液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達

この実験手順の全体的な目標は、生きた哺乳類細胞の原形質膜の親油性部分への疎水性ジカーゴの制御送達のための送達プラットフォームとして液晶ベースのナノ粒子を使用することです。この方法は、難水溶性疎水性カーゴの送達と細胞内取り込みを効率的に可能にする方法など、ドラッグデリバリー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、膜を標的とした疎水性カーゴを原形質膜により特異的に送達し、細胞毒性を低下させ

その手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるOkhil Nag博士です。この手順は、テキストプロトコルに記載されているDiO液晶ナノ粒子の調製から開始します。次に、新たに調製したNHSS/EDCの作業溶液20マイクロリットルを、HEPES緩衝液中のDiO液晶ナノ粒子1.0ミリリットルに加えます。

そして5分間かき混ぜます。次に、この混合物にコレステロールPEGアミンのストック溶液20マイクロレターを加え、2時間攪拌します。2時間後、卓上型ミニ遠心分離機を使用して、反応混合物を最高速度で30秒間短時間遠心分離します。

次に、上清をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水で平衡化したPD 10サイズ排除クロマトグラフィーカラムに通します。ゲル電気泳動によるDiO液晶ナノ粒子表面へのPEGコレステロールの共有結合の成功を確認するには、テキストプロトコルに記載されているようにアガロースゲルを調製します。ゲルが固まったら、十分なTBEランニングバッファーを加えて、ゲルをチャンバーに沈めます。

次に、35マイクロレターのDiO液晶ナノ粒子サンプルをゲルのウェルに加え、110ボルトの電圧で20分間泳動します。488ナノメートルの励起フィルターと500〜550ナノメートルの発光フィルターを備えたゲルイメージングシステムを使用して、ゲルをイメージングします。直径35mmの組織培養皿に14mmのナンバーワンカバーガラスインサートを装着し、ウシフィブロネクチンをDPBSで37°Cで2時間コーティングして調製します。

2時間後、フィブロネクチンコーティング溶液を培養皿から取り出します。T25フラスコからHEK 293 T17細胞を採取するには、まず細胞単層を3ミリリットルのDPBSで洗浄し、次に2ミリリットルのトリプシンEDTAを添加します。フラスコを摂氏37度で約3分間インキュベートします。

細胞がフラスコから分離されたら、フラスコに4ミリリットルの完全な培地を追加してトリプシンを中和します。懸濁液中の細胞濃度は、セルカウンターでカウントして測定します。次に、細胞濃度を成長培地でミリリットルあたり約80, 000細胞に調整します。

3ミリリットルの細胞懸濁液を皿に加え、インキュベーターで一晩培養します。翌日、細胞は約70%の密度に達し、使用できる状態になっているはずです。適切な細胞密度は、高い割合の細胞を堅牢かつ効率的に標識するために重要です。

DiO、DiO液晶ナノ粒子、およびDiO液晶ナノ粒子PEGコレステロールの1ミリリットル溶液を送達媒体に調製し、対応するストック溶液を希釈します。血清学的ピペットを使用して培養皿から増殖培地を取り出し、HEPES DMEMで細胞単層を2回洗浄します。ピペットを使用してHEPES DMEMを皿の端にそっと追加し、取り外して洗浄を行います。

調製したDiOフリーまたはDiO液晶ナノ粒子送達溶液0.2ミリリットルを培養皿の中央に加えます。その後、皿を適切な時間インキュベーターに戻します。インキュベーション時間が長いほど、非膜性領域の非特異的な細胞標識がもたらされます。

インキュベーション期間後、血清ピペットを使用して送達溶液を取り出します。細胞単層をDPBSで2回洗浄し、各洗浄に2ミリリットルを使用します。4%パラホルムアルデヒドを使用して、室温で15分間細胞単分子膜を固定します。

パラホルムアルデヒド溶液をピペットで除去し、細胞を2ミリリットルのDPBSで1回穏やかに洗浄します。これで、固定された細胞を、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して、膜性蛍光シグナルの存在についてイメージングする準備が整いました。加熱されたインキュベーションチャンバーを備えた顕微鏡ステージで、共焦点顕微鏡を使用して生細胞サンプルをイメージングし、メンブレン標識を評価します。

イメージングがすぐに行われない場合は、培地を0.05%のアジ化ナトリウムを含むDPBSと交換し、皿を摂氏4度で保存します。この方法では、細胞をFRETドナーとしてDiOと、FRETアクセプターとしてDiIと共標識します。ラベルは、DiO、液晶、ナノ粒子、PEG、コレステロール、および以前と同様にDiIフリーで順次販売しています。

染色後、血清学的ピペットを使用して細胞を2ミリリットルのDPBSで1回洗浄し、2ミリリットルの生細胞イメージング溶液と交換します。加熱されたインキュベーションチャンバーを備えた顕微鏡ステージで、FRETイメージングを備えた共焦点顕微鏡を使用して生細胞サンプルをイメージングします。488ナノメートルでDiOドナーを励起し、32チャンネルスペクトル検出器を使用して490〜700ナノメートルのDiOドナーとDiIアクセプターの両方の全発光スペクトルを収集することにより、4時間にわたって30分間隔で実験を構成します。

次に、DiO、液晶、ナノ粒子、PEG、コレステロール、およびDiIで染色した細胞からのDiOドナーとDiIアクセプターの両方の時間分解放出強度を決定します。最後に、テキストプロトコルで説明されているように、画像の時間分解アクセプタードナーFRET比率を計算します。遊離DiOは、二標識膜リン脂質で対比染色された細胞の原形質膜ではなく、細胞内部に非特異的に蓄積します。

これは、結合された画像で視覚化できます。逆に、DiO液晶ナノ粒子PEGコレステロールは、二標識膜リン脂質との共局在化によって視覚化されるように、細胞の原形質膜のみを特異的に標識します。FRETは、DiOドナーからDiIアクセプターへのエネルギー移動の観察された増加を通じて、液晶ナノ粒子から膜脂質二重層へのジオパーティショニングを確認します。

DiOとDiIの間のFRETは、DiOとDiIの発光変化と同様に、時間の関数としてDiOからDiIへのFRETの増加を確認します。DiO液晶ナノ粒子PEGコレステロールナノ粒子は、遊離DiOの生存率が約50%であるのに対し、生存率は90%と最小限の細胞毒性を示します。このビデオを見れば、カーゴロードされた液晶ナノ粒子を合成し、細胞ターゲティングのために生体官能化し、カーゴロードされた細胞をイメージングして細胞送達を成功させる方法について、十分に理解できるはずです。

一般に、この方法に不慣れな人は、水溶液から原形質膜へのDiOの特異的な送達が大きな課題であるため、苦労するでしょう。この方法のアイデアを思いついたのは、液晶ナノ粒子プラットフォームを抗がん剤ドキソルビシンの細胞送達に使用し、その細胞内吸収速度を調節する能力を確認した後でした。この手順に従うと、このアプローチは、水性培地からの細胞への送達に関して特定の課題となる広範囲の疎水性カーゴの細胞送達に実装できます。

このアプローチは、脳イメージング用の電位感受性色素やフォトニック支援薬物療法用の光線力学薬など、膜標的薬や生理活性分子のより効率的な送達を達成するために利用できます。