QTLマッピングとCRISPR / Cas9編集による薬剤耐性遺伝子同定 Toxoplasma gondii

この定量的形質遺伝子座マッピングとCRIPR/Cas9ゲノム編集方法論の全体的な目標は、トキソプラズマのシネファンギン耐性に関与する遺伝子を特定し、その後検証することです。これらの方法は、変異体の遺伝的基盤、病因、薬剤耐性など、寄生虫学における重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、全ゲノムシーケンシングデータを使用して正確なQTL解析を行い、CRISPR/Cas9ゲノム編集を使用してトキソプラズマの効率的な遺伝子操作を実現できることです。

その手順を実演するのは、私の研究室の研究員であるロビン・パウエル博士です。トキソプラズマ原虫は、D10培地でT25フラスコに播種された、コンフルエントなヒト包皮線維芽細胞またはHFF細胞で増殖します。個々の子孫クローンのシネファンギン耐性を試験するには、寄生虫の大部分が宿主細胞を溶解し始めるまで、各クローンを高い寄生虫密度に成長させます。

テキストプロトコルに記載されているように寄生虫溶液を調製した後、ピペッターを使用して、5番目の寄生虫に10の2.5倍をD10培地を含む新しいT25 HFF培養フラスコに渡し、シネファンギン薬物の0.3マイクロモルの使用濃度で行います。寄生虫を摂氏37度、CO25%で7〜10日間増殖させます。逆位相差顕微鏡でHFF細胞単層を観察し、シネファンギン薬の増殖表現型の子孫を採点します。

たとえば、成長がない場合は 0 を採点し、単分子膜の成長と溶解の場合は 1 を採点します。すべての子孫がスコアリングされると、データは量的形質遺伝子座または QTL マッピングのバイナリ表現型として使用されます。原因となる突然変異を特定するために、子孫の全ゲノムシーケンシングリードをシネファンギン感受性vanストランド参照ゲノムにアラインメントし、SNPを呼び出し、QTL遺伝子座をスキャンしてシネファンギン耐性に関連するSNPを探します。

SNR1がシネファンギン耐性遺伝子であることの確認は、CRISPR/Cas9誘導インデル変異を使用して野生型シネファンギン感受性バックグラウンドでSNR1を不活性化することによって行われます。SNR1特異的CRISPRプラスミドを構築するために、CRISPRプラスミドを標的とするUPRTをテンプレートとして使用して、特異的に設計されたプライマーを用いたPCRベースの部位特異的突然変異導入を行います。目的遺伝子特異的なCRISPRプラスミドを含む突然変異誘発産物は、大腸菌細胞に形質転換されます。

次に、個々のクローンをピックしてLB培地で増殖させ、抽出したプラスミドをDNAゲル電気泳動で分析してサイズを確認します。その後、プラスミドのシーケンシングを行い、標的特異的なガイドRNA配列を確認します。標的特異的なCRISPRプラスミドがトキソプラズマ細胞に導入されると、ガイドRNAはCas9核を標的に向け、標的の特定の遺伝子座から二本鎖DNAをブレイクアウトさせます。

その後、DNA切断は、エラーが発生しやすい、非相同な結合活性によって固定され、標的遺伝子のインデル変異につながります。寄生虫をSNR1特異的CRISPRプラスミドでトランスベクトする2〜3日前に、コンフルエントHFF細胞単層を含むT25フラスコに十分な寄生虫を添加して、2〜3日以内に70%〜80%HFF細胞溶解を達成します。倒立位相差顕微鏡で培養物を検査し、HFF単層が寄生虫によって70%から80%溶解されていることを確認します。

ピペットで培地を静かに取り出し、5ミリリットルのサイトミックスバッファーでフラスコの表面から細胞を洗い流します。寄生虫溶液を15ミリリットルの円錐管に移します。寄生虫溶液を10ミリリットルの注射器に22ゲージの鈍い針で2〜3回通します。

HFF細胞と細胞破片を除去するには、寄生虫溶液を孔径3ミクロンのメンブレンで新しい円錐形のチューブにろ過します。ろ過された寄生虫を400倍Gで10分間遠心分離することによりパレット化します。上清を注ぎ、パレットにした寄生虫を10ミリリットルのサイトミックスバッファーで再懸濁します。

10マイクロリットルのアリコートを取り出し、血球計算盤で寄生虫濃度を測定します。残りの懸濁液を再びGの400倍で遠心分離し、10分間パレット化します。上清を取り除き、パレットをミックスバッファー内に再度懸濁して、1ミリリットルあたり7番目の寄生虫の4倍10の密度を得る。

4ミリリットルのギャップキュベットに、250〜300マイクロリットルの寄生虫溶液を7.5マイクログラムのCRISPRプラスミド、6マイクロリットルのATP、および6マイクロリットルのグルタチオンと混合します。寄生虫をエレクトロポレーションし、T gondiiトランスベクションの標準的な手順に従います。ネガティブコントロールとして、CRISPRプラスミドが他の場所を標的とする別のエレクトロポレーションを含めます。

エレクトロポレーション寄生虫をT25フラスコで増殖させ、摂氏37度のHFF細胞を2日間播種します。誘導された突然変異を調べる手順を開始するには、まず、フラスコ内の培地を、0.3マイクロモルのシネフンギンを含む5ミリリットルのD10と交換します。耐性プールが安定するまで、寄生虫と選択培地を少なくとも3回の通路に保ちます。

ネガティブコントロールグループでは寄生虫の成長が見られませんでしたが、実験グループでは寄生虫の増殖が堅調でした。シネファンギン耐性プールをサブクローンして、コロニアルストランドを取得します。新たに排出された寄生虫を3ミクロンの膜ろ過で精製し、150マイクロリットルのD10培地にコンフルエントHFF細胞を播種した96ウェルプレートにサブクローニングします。

CO2インキュベーターで37°Cのサブクローニング培養物を7〜10日間、プレートを乱さずに培養します。7〜10日後、倒立位相差顕微鏡で96ウェルプレートを確認します。プラークが1つだけ含まれている井戸を探し、そのような井戸に印を付けます。

各ウェルから細胞をHFF細胞を播種した24ウェルプレートに移します。摂氏37度でインキュベートします。寄生虫が単分子膜を溶解し始めたら、50マイクロリットルの寄生虫溶液を新しいウェルに通して菌株を維持し、残りを採取してゲノムDNAを分離します。

残りの寄生虫溶液をGの1000倍で10分間パレットに塗ります。パレット化された寄生虫をPBSで洗い、再度パレット化します。市販のキットを使用するか、寄生虫を50〜100マイクロリットルのPBSで沸騰させて再懸濁することにより、パレット細胞からゲノムDNAを単離します。

最後に、テキストプロトコールに記載されているようにPCRを行い、シーケンシングのためのSNR1遺伝子の断片を得る。親のFUDR耐性ME49およびシネファンギン耐性バン株を使用して、交差由来の子孫は、HFF単層の成長および溶解によって示されるように、薬物、シネファンギンに対する耐性のためにアクセスされました。QTLスキャンの結果、9番染色体上に約1MBPにわたる1つの有意なピークが得られました。

原因となる突然変異はこの領域にあります。全ゲノムシーケンシングにより、突然変異の特定につながりました。QTL遺伝子座内の子孫SNPをスプレッドシートにインポートし、黄色で示されているシネファンギン耐性子孫がSNPを持ち、緑色で示されているシネファンギン感受性子孫が持たないパターンについてスキャンしました。

赤で示されたSNPは1つだけで、このパターンと一致し、SNR1と名付けられた推定アミノ酸トランスポーター遺伝子の早期停止コドンをもたらします。CRISPRケース9プラスミドを標的とするSNR1をシネファンギン感受性野生型寄生虫株にエレクトロポレーションしたところ、シネフンギンで培養すると耐性変異体が得られました。対照的に、他の場所を標的とするCRISPRプラスミドでは、シネファンギン耐性寄生虫は得られませんでした。

いくつかのシネファンギン耐性CRISPR変異体をSNR1ガイドRNAターゲットの周辺領域にクローニングし、シーケンシングしました。RH野生型株とC5およびC6シネファンギン耐性変異体の結果を代表するものは、各変異体がSNR1遺伝子のコード配列を破壊するインデルを持っていたことを示しています。トキソプラズマ原虫の取り扱いは、人間に感染するため、危険な場合があることを忘れないでください。

この手順では、寄生虫と接触する可能性のある鋭利物の適切な取り扱いなど、予防措置を講じる必要があります。この手順に続いて、CRISPR/Cas9を介した部位特異的外因性遺伝子挿入などの他の方法を実行して、遺伝的補完やトランスジェニック寄生虫の構築などの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、分子寄生虫学の分野の研究者がトキソプラズマ原虫の複雑な生物学と病因のメカニズムを探求する道を開きました。

このビデオを見れば、ゲノムシーケンシングデータを使用したQTL解析の方法について十分に理解できるはずです。また、CRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたトキソプラズマ原虫の遺伝子代謝