用して。 </li><li>染色した後、血清学的ピペットを用いて、（2ミリリットル）DPBSで細胞を1回洗浄し、ライブセルイメージングソリューション（LCIS）の2mlで洗浄緩衝液を交換してください。 </li><li>加熱されたインキュベーションチャンバーを備えた顕微鏡のステージ上で、画像生細胞試料488 nmで励起したDIOドナーにより4時間にわたって30分間隔でFRETイメージング構成で共焦点顕微鏡（60X対物レンズ）を使用して、フル発光を集めますDIOドナーおよび32チャンネルのスペクトル検出器を備えた490から700ナノメートルからのDiIアクセプターの両方のスペクトル。 </li><li>注：FRETイメージングの詳細については、15を参照して参照してください。 </li><li> DIOドナーとDIO-LCNP-PEG-CholをとのDiIで染色した細胞からのDiIアクセプターの両方の時間分解発光強度を決定します。画像のための時間分解アクセプタ/ドナーFRET比（DII EMI / DIO EMI）を計算し、着実に増加し、最終的には板れます膜に分割DIO供与体の量は、最大値16に達した後のau。 </li></ol> 6. DIOの細胞毒性アッセイとDIO-LCNPs HEK 293T / 17細胞へ注：DIO-LCNP物質の細胞毒性は、テトラゾリウム染料ベースの増殖アッセイ17を使用して評価されます。細胞は、配達/ラベリングをエミュレート条件下での材料の様々な濃度の存在下でのマルチウェルプレート中で培養します。次いで、細胞増殖を可能にするために72時間培養されます。色素（MTS（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-5-（3-カルボキシメトキシフェニル）-2-（4-スルホフェニル）-2H-テトラゾリウム）をウェルにその後に追加され、代謝的に活性細胞は青色ホルマザン生成物への色素を変換する。発色の量は生存細胞数に正比例します。 <ol><li>収穫HEKステップ3.2.Seedに記載された手順に従って、T-25フラスコから293 T1 / 7細胞HEK 293T / 17細胞（5,000細胞/100μl/ウェル）24時間96ウェル組織培養処理プレートと文化のウェルに。 </li><li>完全にマイクロピペットを用いてウェルから培養培地を除去し、ウェルを複製するために濃度を増加で無料 DIO、DIO-LCNPs、またはDIO-LCNP-PEG-Cholのを含むHEPES-DMEMの50μlを添加します。 37℃で30分間細胞上でインキュベートします。 注：一般的に、三重または四重に行わレプリケート統計的に信頼できるデータを得るのに十分です。 <ol><li>インキュベーション後、マイクロピペットを用いて物質を含む配信媒体を除去し、100μlの増殖培地と交換してください。 72時間の培養細胞を。 </li></ol></li><li>各ウェルにテトラゾリウム基質20μl加えインキュベーターにプレートを戻し、そして発色を4時間37℃で進行させます。 570 nmでのホルマザン産物の吸光度（ABS）を読む（このSTUで使用DIO-LCNPsの吸収最小値非特異的なバックグラウンド吸光度を差し引くためのDY）および650nmの（）マイクロタイタープレートリーダーを用いて。 </li><li>物質濃度対および制御細胞増殖（唯一の細胞培養培地中の細胞の増殖の度合い）のパーセントとして結果を報告-微分吸光度（ABS 650、ABS 570）をプロットします。 </li></ol> 7.データ解析<ol><li>統計的分散の単変量解析（ANOVA）を用いてデータを分析します。多重比較のために、ボンフェローニの事後検定を適用します。特に断りのない限り平均値の±標準誤差（SEM）など、すべての平均値を提供します。 注：重要性のために許容できる確率は、p &lt;0.05でした。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

NMDDの継続的な目標は、同時改善された薬物の有効性と合わせ、細胞や組織への制御さターゲティングおよび薬物製剤の送達です。これは重要な課題を提起しているために、薬物分子の一つの特定のクラスは、水性媒体中でなし溶解性に難持つ疎水性薬物/造影剤です。この問題は、臨床設定にインビトロ細胞培養系からの強力な薬物の移行を悩ませてきたし、「棚上げ」である有望な薬剤分子の数をもたらしたか、放棄されたと臨床の場でさらに追求していません。ワートマニン（Wtmn）は、例えば、ホスファチジルイノシトール3 &#39;キナーゼおよびホスファチジルイノシトール3&#39;キナーゼ関連キナーゼの強力な阻害剤であり、抗癌剤として大きな可能性を秘めているが、水溶性の欠如は、臨床試験でその進行を妨げています。 最近、Karve ら。改善された水ゾルを示し脂質-ポリマーNPアセンブリ19として処方さWtmnのubility。大幅NP製剤として改善された、制御された送達のこのタイプから利益を得ることができる一方、アリ...

生きた細胞を（少なくとも1つの次元での材料≤100nm）のナノ材料をインターフェースの登場以来、継続的な目標は、種々の用途のためのナノ粒子（NPS）のユニークなサイズ依存特性を活用することでした。これらのアプリケーションは、細胞および組織の標識/イメージング（in vitroおよびin vivoの両方）、リアルタイム検知、および薬物および他の貨物1の制御された送達が含まれます。このような関連NP特性の例としては、半導体ナノ結晶のサイズに依存放出（量子ドット、量子ドット）が含まれます。金ナノ粒子の光熱特性。リポソームの水性コアの大積載能力;このような単層カーボンナノチューブおよびグラフェン等の炭素同素体のバリスティック伝導。 最近では、かなりの関心は、このようなコントラスト/イメージングAとして、薬物および他の貨物の制御された変調のためのNPの使用中に生じました紳士。ここでは、理論的根拠は大幅に/強化NP製剤としてそれを提供することにより、薬物貨物の全体的な溶解性、送達用量、循環時間、および最終的なクリアランスを最適化することです。これは、NP-媒介薬物送達（NMDD）として知られるようになってきた、と様々な癌および臨床試験の様々な段階でより多くの何百を治療する診療所で使用するための7のFDA承認NPの薬物製剤は、現在存在します。本質的には、目標は「より少ないリソースでより多くを達成; &quot;することですそれは、大きな表面積を利用して、より少ない投薬投与でより多くの薬物を送達するための足場としてNPを使用することである：NPの量（例えば、量子ドットと金属酸化物として、例えば 、硬質粒子）またはロードするためのそれらの大きな内部容積大型貨物ペイロード（ 例えば 、リポソームまたはミセル）。ここでの目的は、水安定性及び向上した循環を促進すると同時に、特に、複数の全身送達の投薬計画の必要性を低減することです非常に効果的ながら、水性媒体に難溶性である、挑戦的な疎水性薬物の貨物。 したがって、本明細書に記載の研究の目的は、親油性の形質膜二重層の疎水性の貨物の特異的かつ制御された送達のための新規NP足場を使用しての生存率を決定することでした。仕事のための動機は、水性媒体から細胞への疎水性分子の送達に固有の限られた溶解性と難しさでした。典型的には、このような疎水性分子の送達は、内部負荷が限られていることができ、有毒で妥協細胞および組織の生存率2、またはミセル担体とすることができる有機溶媒（ 例えば 、DMSO）または両親媒性の界面活性剤（ 例えば 、ポロキサマー）の使用を必要とします容量。ここで選択されたNP担体は、新規な液晶NP（LCNP）製剤3以前に開発され、それは〜40倍を達成するために、以前に示されていました<html>培養細胞4における抗癌剤ドキソルビシンの有効性の改善。 本明細書中に記載の研究では、選択された代表貨物は電位差膜色素、3,3&#39;- dioctadecyloxacarbocyanine過塩素酸（DIO）でした。 DIOは、生きて固定ニューロン膜電位測定における順行性および逆行性トレースに使用されている水不溶性の色素であり、一般的な膜のための標識5、6、7、8、9。 、その疎水性の性質のために、DIOは、典型的には、結晶形10で細胞単層または組織に直接添加されていますが、非常に高濃度でインキュベートします 濃度原液11、12から希釈した後（〜1〜20μM）。 コンテンツ「LCNPプラットフォームへ&gt;ここで、アプローチがあった使用は、DIO。DIOのための送達媒体として、その内部コア完全に疎水性であり、その表面が同時に親水性およびバイオコンジュゲーションに適している多機能NPは、合成中LCNPコアに組み込まれています、およびNP表面は、次いで、形質膜へのDIO-LCNPアンサンブルの膜結合を促進するためにペグ化コレステロール部分で官能化されている。このアプローチは、より忠実度と膜滞留して原形質膜にDIOに分配送達システムをもたらしDIOの遊離形態は、バルク溶液から送達より時間（DIO フリー ）。さらに、この方法は、DIOのLCNP媒介送達は、実質的に変調して、親油性の細胞膜二重層に色素の具体的な分割の割合を駆動することを示した。これは同時にLCNP製剤としてそれを提供することにより、40％〜によって遊離薬物の細胞毒性を低減しながら達成しました。

<table><tbody><tr><td>1-エチル-3-(3-(ジメチルアミノ)-プロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDCA)</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーE2247</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-ジオクタデシロキサカルボシアニン過塩素酸塩(DiO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4292-20MG</td><td>危険;DMSO</td></tr><tr><td>コレステロールポリ(エチレングリコール)アミン塩酸塩</td>に原液を作る <td>ナノクス株式会社</td><td>PG2-AMCS-2k</td><td></td></tr><tr><td>Countess 自動セルカウンター</td><td>ThermoFisher</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>ジオクタデシル-3,3,3&prime;&#8288;,3&prime;-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩 (DiI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495-100MG</td><td>危険; DMSO</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>21063045</td><td>Warm in 37 &deg;Cは</td></tr><tr><td>、Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14040182</td><td>37°Cで温まる前に、C 使用前のC</td></tr><tr><td>動的光散乱装置</td><td>ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin Bovine Protein, Plasma</td><td>ThermoFisher</td><td>33010018</td><td>DPBSを使用してストック溶液1 mg / mlを作成します。20-30 &microを使用します。MetTek皿のコーティング用g / ml、37°Cで2時間。C</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド (16%, W/V)</td><td>ThermoFisher</td><td>28906</td><td>Hazardous; dilute to 4% using DPBS</td></tr><tr><td>Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17)</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC&reg;CRL-11268&貿易;</td><td></td></tr><tr><td>ライブセルイメージングソリューション(LCIS)</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td>Warm in 37 >C 使用前に</td></tr><tr><td>MatTek 14 mm # 1.0 カバーガラス インサート 細胞培養皿</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr>25 mM HEPES <td>ThermoFisher</td><td>21063045</td> 37 °C を含む<td>Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Warm in 37 &deg;使用前のC</td></tr><tr><td>N-ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩(NHSS)</td><td>ThermoFisher</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1siスペクトル共焦点顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td>は<td>、細胞をカウントする前に細胞懸濁液に50%として混合</td></tr>します <tr><td>ゼータ電位計器</td><td>ゼータサイザーナノシリーズ (Malvern Instruments Ltd.、ウスターシャー、英国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超音波プロセッサ</td><td>Sonics and Materials Inc</td><td>GEX 600-5</td><td></td></tr><tr><td>ミニCetntrifuge</td><td>Benchmark</td><td>Mini-fuge-04477</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Sephadex&trade;G-25 Medium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc XRS イメージングシステム</td><td>Bio-RAD</td><td>76S/07434</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)、フェノールレッド</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

細胞への薬物/造影剤の制御送達は、治療薬の開発のためおよび細胞シグナル伝達プロセスの研究のために重要です。最近では、ナノ粒子（NPS）は、送達システムの開発にかなりの有望性を示しています。ここでは、液晶NP（LCNP）ベースの送達システムは、プラズマの疎水性領域にNPコア内で、水不溶性の染料、3,3&#39;- dioctadecyloxacarbocyanine過塩素酸（DIO）の制御送達のために使用されています膜二重層。複数の分光分析によって確認されるようにNPの合成中に、染料を効率的に、疎水性LCNPコアに組み込まれました。 NP表面にPEG化コレステロール誘導体の結合（DIO-LCNP-PEG-Cholでは）HEK 293T / 17細胞における形質膜に色素を負荷したNPの結合を可能にしました。時間分解レーザー走査型共焦点顕微鏡および蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）画像化は、パスを確認しましたLCNPコアと形質膜二重層中への挿入のDIOの流出をアイブ。最後に、LCNP-PEG-CholのようDIOの送達は、DIOの細胞毒性を弱毒化; DIOのNPの形は自由バルク溶液から配信DIOに比べ〜30から40パーセント低い毒性を示しました。このアプローチは、疎水性分子カーゴの膜特異的送達および変調のための効率的な様式としてLCNPプラットフォームの有用性を示します。

LCNPsは、NPの疎水性コアは、疎水性の貨物のための効率的な送達媒体としてLCNPの有用性を実証するための代表的な膜標識プローブを用いてロードされた中で調製しました。この目的のために、選択された貨物は、高度に水不溶性の電位差膜標識色素、DIOました。 図 1~18に示すように、DIO-ロードLCNPs（DIO-LCNPs）は、化学成分DACTP11、AC10COONa、およびDIOを有する二相ミニエマルジョン法を用いて合成しました。このNPシステムでは、結晶性の架橋剤DACTP11の共有結合した高分子ネットワークは、DIOが架橋ネットワーク内の隙間空間内に存在する安定した疎水性コアを提供します。また、細胞標的リガンドの結合のための官能基として、「ハンドル」を提供している間、NP表面上のカルボキシレート基は、水性媒体中の粒子のコロイド安定性を提供します（および他の生物製剤）。原形質膜へのDIO-LCNPsをテザーに、アミン末端PEG化コレステロール部分（PEG-Cholでは）共有EDCカップリング（ 図<...

液晶ナノ粒子（LCNP）ナノキャリアは、生細胞の原形質膜に疎水性の貨物の制御送達のためのビヒクルとして利用されます。

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

本実験手順の全体的な目的は、液晶ベースのナノ粒子をデリバリープラットフォームとして用い、疎水性カーゴを生きた哺乳類細胞の細胞膜の親油性部分へ制御して届けることです。この手法は、水溶性の低い疎水性カーゴの効率的なデリバリーおよび細胞内取り込みをどのように実現するかといった、ドラッグデリバリー分野における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、膜標的型の疎水性カーゴを細胞膜へより特異的にデリバリーでき、同時に細胞毒性を低減できる点にあります。本手順の実演は、私の研究室のポストドクターであるDr.Okhil Nagが行います。まず、テキストプロトコルに記載されている通りにDiO液晶ナノ粒子の調製から開始してください。次に、HEPESバッファー中のDiO液晶ナノ粒子1.0 milliletersに、調製したばかりのNHSS/EDCワーキングソリューションを20 microliters添加します。5分間撹拌します。次に、コレステロールPEGアミンのストック溶液20 µLをこの混合液に加え、2時間撹拌します。2時間後、卓上ミニ遠心機を用いて、反応混合液を最大速度で30秒間、短時間遠心分離します。次に、上清をDulbecco'sリン酸緩衝生理食塩水で平衡化したPD 10サイズ排除クロマトグラフィーカラムに通します。ゲル電気泳動によって、DiO液晶ナノ粒子表面へのPEGコレステロールの共有結合的な接合が成功したことを確認するため、テキストプロトコルに従ってアガロースゲルを調製します。ゲルが凝固したら、チャンバー内でゲルが浸るのに十分な量のTBE泳動緩衝液を加えます。次に、ゲルのウェルにDiO液晶ナノ粒子サンプルを35 µL加え、110 Vの電圧で20分間電気泳動を行います。励起フィルターを488 nm、蛍光フィルターを500〜550 nmに設定したゲルイメージングシステムを用いて、ゲルの画像を撮影します。14 mmのNo.1カバーガラスインサートを装着した直径35 mmの組織培養ディッシュを用意し、DPBSを用いて牛フィブロネクチンで37 °Cで2時間コーティングします。2時間後、培養皿からフィブロネクチンコーティング溶液を除去します。T25フラスコからHEK 293 T17細胞を回収するため、まず細胞単層を3 mLのDPBSで洗浄し、次に2 mLのtrypsin EDTAを加えます。フラスコを37 °Cで約3分間インキュベートします。細胞がフラスコから剥離したら、4 mLの完全培地をフラスコに加えてトリプシンを中和します。細胞カウンターを用いて懸濁液中の細胞濃度を測定します。その後、増殖培地を用いて細胞濃度を約80,000 cells/mLに調整します。細胞懸濁液を3 mLディッシュに加え、インキュベーターで一晩培養します。翌日、細胞はほぼ70%のコンフルエンシーに達し、使用可能な状態になります。高い割合の細胞を確実かつ効率的に標識するためには、適切な細胞密度が極めて重要です。対応するストック溶液を希釈し、デリバリー培地を用いてDiO、DiO液晶ナノ粒子、およびDiO液晶ナノ粒子PEGコレステロールの溶液をそれぞれ1 mLずつ調製する。セロファンピペットを用いて培養皿から増殖培地を除去し、細胞単層をHEPES DMEMで2回洗浄する。洗浄は、ピペットを使用してHEPES DMEMを皿の端に緩やかに加え、その後除去することで行う。調製したDiOフリー溶液またはDiO液晶ナノ粒子デリバリー溶液を0.2 milliliters、培養皿の中央に添加します。その後、適切な時間、培養皿をインキュベーターに戻します。インキュベーション時間が長すぎると、非膜領域への非特異的な細胞標識が起こります。インキュベーション後、セロロジカルピペットを用いてデリバリー溶液を除去します。DPBSを1回あたり2 mL使用し、細胞単層を2回洗浄します。4%パラホルムアルデヒドを用い、室温で15分間細胞単層を固定します。ピペットを用いてパラホルムアルデヒド溶液を除去し、2 mLのDPBSで細胞を1回静かに洗浄します。これで、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、膜上の蛍光シグナルの有無をイメージングする準備が整いました。加熱インキュベーションチャンバーを備えた顕微鏡ステージ上で、共焦点顕微鏡を用いて生細胞サンプルのイメージングを行い、膜の標識状態を評価します。直ちにイメージングを行わない場合は、培地を0.05%アジ化ナトリウム含有DPBSに置換し、ディッシュを4°Cで保存します。本手法では、FRETドナーとしてDiOを、FRETアクセプターとしてDiIを細胞に共ラベルします。前述と同様に、まずDiO液晶ナノ粒子PEGコレステロールで細胞をラベルし、続いてDiIフリーでラベルします。染色後、セロロジカルピペットを用いて2 mLのDPBSで細胞を1回洗浄し、2 mLの生細胞イメージング溶液に置換します。加熱インキュベーションチャンバーを備えた顕微鏡ステージ上で、FRETイメージングが可能な共焦点顕微鏡を用いて生細胞サンプルの画像を撮影します。DiOドナーを488 nmで励起し、32チャンネルのスペクトル検出器を用いて490 nmから700 nmまでのDiOドナーとDiIアクセプターの両方の全放出スペクトルを収集するように設定し、4時間にわたって30分間隔で実験を行います。次に、DiO液晶ナノ粒子PEGコレステロールおよびDiIで染色した細胞から、DiOドナーとDiIアクセプターの両方の時間分解放出強度を測定します。最後に、テキストプロトコルに記載されている通り、画像の時間分解アクセプター・ドナーFRET比を算出します。遊離のDiOは、2種類のラベルを付加した膜リン脂質で対比染色された細胞の細胞膜ではなく、細胞内部に非特異的に蓄積します。これはマージ画像で視覚化できます。逆に、DiO液晶ナノ粒子PEGコレステロールは、二重標識された膜リン脂質との共局在によって視覚化されるように、細胞の細胞膜のみを特異的に標識します。FRETでは、DiOドナーからDiIアクセプターへのエネルギー転移の増加が観察されることで、液晶ナノ粒子から膜脂質二重層へのDiOの分配が確認されます。DiOとDiIの間のFRET、およびDiOとDiIの放出光の変化により、時間の経過に伴いDiOからDiIへのFRETが増加することが確認されました。DiO液晶ナノ粒子PEGコレステロールナノ粒子は、生存率90%と最小限の細胞毒性を示しましたが、遊離のDiOでは生存率約50%と著しい毒性が認められました。このビデオを視聴することで、カーゴを封入した液晶ナノ粒子の合成方法、細胞標的化のためのバイオ機能化、および細胞へのデリバリー成功を確認するためのカーゴ封入細胞のイメージング方法について、十分に理解できるはずです。一般的に、この手法に不慣れな方は、水溶液から細胞膜へDiOを特異的に届けることが大きな課題となるため、苦労することがあります。私たちはまず、抗がん剤ドキソルビシンを細胞内に届けるために液晶ナノ粒子プラットフォームを使用し、それが薬物の細胞内取り込みキネティクスを調節できることを確認したことで、この手法を着想しました。本手順に従うことで、水媒体から細胞への輸送において特に困難を伴う、幅広い疎水性カーゴの細胞内デリバリーにこのアプローチを適用することが可能です。この手法を用いることで、脳イメージング用の電位感受性色素や光力学治療用の光力学薬など、膜標的薬および生物活性分子をより効率的に届けることが可能になります。

targeted-plasma-membrane-delivery-hydrophobic-cargo-encapsulated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

細胞の急速な機械的な変形は高分子およびナノ物質の細胞内送達のための有望な、ベクトルフリー法として浮上している。このプロトコルは、幅広いアプリケーションのためのシステムを使用する方法の詳細な手順を提供しています。...

堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

&gt;jove_content&lt;この研究では、生体適合性ナノ粒子の超小さな集団を合成する方法と、それらの細胞相互作用を評価するためのいくつかのin vitro方法が説明されました。...

細胞内ターゲティングアプリケーションのための固体脂質ナノ粒子（SLNs）

ナノ構造脂質担体（NLC）を合成するための最も一般的に使用される方法は、水中油型エマルジョン、均質化および凝固を含みます。これは、ダカルバジンの送達のための潜在的な担体として薬物封入および薬物積載効率を改善し、望ましいサイズのNLCを達成するために、固化した後、高剪断分散液を塗布することによりここに変更されました。...

ナノ構造脂質キャリアを使用した癌治療剤ダカルバジンのカプセル化

このプロトコルの目標は、神経標的ペプチドを持つカチオン性/アニオン性リポソームをCNS送達システムとして使用し、siRNAがBBBを通過することを可能にすることです。 siRNAのような治療のための送達システムの最適化は、プリオンや他の神経変性疾患に対するより多くの治療選択肢を可能にするでしょう。...

カチオン性およびアニオン性リポソームを用いてCNSへの治療用のsiRNAの送達

ナノ粒子は、適応症の広い範囲のための薬物送達システムを有望として浮上しています。ここでは、リバースエンジニアリングカイコの絹を使用して、絹のナノ粒子を製造するためのシンプルで強力な方法を記載します。これらの絹ナノ粒子は容易に治療的ペイロードとロードされ、その後、薬物送達用途のために探索することができます。...

シルクナノ粒子の製造および薬物送達アプリケーション

ナノ材料基礎科学と並進アプリケーション制御治療薬デリバリーの汎用性の高いメカニズムを提供するが、頻繁に彼らの作製最も生物医学研究所で利用されていない専門知識が必要があります。ここでは、スケーラブルな製造およびフラッシュ nanoprecipitation を使用して多様な片岡の治療読み込み用のプロトコルを提案する.

高速でスケーラブルなアセンブリおよびフラッシュ Nanoprecipitation を介して多様な合成ナノキャリアへ生理活性タンパク質や生理の読み込み

ここでカチオン性 nanoliposomes、ドライ フィルム法に基づいており、安全のため使用することができますの生成のためのプロトコルについて述べるし、体外の効率的な配信は、メッセンジャー RNA...

体外の効率的な配信のカチオン性 Nanoliposomes の生成は、メッセンジャー RNA を転写

この資料では、脂質被覆 74 nm ナノ粒子の falcarindiol...

ヒト間葉系幹細胞によって Falcarindiol を含む新しい脂質被覆ナノ粒子の取り込み

中立的の物理化学的性質および生理活性を調製および特徴付ける方法は、pH 応答性 siRNA ナノ粒子が提示される。サイズ、形態、表面電荷、siRNA ローディング、および遺伝子サイレンシングなどの siRNA...

細胞質 siRNA 送達のための、中立的充電された pH 応答性高分子ナノ粒子の調製

本研究では、ナノリポソーム調製の薄い脂質膜法を用いた古典的な水和を説明し、続いてナノ粒子の特性を説明する。47...

生体活性親水性球状タンパク質の捕捉に対するナノリポソームの調製と特性解析

脂質ナノ粒子は、mRNAおよびDNAカプセル化のためのマイクロ流体混合プラットフォームアプローチを用いて開発される。...

マイクロ流体混合プラットフォームを用いた遺伝子導入のための脂質ナノ粒子の作製と特性化

学ぶ液晶ナノ粒子を用いた疎水性貨物の標的細胞膜配達法。DiOナノ粒子調製とPEGコレステロール修飾により、哺乳類細胞への効率的な取り込みと低細胞毒性を実現する革新的なドラッグデリバリー技術です。

液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達

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