Name: 使用するグルコース代謝動態を決定します 18 F-FDGマイクロPET / CT (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 学ぼう 18F-FDGマイクロPET/CTを用いたマウスの組織別グルコース取り込み定量化法。動的イメージングと運動学的モデリングにより、糖尿病治療効果や代謝異常をリアルタイムで評価する技術を習得できます。

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この作業は、BJCへのNational Imaging Facility Subsidised Access Grant、KARおよびPJBに対するNational Health and Medical Research Council of Australiaプログラム助成金（482800）によって支援されました。著者は、この方法の開発を支援してくれたAndrew Arthur、Hasar Hazme、Marie-Claude Gregoireに感謝します。

すべてこの研究で説明する手順シドニー現地保健地区、シドニーの動物倫理委員会の大学によって承認され、 実験動物の管理と使用のための NIH ガイドに従った、第8版（2011年）。 1.動物の準備注：このプロトコル雄のdb / dbマウス（BKS.Cg- Dock7 M + / + Lepr のdb / J）で6週齢まで固形飼料および水を随意アクセスの群ハウジングに維持しました。撮影時には、マウスは〜30グラムの重量を量りました。このプロトコルで使用されるすべてのマウスは、10及び14ミリモル/ Lの空腹時血糖値ました。 <ol><li>必要な場合は、マウスを高速。本実施例では、実験手順の前に5時間マウスを絶食。 </li><li>撮像の開始前に所望の薬剤（ 例えば 、薬物、タンパク質、ペプチド）を有するマウスを治療します。この例では、インスリンの皮下注射を投与（3U / kgのヒトインスリン）又は等量のPBS 30分前に撮影を開始します。 </li></ol> 2.ワークフローを設定します注：このプロトコルは、PET / CTスキャナーに実装されました。 CTデータの取得に続いて、最初のPETデータを取得します。 <ol><li> PETの設定： <ol><li> 650 keVの（デフォルト）3.432 NS（デフォルト）の一致タイミングウィンドウで- 18 F、3,600秒に設定し、スキャン時間、及び350 keVのに上下のレベルのエネルギー弁別として同位体を選択します。トレーサー注入後60分 - 期間0 16のフレーム（6×10秒、4×60秒、1×300秒、5×600秒）にヒストグラムリストモードデータ。ズーム1.5で2D-FBPを用いてサイノグラム放射を再構成します。 注：再構成画像16の動的フレーム、128×128×159ボクセルと0.52×0.52×0.796ミリメートル3のボクセルサイズを有する各々から成っていました。 </li></ol></li><li> CTの設定： <ol><li>ために全身CTスキャン、500 A、50キロボルトの電圧、露光時間500ミリ秒と360回転にわたって200個の突起で電流を設定します。 （完全なPET視野範囲をカバーする）3にベッド位置の数、30722048に検出器の視野（FOV）を設定し、4にベッド= 30.234713%位置と検出器ビニング間で重複。 注：CT再構成は、HU較正、バイリニア補間とシェップ - ローガンフィルタとコーン・ビーム断層撮影画像再構成ソフトウエアを用いて行きました。 </li></ol></li><li> 18 F-FDG： <ol><li>十分な18 F-FDGを注文（例えば、0.5 mLの450 MBqの）ローカルプロバイダからは、最初の注射の前に約30分に到着します。動物は、0.1 mLの最終体積で18 F-FDGの約10 MBqのを受け取ることができるように、18 F-FDGをアリコートし、希釈します。 </li></ol></li></ol> 3.イメージングプロトコル<ol><li>無菌状態を維持するために、80％（v / v）のエタノールで誘導チャンバーおよびイメージングベッドを拭います。プラ誘導チャンバ内にマウスをCEおよび酸素中の5％イソフルランで麻酔。 </li><li> 1L / minの流量で - （2％メンテナンス、1.5）イソフルランを送達するために、体温を維持するために電気加熱パッド及び精度気化器のノーズコーンが取り付けられた撮影台上にマウスを置きます。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に眼軟膏を適用します。 </li><li>呼吸を監視し、麻酔の適切な面が維持されることを保証するために、センサパッド上に腹臥位にマウスを置き。 </li><li>外側尾静脈を拡張するために2分 - 1ための熱パックを使用して、尾を温めます。外側尾静脈に、30ゲージの針を挿入することにより、外側尾静脈にカテーテルを挿入。手術用接着剤で所定の位置に針を固定し、カテーテルを固定します。 </li><li>負荷イメージングは​​、スキャナにベッドとカテーテルが機械の後方からアクセスできるように、機械を介してベッドを移動させます。 </li><li> SYRでの18 F-FDGシリンジにカテーテルを取り付けインゲドライバー。注射して投与される体積（&lt;100μL、10秒かけて注入）の前にシリンジ内のアクティビティに基づいて、正確な18 F-FDGの用量（10 MBqの）を計算します。 </li><li>グルコース取り込みの変動に対する麻酔の影響を最小限に抑えるために、麻酔の誘導および（例えば、30分）、18 F-FDGの注射の間に一定の時間を確保します。 </li><li> PETは、18 F-FDGの注射の直前にスキャン開始。 PETスキャン（3600秒）を終えた後、組織と放射性トレーサー取り込みの共同登録を可能にするためにCTスキャン（〜10分）を行います。 </li><li>開始位置に撮影台を移動させる、床から動物を削除します。 </li><li>この時点で、動物を安楽死させるか、それが回復することができます： <ol><li>安楽死のために、麻酔下でまだながら頸椎脱臼を行い、その後の分析のための関心の臓器を収集します。 </li><li>マウスが回復することができた場合は、加熱パッドの上に単一のハウジング内にマウスを置きますか、加熱ランプの正面です。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでマウスを監視します。マウスは、グループハウジングに戻る前に1時間回復させます。 </li></ol></li></ol> 4. PET画像処理注：画像の再構成は、研究職場ソフトウェアv4.2の中で取得職場ソフトウェアv1.5.0.28と分析を用いて行きました。 <ol><li> CTとPET画像を同時登録及び位置合わせが全て3次元で正確であることを確認してください。 <ol><li> 「ファイル」メニューでは、「フォルダの検索/インポート」を選択し、データを格納しているフォルダを選択します。希望PETとCTデータを選択し、「一般分析」タブをクリックします。 </li><li>ソートCRは、「ソースのデータを指定されているようにPETを「ターゲット」を指定されています。 「ワークフロー」メニューでは、「登録」を選択します。画像が正しく共同登録する調整が必要な場合は、番目のツールを使用E「登録」メニュー。 </li></ol></li><li> 「ワークフロー」メニューでは、「ROI定量化」を選択します。 <ol><li>所望の領域の位置を特定するために「パン」と「画像」タブで「ズーム」機能を使用してください。 「ツール」メニューで、「作成」タブを選択し、絵筆のアイコンをクリックしてください。画像上にROIを描画</li></ol></li><li> 「保存」メニューから「保存ROI定量化」を選択することで、時間放射能曲線を抽出します。 CSVファイルとしてデータを保存します。 </li><li>組織の1cm 3当たりベクレルなどの放射能の取り込みを定量化します。 CSVは、スプレッドシートにファイルをロードすることにより、1cm 3当たりの注射用量率（％ID / cm 3）との比率に値を変換します。 </li></ol> 5.入力機能<ol><li>システムの点広がり関数を補正するために、以前に9に記載されているようreblurredヴァンCittertデコンボリューション法を用いて5回の反復の推定システムのPSFをデコンボリューション。 注：これが原因マウスにおけるヴェナ・キャバの小さなサイズに必要とされます。 </li><li>上述したように、血液入力関数の時間 - 活性曲線を生成するために、ポストデコンボリューション画像を使用します。 </li></ol> 6.キネティックモデル注：FDG二組織コンパートメントモデル（ 図1）血漿入力関数を必要とします。 <ol><li> Input_plasma = Input_blood×（ - 0.191トン + 1.165 0.386 E）：以下の式10を用いてプラズマ入力機能にCSVファイル内の血液入力関数を変換します。 </li><li>運動モデリングツールでは「キネティック」ボタンをクリックしてください。組織および血漿総活性は、「メニュー」から「ロード時間の活性曲線」を選択することで、運動モデリングツールにCSVファイルをインポート数えます。 </li><li> 「モデル」メニューでは2つの組織区画を選択します。 K4の隣のボックスが選択されていないことを確認してくださいそして、VB（血液体積分率）のためのチェックボックスをオフにし、2％の値を入力し、初期フィッティングについては0の値を入力します。 </li><li> 「フィット現在の領域]をクリックします。分散11、12の対象の抽出された領域を修正します。異なる分散時間のためのFDGモデルのカイ二乗値を最小化することによって、これを達成。 </li><li>地域の速度定数（k 1 -k 3）を計算するためにフローティングのVBの値（次のVBのためのボックスにチェックボックス）と最適化された分散値を用いて第2の適合を行います。 K iは =（K 1×K 3）/（K 2 + K 3）のような一定の地域の流入を計算します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで説明するプロトコルは、組織及びマウスにおける後続の代謝への血流からのグルコース取り込みの動態を決定するために、堅牢な非侵襲的方法を表します。 DB / dbマウスは、インスリン抵抗性と関連する介入を調べるために広く使用されている2型糖尿病14の十分に確立された動物モデルです。しかし、以前の研究では唯一の心15と心筋と骨格筋16にエンドポイントの取り込みを定量化しています。 生理学的速度定数を決定し、組織への血漿から18 F-FDGの取込みをモデル化するために動力学的分析の使用は、グルコースの取り込みおよび代謝における抗糖尿病治療の影響に洞察を可能にします。また、これらの実験は、例えば、評価するために縦方向にグルコース代謝の年齢や食生活の影響を行うことができます。これはアドバです関心の臓器の安楽死と収集が必要なので、単一の時点での情報を提供する従来の方法を超...

本研究の目的は、 インビボで 、マウスにおける特定の組織への血流からのグルコースのリアルタイム取り込みを定量化するために陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影法（PET / CT）ベースの方法を開発することでした。これは、細胞内の空間にプラズマから18 F-FDGの取り込みの速度を推定するために、細胞内空間からプラズマへの輸送の速度との速度のグルコース取り込みおよび動態モデリングを測定するための18 F標識フルオロデオキシグルコース（FDG）を使用して達成されました18 F-FDGのリン酸化。 げっ歯類では、18 F-FDGは、多くの癌治療1、腫瘍の進行2および腫瘍代謝3の研究だけでなく、褐色脂肪デポ4、神経炎症5と脳代謝6のイメージングの前臨床評価に使用されてきました</SUP&gt;。 マウス（およびラット）におけるグルコースの組織特異的取り込みを調べるために使用される伝統的な方法は、一般に各組織7における放射能の安楽死、組織収集および測定した3 Hまたは14 Cのいずれかと2-デオキシグルコースの放射性標識を用いた治療を含みます。 PET / CTの使用は、生きた動物で、同時に複数の臓器や地域におけるグルコース取り込みと代謝の非侵襲的な決意することができます。安楽死が必要条件ではないように、さらに、この技術は、長手方向の研究で使用するのに適しています。 2型糖尿病（T2DM）は破壊グルコース代謝およびインスリンに対する減少組織応答に二次高血糖症（インスリン抵抗性）およびインスリン8の十分な量を生成するために、膵臓β細胞のできないことを特徴とします。グルコース取り込みと代謝の動態解析は重要な洞察を提供することができます治療的介入の作用及び効果の機構、ならびに、疾患の進行の高度な監視を可能にします。

<table><tbody><tr><td>PET/CTスキャナー</td><td>Siemens</td><td>Inveon&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>18F-FDG</td><td>PETNET Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Pharmachem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30ゲージ針</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>PMOD モデリングソフトウェア</td><td>PMOD Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BKS.CG-Dock7m&nbsp;+/+&nbsp;Leprdb/J</td><td>mice Jackson Laboratory</td><td>000642</td><td></td></tr><tr><td>ヒトインスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用するグルコース代謝動態を決定します<sup&gt; 18</sup&gt; f-fdgマイクロpet / ct

Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT

この論文は、マウスのin vivoグルコース代謝動態を決定するための18F-FDGおよびマイクロPET/CTイメージングの使用について説明しています（ラットにも移植可能です。インスリン抵抗性による多臓器系におけるグルコースの取り込みと代謝の障害は、2型糖尿病の特徴です。この手法では、反復的なデコンボリューション法を使用して大静脈から画像由来の入力関数を抽出することができるため、動脈血サンプルを採取する必要がなくなります。組織と大静脈の時間活動曲線を2組織、3コンパートメントモデルに適合させることで、血漿から細胞内空間への18F-FDGの取り込み、細胞内空間から血漿への輸送速度、および18F-FDGリン酸化の速度に関連する速度論的マイクロパラメータを推定できます。この方法論は、縦断的研究の文脈でグルコース摂取と代謝動態の複数の測定を可能にし、治療的介入の有効性についての洞察も提供します。

我々は以前グルコース取り込みおよび代謝13の動力学にプラズマアポA-Iレベルの増加の影響を調査するために、db / dbマウスモデルを使用していました。本研究では、リアルタイムでの腓腹筋にプラズマからの18 F-FDGの取り込みを監視するためにPET / CTイメージングの有用性を実証するために、インスリンで処置したdb / dbマウスを使用しました。 6週齢のdb / dbマウスを麻酔し、30分のPETスキャンの開始前に、皮下注射を介して3 Uヒトインスリン/ kg、または等量のPBSで処置しました。マウスは60分間PETによって測定静脈注射および取り込みを介して18 F-FDGの10 MBqのを受けました。 CTスキャンは、解剖学的基準を行いました。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

この研究は、18F-FDGおよび陽電子放出断層撮影/コンピュータ断層撮影(PET/CT)イメージングをキネティックモデリングと共に使用して、18F-FDGの組織へのin vivoでのリアルタイム取り込みを定量化するプロトコルについて説明しています。

使用するグルコース代謝動態を決定します<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDGマイクロPET / CT

This paper describes the use of 18F-FDG and micro-PET/CT imaging to determine in vivo glucose metabolism kinetics in mice (and is transferable to rats). ...

このイメージングプロトコルの全般的な目的は、マウスの血流から特定の組織へのグルコースのin vivoリアルタイム取り込み量を定量化することです。この手法は、糖尿病治療がグルコースの取り込みや代謝に及ぼす影響など、糖尿病および代謝分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、実験を縦断的に実施できるため、例えば加齢や食事などがグルコース代謝に及ぼす影響を評価できる点にあります。この手法を習得することで、骨格筋におけるグルコース代謝に関する情報を得ることができます。また、肝臓や脳などの他の組織においても有用であり、ラットへの転用も可能です。正確な結果を得るためには、画像の取得と解析ステップを正しく完了させる必要があるため、この手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要になります。まず、導入チャンバー、イメージングベッド、およびヒートパッドを80% ethanolで拭きます。マウスを導入チャンバーに入れ、5% isofluraneと酸素で麻酔をかけます。電気加熱パッドとセンサーパッドをイメージングベッドに固定します。マウスを腹臥位にし、ノーズコーンを用いて1.5～2%のisofluraneを毎分1Lの流量で投与し続けます。眼の乾燥を防ぐため、マウスの眼に獣医用軟膏を塗布します。その後、マウスの尾を1～2分間温めます。側尾静脈が拡張したら、30ゲージの針を静脈に挿入します。外科用接着剤で針を固定し、針にカテーテルを接続します。イメージングベッドをPET/CTスキャナーに導入し、装置の背面からカテーテルにアクセスできるようにベッドを配置します。F18-FDG投与量を含むシリンジをカテーテルに固定します。麻酔導入後の規定時間が経過した後、1時間のPETスキャンを開始し、F18-FDGを注入します。PETスキャンの完了後、10分間のCTスキャンを実施します。CTスキャンの後、イメージングベッドを初期位置に戻し、ベッドからマウスを取り出します。麻酔下で頸椎脱臼させて安楽死させるか、あるいは観察下で単独飼育し、マウスを回復させます。画像処理を開始するために、再構成されたPETおよびCT画像をロードします。CTデータをソース、PETデータをターゲットに指定します。データを共レジストレーションし、必要に応じて画像を整合させます。その後、ROI定量化を選択します。パンおよびズームツールを使用して、画像内の目的の関心領域を特定します。「作成」タブに移動し、ペイントブラシツールを選択します。腓腹筋に対応するROIを描画します。次に、ROI定量化保存機能を使用して、組織の時間活性データをCSVファイルとして抽出します。Van Cittertデコンボリューション法を用いて、推定システム点広がり関数を5回反復してデコンボリューションします。次に、大静脈に対応するROIを描画します。デコンボリューション後の画像から血中入力関数時間活性データをCSVファイルとしてエクスポートします。CSVファイルをスプレッドシートソフトウェアにインポートします。データを新しいCSVファイルとして保存し、集積値を注射線量あたりのパーセント（%ID/cm³）に変換します。表計算ソフトを使用して時間-活性曲線をプロットします。次に、処理した大静脈のデータを新しいCSVファイルに保存します。大静脈のデータを血漿入力関数に変換します。キネティックモデリングツールで「kinetic」を選択します。組織および血漿の全放射能カウントデータのファイルをインポートします。2組織3コンパートメントモデルを選択してください。F18-FDGの脱リン酸化速度K4のチェックが外れており、値が0であることを確認してください。血液体積分率VBを2%に設定します。大静脈由来の入力関数に分散を加えるには、disp4dftなどのプログラムを使用して、異なる分散時間を持つ複数の入力関数を作成してください。その後、分散を加えた入力関数を一つずつ読み込み、「fit current region」を選択します。分散を伴う入力関数の中で、ChiSquared値が最小となるものを求めるまでこれを繰り返します。最適化された入力関数を用いて、血流量分画を浮動値に設定します。再度領域のフィッティングを行い、領域速度定数を決定します。次に、局所流入定数を算出します。インスリンまたはリン酸緩衝生理食塩水で処理した6週齢のDBDBマウスを本手法で撮像しました。インスリン処理マウスでは、対照マウスと比較して、腓腹筋におけるF18-FDG活性の上昇が認められました。大静脈において活性の増加は観察されませんでした。キネティックモデリングには、2組織3コンパートメントモデルを用いました。細動脈血漿から細胞内空間への、またはその逆方向へのF18-FDG輸送率において、対照群との有意な差は認められませんでした。しかしながら、インスリン投与マウスではF18-FDGのリン酸化速度が有意に高くなっていました。それに伴い、インスリン投与マウスの流入定数も高くなっていました。ビデオを視聴することで、マウスの正しい撮像方法、関心領域（ROI）の設定方法、および速度論的パラメータの算出方法について十分に理解できるはずです。放射線を用いた作業は危険を伴う可能性があるため、本手順を実施する際は、適切なトレーニングの受講、遮蔽物の使用、被ばく量のモニタリングなどの予防策を常に講じてください。

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使用するグルコース代謝動態を決定します

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