Name: アン ex vivoでメソッド培養ラット腸間膜微小血管ネットワークのタイムラプスイメージングのための (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 学ぶラット腸間膜培養モデルを用いた微小血管ネットワークのタイムラプスイメージング手法。生体内環境で血管新生における内皮細胞相互作用や抗血管新生薬の効果を評価し、血管生物学の治療戦略に貢献します。

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この作業は、国立衛生研究所のWLMおよびTulane Center for Agingへの助成金5-P20GM103629によって支援されました。プロトコルテキストの編集にご協力いただいたMatthew Niceに感謝いたします。

全ての動物実験および手順は、チューレーン大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。 1.外科プロシージャを設定<ol><li>手術前にオートクレーブ機器、手術用消耗品、および文化用品。各ラットに対する外科用品が含まれます：1ドレープ、プレカット穴に1ドレープを（0.5インチ×1.5で）中央に、ガーゼパッド、および1吸収性アンダーパッド。手術器具が含まれます：数10ブレードで1メス、ピンセットの2ペア、および微細なハサミを。文化用品が含まれます：1ドレープ、ピンセットの1組、およびポリカーボネートフィルターで6ウェルプレートのインサートを用意しています。 </li><li>プレキシガラスのプラットフォーム、外科的なステージと70％エタノールで手術用卓上スペースを滅菌します。使用するまで無菌ボウルに外科的ステージを保管してください。 <ol><li> 100ミリメートル培養皿の中央に穴中1により約2で穿孔することによって、外科的ステージを作成します。次に、滑らかにするためにサンドペーパーを使用任意のシャープなエッジとは、組織のための隆起表面を作成するために、穴のエッジにシリコーン接着剤の層を追加します。 </li><li>代替的に、CADソフトウェアを使用して外科的ステージを設計し、3-D印刷（ 図1）によって行います。 </li></ol></li><li>ダウン滅菌吸収性アンダーパッドを配置し、その上にプレキシガラスのプラットフォームを築きます。吸収性アンダーパッドの隣に加熱パッド上で、プレカット穴なしで、ドレープを配置します。 </li><li>前加温滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、37°C​​にメディアおよび生理食塩水。独立した培養皿に入れメディアとPBS加熱パッドの上、手術のセットアップの隣に50 mLのコニカルチューブに生理食塩水を配置します。 </li><li>すべてのパッケージは、すべての材料の滅菌処理を確実にするために、手術の開始に先立って開かれていることを確認します。この手順で使用する一般的なツールの完全なリストは、に記載されています 具体的な外科材料とツールの表 。 </li></ol> 2. MesenterY組織の収穫<ol><li>使用大人の雄Wistarラット（350±25グラム; 6 - 8週齢）。他の株およびラットの年齢を置換することができます。 </li><li>ケタミン（80 mg / kg体重）およびキシラジン（8 mg / kg体重）の筋肉内注射によりラットを麻酔。ラットが反射反応を確認するために足の指の間につまんで麻酔下であることを確認。どれがあってはなりません。このターミナル手続きのための先制鎮痛は必要ありません。 </li><li>腹部を剃ると脱毛クリームを使用して残りの毛を取り除きます。ポビドンヨードに続く70％イソプロピルアルコールで二回腹部の皮膚を拭いてください。ワイプのために、外科医は、手術部位の中心に開始すべきであると以前に滅菌ガーゼまたは滅菌綿棒の同じ部分でスクラビングされた領域を重ならないように円形に準備されたエリアの外に移動します。その後、無菌手術用セットアップに動物を転送し、プレキシガラスプラットの上に置きます形。 </li><li>胸骨下の1を開始し、腸の切開で1.25 - メスの刃を使用して、0.75を作ります。腸や腸間膜（皮膚の1層、結合組織の1層、および筋肉の1層）を穿刺しないように注意してください。 </li><li>切開オーバープレカット穴とドレープを配置し、ドレープの上に無菌手術用のステージを配置します。開口部は切開部と整列することを確認してください。外科的ステージ開口部を通って回腸を見つけて引き出しを滅菌綿棒アプリケータを使用してください。 </li><li>綿棒アプリケーターを使用してステージを8腸間膜Windows、およびWindows（ 図1）には触れないように気をつけて- 6を引き出します。組織は、通常、盲腸の近く始まる小腸の回腸の領域から採取されます。ソリューションを滴下し、無菌注射器を使用して、必要に応じて加温した滅菌生理食塩水で湿った露出された組織を保管してください。 </li><li>ペントバルビタールナトリウム（ラット当たり0.2 mL）を心臓内注射を介してラットを安楽死させます。私を削除する前にsenteric窓は、ラットが心を触診によって安楽死させていることを確認します。何のパルスがあってはなりません。 </li><li>ウィンドウをカットする脂肪パッドと細かいハサミをつかむためにピンセットを使用することによって、所望の腸間膜組織を削除します。窓周りの脂肪（2ミリメートル）の境界線を残します。メディアで一度温めた滅菌PBSで一度組織を洗浄し。 </li><li>腹腔に体外回腸を戻し、施設のガイドラインに従って動物を処分。 </li></ol>タイムラプス研究3.腸間膜組織培養<ol><li>無菌層流フードへの転送オートクレーブ処理培養用品（1.1節を参照）や組織。 </li><li>ポリカーボネートフィルター膜の上に、各組織を転送するためにピンセットを使用してください。血管系の損傷を防ぐために、脂肪パッドによって組織をつかみます。 </li><li>迅速ウィンドウに触れないように注意しながら、脂肪パッドを使用して、組織を広げます。 6ウェルプレートの底部に組織とインサートを反転し、メディアの3ミリリットル（ 図1でカバー</st栄&gt;）。この手順のために使用される典型的な培地は、1％のペニシリンストレプトマイシン（PenStrep）及び10％ウシ胎児血清（FBS）を有する最小必須培地（MEM）を含みます。メディアは、血管新生を刺激する他の血清および/または成長因子を補充することができます。 </li><li>までの5日間、標準的なインキュベーター条件の各組織と文化のための3.3（5％CO 2、37℃） -繰り返して、3.2を繰り返します。 </li></ol>腸間膜組織の4タイムラプスイメージング<ol><li>イメージングの日に、共役BSIレクチンで各ウェルに培地を補充し、30分間の標準的な培養条件下でインキュベートします。レクチンを含まない培地で二回組織を洗ってください。 BSI-レクチン染色は、培養中の最大3日間腸間膜組織に表示されたままになります。 </li><li>顕微鏡ステージにプレートを転送します。その形態やネットワーク構造に基づいて、血液やリンパ管を識別します。 </li><li>各組織上の所望のネットワーク領域を見つけて、画像を撮影します。イメージングのメモを取ります同じ領域を確保するための場所が、後続のイメージのためにキャプチャされます。電動ステージを使用している場合、座標を文書化します。 </li><li>インキュベーターに組織を戻し、所望の最終地点まで培養を続けます。希望の実験の時点に応じて、必要に応じて4.3 - 繰り返し、4.1を繰り返します。 </li></ol> 5.組織免疫標識<ol><li> BSI-レクチンラベリング <ol><li>メディアを有する2つのすすぎに続いて培地中1：40 FITC結合レクチン（6ウェルプレート中のウェルあたり2.5 mLの抗体溶液）を用いて37℃で30分間組織をインキュベートします。リンスの場合は、メディアを追加した後、すぐに交換してください。 </li></ol></li><li> ライブ/デッドラベリング <ol><li> 1 37℃で10分間組織をインキュベート500 2mMのエチジウムホモダイマー1及び1：メディアを有する2つのすすぎに続いて、メディア500、1mMのカルセインAM（6ウェルプレート中のウェルあたり2.5 mLの抗体溶液）。 </li></ol></li><li> BSI-レクチン/ NG2ラベリング <ol><li>スライドし、顕微鏡での組織を広げますE（1から2の組織/スライド）と乾燥させます。脂肪を切除するためにしっかりと下に押して、メスで余分な脂肪を取り除きます。 </li><li> -20℃で30分間、冷メタノールで組織を修正しました。 PBS（3×10分）で組織を洗います。 </li><li> 100ウサギポリクローナルNG2抗体および5％正常ヤギ血清（NGS）：一次抗体の標識のために1を用いて室温で1時間、組織をインキュベートします。 PBS（3×10分）で組織を洗います。 </li><li> 100ヤギ抗ウサギCY2結合抗体（GAR-CY2）および5％NGS：二次抗体の標識のために1を用いて室温で1時間、組織をインキュベートします。 PBS（3×10分）で組織を洗います。 </li><li> PBSで2回リンスに続いて、PBS中の午前1時40分FITC結合レクチンを用いて室温で30分間、組織をインキュベートします。リンスのために、PBSを追加し、すぐに交換してください。 </li><li>スライドをマウントするには、上部の50:50 PBSで組織およびグリセロール溶液と場所のカバースリップをカバーしています。マニキュアを使用して、スライドの端をシールします。 </li></ol></li><li> LYVE-1 / PECAMラベリング<ol><li>顕微鏡スライド上の組織を広げて（1から2の組織/スライド）と乾燥させます。脂肪を切除するためにしっかりと下に押して、メスで余分な脂肪を取り除きます。 </li><li> -20℃で30分間、冷メタノールで組織を修正しました。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。 </li><li> 200マウスモノクローナルビオチン化CD31抗体と1：一次抗体の標識のために1ながら室温で1時間、組織をインキュベート100ウサギポリクローナルLYVE-1抗体をPBS + 0.1％サポニン+ 2％ウシ血清アルブミン（BSA）+ 5％NGS 。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。 </li><li>二次抗体の標識のために、1を用いて室温で1時間、組織をインキュベート：PBS + 0.1％サポニン+ 2％BSA + 5％NGSで100 GAR-CY2：500 Cy3結合ストレプトアビジン抗体および1。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。 </li><li> 50:50 PBSとグリセロール溶液でスライド、カバー組織をマウントして、上にカバースリップを配置します。マニキュアを使用して、スライドの端をシールします。 </li></ol></li><li> BrdU / BSI-レクチンラベリング <ol><li>メディアへの1mg / mLのBrdUのを追加し、BrdUの溶液で組織メディアを交換。 37℃で2時間インキュベートします。 </li><li>顕微鏡スライド上の組織を広げて（1から2の組織/スライド）と乾燥させます。脂肪を切除するためにしっかりと下に押して、メスで余分な脂肪を取り除きます。 </li><li> -20℃で30分間、冷メタノールで組織を修正しました。 PBS（3×10分）で組織を洗います。 </li><li> 37℃で1時間、2 M HCl中の組織DNAを変性させます。 PBS + 0.1％サポニン（3×10分）で組織を洗います。 </li><li> PBS + 0.1％サポニン+ 2％BSA + 5％NGSで100モノクローナルマウス抗BrdU：一次抗体の標識のために、1を用いて室温で1時間、組織をインキュベートします。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。 </li><li>二次抗体標識のために、1を室温で1時間、組織をインキュベート100ヤギ抗マウスCy3結合抗体をPBS + 0.1％サポニン+ 2％BSA + 5％NGS中（GAM-のCy3）を。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。 </li><li&gt;をPBSで2回リンスに続いてPBSで1：40 FITC結合レクチンを用いて室温で30分間、組織をインキュベートします。 </li><li>スライドをマウントするには、上部の50:50 PBSとグリセロールソリューションと場所カバースリップを有する組織をカバーしています。マニキュアを使用して、スライドの端をシールします。 </li></ol></li><li> BSI-レクチン/ CD11bのラベリング <ol><li>顕微鏡スライド上の組織を広げて（1から2の組織/スライド）と乾燥させます。脂肪を切除するためにしっかりと下に押して、メスで余分な脂肪を取り除きます。 </li><li> -20℃で30分間、冷メタノールで組織を修正しました。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。 </li><li> PBSで100マウス抗ラットのCD11b + 0.1％サポニン+ 2％BSA + 5％NGS：一次抗体の標識のために1を用いて室温で1時間、組織をインキュベートします。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。 </li><li>二次抗体の標識のために1を用いて室温で1時間、組織をインキュベート：PBS + 0.1％サポニン+ 2％BSA + 5％NGSで100 GAM-のCy3。 PBSで組織を洗います+ 0.1％サポニン（3×10分）。 </li><li> PBSで2回リンスに続いて、PBS中の午前1時40分FITC結合レクチンを用いて室温で30分間、組織をインキュベートします。 </li><li>スライドをマウントするには、上部の50:50 PBSとグリセロールソリューションと場所カバースリップを有する組織をカバーしています。マニキュアを使用して、スライドの端をシールします。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

このプロトコルは、微小血管ネットワークの成長のタイムラプスイメージングのためのex vivoでのツールとしてラットの腸間膜培養モデルを使用するための方法を提示します。我々の研究室での以前の研究は、1のための我々のモデル）、血管新生8、2）リンパ管8、3）周皮細胞-内皮細胞の相互作用8、および4）抗血管新生薬物検査9の使用を確立しています。複数の時点で培養したラットの腸間膜組織を画像化するための能力は、組織特異的成長応答及び様々な血管新生刺激時の細胞間相互作用の追跡を評価するための定量的アッセイを提供しています。血管新生中の内皮細胞の増殖増加および周皮細胞の存在は、私たちの前の仕事8と一致しており、培養ラット腸間膜組織における血管新生の間に複数の細胞型の間の動的相互作用を検証します。 <p c成長が完全な、実際の微小血管網内で発生するため、一般的に使用される組織培養モデルおよび...

微小血管ネットワークの成長とリモデリングは、組織機能のための共通の分母、創傷治癒、および複数の病状であり、重要なプロセスは、既存の1、2から新たな血管の成長として定義され、血管形成です。組織は新しい血管を設計するか、血管新生に基づく治療を設計するため、血管新生に関与する細胞のダイナミクスの重要性を理解することが重要です。しかしながら、この方法は複雑です。これは、微小血管ネットワーク内の特定の位置で変化し、複数の細胞型（ 例えば 、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、マクロファージ、幹細胞）と、複数のシステム（リンパ管ネットワーク及びニューラルネットワーク）を含むことができます。 in vitroモデルは、血管新生3に関与する異なるセル間の関係を調べることに大いに貢献してきたが、それらの生理学的関連性はtheiのために弱体化することができます<html>限られた複雑さと、彼らは密接にin vivoでのシナリオを反映していないという事実rを。これらの制限、三次元培養系3、 エクスビボ組織モデル4を克服するために、マイクロ流体システム5、6、および計算モデル7は、近年開発され導入されています。しかし、無傷の微小血管ネットワークエクスビボでの血管形成を調査するタイムラプス機能を持つモデルの必要性が依然として存在します。複雑さのレベルの血管新生研究のための新たなタイムラプスモデルの確立は、血管新生を調節する根底にあるメカニズムを理解し、治療法を改善するための貴重なツールを提供します。 無傷の微小血管ネットワークを介して血管新生のex vivoでの調査を可能にする潜在的なモデルは、ラット腸間膜培養モデルであります&gt; 8。最近の研究では、血液とリンパ微小血管ネットワークは培養後に生存し続けることが実証されています。さらに重要なことは、ラット腸間膜培養モデルは、機能的な周皮細胞 - 内皮細胞の相互作用、血液およびリンパ管内皮細胞コネクション、タイムラプス撮影を調査するために使用することができます。本稿の目的は、タイムラプスイメージング法のために私たちのプロトコルを提供することです。当社の代表的な結果は、血清と血管新生の刺激後に生き続けると組織特異的血管新生反応と同様に内皮細胞追跡研究を定量化するため、このメソッドの使用例を提供する複数の細胞型を文書化します。

<table><tbody><tr><td>ドレープカー</td><td>ディナルヘルス</td><td>4012</td><td>12 "x 12"Bio-Shieldの規則的な殺菌は</td></tr><tr><td>メスのハンドル</td>を包む <td>Robozの外科器具</td><td>RS-9843</td><td>メスのハンドル、#3;固体;4インチの長さ</td></tr><tr><td>の滅菌外科用ブレードシン</td><td>シナティサージカル</td><td>0110</td><td>ステンレス鋼。サイズ 10</td></tr><tr><td>培養皿 (60 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>130181</td><td>10/スリーブ</td></tr><tr><td>グレーフ鉗子 (湾曲ピンセット)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5135</td><td>マイクロ解剖鉗子;鋸歯 状;わずかなカーブ;0.8 mmの先端幅;4インチ長さ</td></tr><tr><td>のグレーフ鉗子(ストレートピンセット)</td><td>Roboz手術器具</td><td>RS-5130</td><td>マイクロ解剖鉗子;鋸歯状、ストレート;0.8 mmの先端幅;4 "長さ</td></tr><tr><td>Noyesマイクロはさみ</td><td>Roboz手術器具</td><td>RS-5677</td><td>Noyesマイクロ解剖スプリングはさみ; まっすぐでシャープな鈍いポイント。13mmカッティングエッジ;0.25 mm先端幅、4 1/2 "全長</td></tr><tr><td>ガーゼパッド</td><td>FisherBrand</td><td>13-761-52</td><td>非滅菌綿ガーゼスポンジ; 4 "x 4" 12プライ</td></tr><tr><td>綿Tippledアプリケーター</td><td>FisherBrand</td><td>23-400-124</td><td>6 "長さ;木製シャフト;シングルユースのみ</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-772-49</td><td>平底、低蒸発蓋付き。ポリスチレン;非発熱性</td></tr><tr><td>滅菌シリング 5 mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-829-45</td><td>ルアーロックチップ</td></tr><tr><td>滅菌ボウル</td><td>Medical Action Industries Inc.</td><td>01232</td><td>32オンスピールポーチ;青い;滅菌済みシングルユース</td></tr><tr><td>6ウェルプレートインサート(CellCrownインサート)</td><td>SIGMA</td><td>Z681792-3EA</td><td>6ウェルプレートインサート;非滅菌</td></tr><tr><td>ポリカーボネートフィルターメンブレン</td><td>SIGMA</td><td>TMTP04700</td><td>Isopore Membrane Filter;ポリカーボネート;親 水性;5.0;>&マイクロ;メートル、47&nbsp;mm、ホワイトプレーン</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント/説明</td></tr><tr><td>Beuthanasia</td><td>Schering-Plough Animal Health Corp. Union(MWI Veterinary Supplyから注文)</td><td>MWI #:011168</td><td>有効成分:100 mLあたり、390 mgのペントバルビタールナトリウム、50 mgのフェニトインナトリウム&nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Fort Dodge Animal Health (MWI Veterinary Supply から注文)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Kateset 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>LLOYD. Inc. (MWI Veterinary Supply から注文)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Anased 100 mg/mL</td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>Baxter</td><td>2F7122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>サポニン&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>S7900-100G</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>S25372</td><td></td></tr><tr><td>ポビドン-ヨウ素</td><td>オペランド</td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>シグマ</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>FITCコンジュゲートレクチン</td><td>SIGMA</td><td>L9381-2MG</td><td></td></tr><tr><td>抗NG2 コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体</td><td>SIGMA</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31) 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555026</td><td></td></tr><tr><td>LYVE-1抗体</td><td>AngioBio Co.</td><td>11-034</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギCy2標識抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-585-144</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスCy3標識抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-227-003</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジンCy3標識抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>生死生存率/細胞毒性キット</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>正常なヤギ血清&nbsp;</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5-ブロモ-2'-デオキシウリジン</td><td>SIGMA</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>モノクローナルマウス抗ブロモデオキシウリジン&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;クローンBu20a</td><td>Dako</td><td>M074401-8</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ラットCD11b&nbsp;</td><td>AbDセロテック</td><td>MCA275R</td><td></td></tr></tbody></table>

アン<em&gt; ex vivoで</em&gt;メソッド培養ラット腸間膜微小血管ネットワークのタイムラプスイメージングのための

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

血管新生は、既存の血管か​​らの新たな血管の成長として定義され、内皮細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、免疫細胞、及びリンパ管および神経との調整を含みます。マルチセル、マルチシステムの相互作用は、生理学的に関連する環境における血管形成の調査を必要とします。 in vitro細胞培養モデルの使用は、機械的な洞察を提供してきつつ、一般的な批判は、それらが微小血管ネットワークに関連する複雑さを再現しないことです。このプロトコルの目的は、培養ラット腸間膜組織における血管新生の刺激の前と後に無傷の微小血管ネットワークのタイムラプス比較を行う能力を実証することです。培養組織は、その階層を維持する微小血管ネットワークが含まれています。免疫組織化学的標識化は、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、血管およびリンパ管の存在を確認します。でdditionは、BSI-レクチンと組織を標識すると、増加した毛細血管の発芽と血管密度によって特徴づけられる血清または成長因子刺激の前と後に、ローカルネットワーク領域の経時比較を可能にします。一般的な細胞培養モデルと比較すると、この方法は、内皮細胞系統の研究および生理学的に関連する微小血管ネットワークにおける組織特異的血管新生薬物評価のためのツールを提供します。

培養3日後、組織を、ラット腸間膜培養モデル（ 図2A）で微小血管系の生存能力を実証するために生/死生存率/細胞毒性キットを用いて標識しました。腸間膜中に存在する細胞の大部分は、内皮細胞が微小血管セグメントにおけるそれらの位置に基づいて同定された培養物中で生存可能のままでした。内皮細胞増殖はまた、レクチン/ BrdU標識（ 図2D）により確認しました。血管に沿って平滑筋細胞および周皮細胞の存在は、NG2標識（ 図2B）で確認しました。 LYVE1とPECAMのための標識化は、リンパや血液の微小血管ネットワークを分岐同定し、血液内皮細胞表現型（ 図2C） 対維持リンパを確認しました。 このモデルのタイムラプス機能がmicrovaを標識することによって利用されましたBSI-レクチンとscularネットワーク...

血管新生は、生理学的に関連性のある環境で調査する必要があるマルチセル、マルチシステムの相互作用を含みます。この研究の目的は、ラット腸間膜培養モデルが血管新生中の無傷の微小血管ネットワークのタイムラプス比較を行う能力を実証することです。

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

本実験の全体的な目的は、ラット腸間膜培養モデルを用いて、寄生虫と内皮細胞の相互作用、血液・リンパ管内皮細胞の接続、または抗血管新生薬の効果を評価するための、ex vivoでの微小血管ネットワーク再構築のタイムラプス調査への活用を実証することである。この手法は、微小血管がどこに成長すべきかをどのように認識しているか、また内皮細胞セグメントの運命はどうなるかといった、微小血管再構築の分野における重要な疑問への回答に寄与することができる。本技術の主な利点は、ex vivoでの成長前後の実際の無傷な微小血管ネットワークをイメージングできる点にある。手順の実演は、本手法を開発した当研究室の大学院生、Sadegh Azimiが行います。まず、滅菌済みの吸収性アンダーパッドの上にエタノール滅菌したプレキシガラス製プラットフォームを置き、その上に麻酔をかけた成体雄ラットを配置します。ラットの除毛した腹部領域を70% isopropyl alcoholワイプ2枚で消毒し、続いてポビドンヨードで消毒します。胸骨の下1インチの地点から開始し、メスを用いて、皮膚、結合組織、および筋肉を貫通するように、腸管に3/4インチから1 1/4インチの切開を加えます。次に、あらかじめ穴が開けられたドレープを動物に被せ、その上に手術用ステージを設置します。この際、両方の開口部を切開部位と一致させるように注意してください。滅菌済みの綿棒を使用して、回腸を6〜8箇所の腸間膜窓とともに手術用ステージの開口部から引き出します。滅菌シリンジを使用して、必要に応じて37 °Cの滅菌生理食塩水を露出した組織に滴下します。すべてのウィンドウを体外に露出させた後、ピンセットで脂肪組織をつかみ、ハサミを用いて各腸間膜組織の周囲に2 mmの脂肪境界を残してウィンドウを採取します。ピンセットが腸間膜ウィンドウに触れないよう、周囲の脂肪境界のみをつかむように注意してください。各ウィンドウを、37 °CのPBSで1回、次いで採取しておいた37 °Cの培地で1回洗浄します。すべてのウィンドウを単離した後、回腸を腹腔内に戻します。滅菌済みラミナーフローフード内で、ピンセットを用いて各腸間膜組織を脂肪縁で保持し、細胞培養プレートインサートのポリカーボネートフィルターメンブレン上に転送します。ファットパッドを使用して組織サンプルを素早く広げ、ウィンドウに触れないように注意します。次に、インサートを反転させ、組織がウェルの底に平らに配置されるように6ウェルプレートの1つのウェルに入れます。組織を3 mmの培地で覆い、残りのウィンドウも同様の手順でプレートに移します。その後、腸間膜ウィンドウを標準的な組織培養インキュベーター条件下で最大5日間培養します。イメージング当日、培養液に標識BSIレクチンを添加し、プレートをインキュベーターに戻します。30分後、サンプルをレクチンの含まれていない培地で2回洗浄し、プレートを蛍光顕微鏡のステージに移します。形態およびネットワーク構造に基づいて、血管とリンパ管を識別します。次に、各組織で関心領域となるネットワーク部位を特定して画像を撮影し、以降の撮影で同じ領域が捉えられるよう、その位置を記録しておきます。すべての画像の取得が完了したら、次回の撮影セッションまたは適切な実験終了時まで、サンプルをインキュベーターに戻します。3日間の培養後、腸間膜に存在する細胞の大部分は生存しており、血管内皮細胞の存在はその微小血管セグメントにおける位置によって確認されます。内皮細胞の増殖はレクチン/BrdU標識によって確認でき、一方で血管沿いの平滑筋細胞および寄生虫の存在はNG2標識によって確認できます。分枝したリンパ管および血液微小血管ネットワークの標識により、培養組織におけるリンパ管細胞のフェノタイプが維持されていることがさらに確認されます。腸間膜ウィンドウ組織培養培地に10%血清を3日間添加すると、強力な血管新生反応が誘導され、刺激から5日後に新しい血管セグメントと毛細血管芽が確認されます。タイムラプスイメージングにより、組織1枚あたりの4倍画像から、血管領域あたりの血管数および毛細血管芽の数を定量化することが可能です。また、ネットワーク領域のタイムラプス比較により、内皮細胞セグメントの追跡や、血管およびリンパ管のパターニング異常の特定も可能になります。さらに、レクチンおよびCd11bによる標識により、リモデリングネットワーク内に間質性常在マクロファージが存在することがさらに確認されます。この手法を習得すれば、4時間以内に完了させることができるはずです。このビデオを視聴することで、ラット腸間膜組織の採取、培養、およびタイムラプスイメージングの方法について十分に理解できるでしょう。

an-ex-vivo-method-for-time-lapse-imaging-cultured-rat-mesenteric

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

微小循環の観察のための新たな汎用性の高い方法が提示される。それは長期的な観察のため、およびpharmacophysiologicalまたは分子生物学的介入との組み合わせに適して考えられている。...

イントラ不可欠な顕微鏡による骨格筋のin vivo微小循環測定における

生理的な血管新生とそれを欠いている正常な成体血管化哺乳動物の組織を研究するために使用される外科的介入にさらされていません：（i）の開始とテストエージェントの腹腔内投与後の血管新生の開発、との全身投与後の血管新生の（II）修正テストエージェントを選択した。...

ラット間膜の血管新生アッセイ

この資料では、ラット腸間膜血管新生を刺激するための単純なモデルを説明しています。モデルは、単一細胞レベル全体を微小血管網のEN面の可視化を可能に組織内の比較的短い時間の経過とともに毛細管発芽、血管領域と血管密度の劇的な増加を生成します。...

ラット腸間膜具象化：血管新生に関与する細胞のダイナミクスを調べるためのモデル

血管細胞機能は、細胞内メッセンジャーの活性に依存します。 ここで説明するのは、単離された大動脈の個々の内皮細胞および平滑筋細胞における生理学的および薬理学的刺激に応答した細胞内カルシウムおよび一酸化窒素レベルの測定を可能にするex vivo...

細胞内カルシウムの二光子イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;取扱い及び内皮における一酸化窒素産生および単離されたラット大動脈の平滑筋細胞

修正されたLandis技術は、微小灌流技術を用いた制御および試験条件下で、正常ラットと遺伝子組み換えラットの腸間膜における個々の微小血管の透水係数のペア測定を可能にします。これは、生理学的条件下で微小血管の透過性と経血管交換を調節するメカニズムを評価するための便利な方法を提供します。...

ラット腸間膜に微小血管透過性の調節を調査するために、微小灌流法

私たちは、麻酔をかけたマウスの生体内共焦点顕微鏡を使用して、定常状態および炎症条件下で腸間膜静脈の好中球と単球の挙動を監視するためのプロトコルを詳述しています。...

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

このプロトコルは細胞特異的蛍光マーカーを発現するトランスジェニック マウスの生体イメージングを説明します。生体イメージングは、プロセスの顕微可視化が可能な埋込型の windows...

腫瘍関連血管系を使用しての生体顕微鏡が背高度な蛍光トランスジェニック マウスの皮下脂肪のウィンドウの部屋

本稿では、ラット脳の抵抗血管での血管の機能を評価するためのビデオ顕微鏡検査のプロトコル体外について説明します。原稿もレーザー...

分離抵抗性ラットの動脈のビデオ顕微鏡を用いた血管制御機構の評価

ここでは、中隔動脈がカニュール化および加圧されるように、動脈灌流圧および流れを維持する動脈灌流圧および流れのex...

マウス心臓における毛細血管、細動脈、および周囲細胞の動的測定とイメージング

本プロトコールでは、顎下腺(SMG)の内皮バリア機能を、2光子レーザー走査顕微鏡下で in vivo...

インビボ マウス顎下腺における血管透過性検出

このプロトコルは、腸間膜虚血再灌流障害を誘発し、生体内顕微鏡を使用して腸間小静脈の好中球細胞外トラップ(NET)を視覚化する方法を提示します。上腸間膜動脈の血流を1時間制限し、その後再灌流を行ったため、白血球の接着とNETosisを直接定量化することができました。...

腸間膜虚血再灌流障害後の腸間小静脈における好中球細胞外トラップの生体内顕微鏡による可視化

学ぶラット腸間膜培養モデルを用いた微小血管ネットワークのタイムラプスイメージング手法。生体内環境で血管新生における内皮細胞相互作用や抗血管新生薬の効果を評価し、血管生物学の治療戦略に貢献します。

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