Name: QTLマッピングとCRISPR / Cas9編集による薬剤耐性遺伝子同定 Toxoplasma gondii (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学ぶQTLマッピングとCRISPR/Cas9を用いたToxoplasma gondiiの薬剤耐性遺伝子同定法。シネファンジン耐性に関わるSNR1遺伝子の機能解析と寄生虫学における遺伝的薬剤耐性メカニズムの理解に貢献します。

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これらのプロトコルの基礎となる元の出版物への貢献についてL. David SibleyとAsis Khanに感謝したいと思います。この研究は、国立衛生研究所の助成金AI108721によって資金提供されました。

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

これらのプロトコールは、組み合わされたときに、 T.ゴンディイにおける薬剤耐性遺伝子の同定を可能にするいくつかの方法を提示する。とりわけ2つは、QTLマッピングの比較的味付けされた方法と、最近開発されたCRISPR / Cas9遺伝子編集方法と、プロジェクトにとって不可欠であった。 LanderとBotsteinは1989年に影響を受けた論文を発表し、遺伝子座と表現型を関連付けるQTLマッピングを示した36 。最近では、DoundaとCharpentierはStreptococcus pyogenes 22のCRISPR / Cas9編集システムを、 T. gondii 13,17を含む多くの異なるモデルの遺伝子ツールとして迅速に適合させたと説明しました。どちらの方法も有用であり、QTLマッピングは、WGSベースのSNP検出を用いて最終的に同定された薬物耐性突然変異を含む遺伝子座を定義し、CRISPR / Cas9編集は、<html> SNR1がシネフンギン耐性遺伝子であることを確認するためのものである。 ME49-FUDR r X VAND-SNF r cross 8はもともとビルレンス表現型19を調べるために開発されたものであるが、親株にはVAND親のSinefungin耐性の原因遺伝子が知られていない追加の表現型の相違も起こった。これは、親のさらなる表現型の相違が観察されたときに再利用できるという点で、十字架の1つの利点を強調する。これは毒性に関与するいくつかの遺伝子が複数の表現型37,38,39,40をマッピングすることによって見出された別のToxoplasma cross、type 2 x type 3の場合であった。今日までに、4つの異なるT.ゴンジイ十字が記述され、表現型の原因となる遺伝子遺伝的根拠が未知である新しい表現型をマッピングするために再利用される可能性のある8,37,41,42を含む。これらの系統に沿って、既知の全体的な遺伝的多様性を表す62のT.ゴンディイ株のゲノムが配列決定された（ 43） 。興味深い表現型が異なる系統について、このプールから新たな十字架を作ることができた。 QTLマッピングの利点を賞賛したので、クロスを生成することは軽微なものではないと言わざるを得ない。因果遺伝子を同定するために使用できる他の方法がある。 1つの強力な技術は、化学的突然変異誘発を用いて表現型についてスクリーニングされ得る突然変異体を作製する。因果遺伝子を見つけるために、突然変異体をコスミドライブラリ44で補完するか、またはゲノム再配列決定法を用いて原因突然変異45を見つけることができる。モーこのことについては、Coleman らによる2つのJoVEの記事を参照してください。およびWalwyn らこれらのアプローチの概要46,47 。 因果的SNF r突然変異（プロトコル2および3）の同定につながる多くのステップは、学術的に自由に利用できるソフトウェアで実施される計算方法に依存している。各ステップの詳細なコマンドが提供され、適切なファイルで実行すると、原因SNF r SNPを見つけるために必要なデータセットをユーザーが再作成できるようになります。コマンドの構文の中には、ユーザーの設定に変更できるファイル名またはディレクトリ構造（$ PATH）を参照するものがあることに注意してください。ここで与えられたコマンドは、QTL分析とWGSベースのSNP同定との交差を分析する方法を確実に排除するものではありませんが、この記事で説明した実験を繰り返すのに十分な包括的であり、<html>これらのアプローチがどのようにステップバイステップで利用されているかに精通しています。 QTLマッピングおよびWGS配列に基づくSNP検出は候補SNF r遺伝子を同定するのに十分であったが、薬剤耐性におけるその役割を確認するためにさらなる実験が必要である。これは、CRISPR / Cas9遺伝子編集を用いて達成することができる遺伝子破壊またはノックアウト技術によって説得的に示され得る。 CRISP / Cas9を用いて、インディル突然変異を生成するか、またはトランスジェニック構築物をT.ゴンジの標的遺伝子に挿入するための詳細な方法が示される。 CRISPR / Cas9が提供する標的特異性は、従来の方法よりも遺伝子編集の効率を高める。またこれは効率的に増加しており、これまで困難であった遺伝子研究のための非実験室適応株を使用することが可能となった13 。初期段階では、CRISPR / Cas9は既に遺伝子破壊を行うために使用されているT. gondiiの遺伝子ノックアウト16,19,50,51,52,53,54を有用なツールとして期待している将来の多くの研究のために。 SNR1不活性化がsinefungin抵抗性をもたらすという発見は、 SNR1遺伝子座を導入遺伝子の挿入または遺伝的相補性の有望な部位にする。導入遺伝子のSNR1遺伝子座への組み込みを指示するためのCRISPR / Cas9媒介遺伝子ターゲティングの使用の成功を最大限にするためには、以下の側面が考慮されるべきである実験設計中は赤色になります。第1に、選択マーカーは、トランスジェニック構築物に含まれることが推奨され、ストレイン構築の効率を高める。選択マーカーが含まれる場合、陽性および陰性選択の両方を使用することができ、その結果、二重に選択された寄生虫のほぼ100％がSNR1遺伝子座に組み込まれたGOIを有するトランスジェニックである。対照的に、トランスジェニック構築物が追加の選択可能な形質を含まず、 SNR1遺伝子座におけるネガティブ選択に依存する場合、成功した遺伝子導入の効率は、CRISPRプラスミドおよびトランスジェニック構築物の共トランスフェクション効率に大きく依存する。 第2に、非相同DNA断片のCRISP / Cas9媒介性部位特異的組込みは、補完および遺伝子導入にしばしば使用されるが、どちらの方向も可能である場合には、挿入の方向性を保証することはできない。これはプローブを引き起こす可能性がありますいくつかのアプリケーションにms。例えば、異なる遺伝子対立遺伝子を有する変異体を補完するためには、全ての対立遺伝子が同じ方向に挿入されることを確実にすることは困難であり、方向の不一致が発現の相違を引き起こす可能性がある。このタイプのアプリケーションでは、 SNR1遺伝子座と相同な配列を持つDNA構築物が推奨されており、これは適切な組み込み方向を導きます （ 図6 ）。 第3に、トランスフェクションの間、CRISPRプラスミドとトランスジェニックDNA分子との間の比は、成功したトランスジェニック株構築のために重要である。この比率は、選択戦略に従って調整する必要があります。以下のガイドラインが推奨される：1）トランスジェニック構築物が薬物耐性マーカーを含み、対応する薬物がトランスジェニック寄生虫を生成するために使用される唯一の選択肢である場合、 すなわちシネフンギンは使用されない場合、トランスジェニック構築物とCRISPRプラスミドidは1：5です。この場合、より多くのCRISPRプラスミドを使用することにより、トランスジェニック構築物を受ける寄生虫もCRISPRプラスミドを受ける可能性が高くなるため、薬剤耐性寄生虫は、CRISPR標的部位にマーカーを挿入する可能性が高くなる。この比が逆転した場合、トランスジェニック構築物を受けるほとんどの寄生虫はCRISPRプラスミドを得ることができない。結果として、薬剤耐性寄生虫の大多数は、CRISPR / CAS9媒介性部位特異的挿入に関連しないランダム組込みを介してトランスジェニック構築物を得る。 2）トランスジェニック構築物が薬物耐性マーカーを含み、対応する薬物がトランスジェニック寄生虫を選択するためにシネフンギンと共に使用される場合、トランスジェニック構築物とCRISPRプラスミドとの間の示唆されたモル比は1：1である。この戦略は、トランスジェニック株構築の最高効率を提供する。 3）トランスジェニック構築物が選択マーカーを含まない場合、ネガティブ選択に頼るトランスジェニック構築物とCRISPRプラスミドとの間の示唆されたモル比は5：1である。このデザインの理論的根拠は、上記の最初のガイドラインと同じです。プロトコル5でピリメタミンとシネファンギンの両方を選択に使用したので、 DHFR * mini遺伝子とSNR1を標的とするCRISPRプラスミドとの比は1：1に設定した。 まとめると、ここで概説されている方法は、 SNR1 2を特定した元の刊行物には伝えられなかった詳細レベルを持っています。これらのプロトコル。具体的には、コマンドライン構文、利用されるプログラムの順次レイアウト、およびCRISPR / Cas9の使用は、表現型の原因となる新しい遺伝子を同定するための将来の努力を助けるべきである。

宿主範囲は、寄生虫の蔓延の程度を決定する。いくつかの寄生虫は、それらが見つかった領域を限定する非常に特定のホスト要件を有し、他のものはジェネラリストである。そのような一般論者の 1人はToxoplasma gondii（ T. gondii）である 。この寄生虫は、すべての哺乳類や多くの鳥に感染する可能性があるため、世界中で発見されています。人間も感受性があり、世界人口の約1/3が感染していると推定されています。幸いにも、頑強な免疫応答は通常、寄生虫の成長を制御するが、免疫系が損なわれた状況では、寄生虫は未検査で増殖して、しばしば脳炎を引き起こすことがある。以前に感染していない女性が妊娠中に感染した場合、寄生虫の広がりをすぐに制限するために免疫記憶がないため、この寄生虫は先天性疾患を引き起こす可能性があります。さらに、眼のトキソプラズマ症の負担があり、視力喪失の原因となります1 。これらのreasons T. gondiiは研究の焦点となり、その研究のために開発された多くの分子的方法のために、Apicomplexan寄生虫のモデルとなった。ここで議論される2つの方法は、定量的形質遺伝子座（QTL）マッピングおよびクラスター化された規則的にインターリーブされた短いパリンドローム反復（CRISPR）/ Cas9遺伝子編集である。 QTLマッピングおよびCRISPR / Cas9編集は、 T.ゴンディイ病原性遺伝子を同定および/または特徴付けするために以前の研究で用いられてきた順方向および逆方向遺伝子アプローチである。ここでは、これらの方法を組み合わせて、正弦波耐性（SNF r ）遺伝子、TgME49_290860、およびそのオルソログ（ SNR1として注釈付けられている） 2の機能を同定および確認する。 T.ゴンディイ（T. gondii）は多種多様な中間宿主に感染することができるが、生涯を完了するためには、腹腔内の上皮細胞を通過して感染する必要がある。猫は寄生虫の決定的な宿主で、予期せぬ段階が生じ、減数分裂による遺伝子組換えが起こる。 QTL試験を行うためには、遺伝的交雑を作成しなければならず、 トキソプラズマの場合、これは表現型特性が異なる2つの異なる寄生虫株（親染色剤）をネコに通して組換え子孫3を産生することを意味する。ネコに与えられる前に、親株は、子孫の二重薬剤選択による組換え体のより効率的な同定を可能にするために、別個の薬剤に対して耐性にされる。この目的のためにT.ゴンディイでは3つの薬物が使用されている。ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ UPRT ）が耐性遺伝子5であるフルオロデオキシリボース（FUDR）、アデノシンキナーゼ（ AK ）が耐性遺伝子6であるアデノシンアラビノシド（ARA）、および耐性遺伝子が未知であるシネフンギン（SNF）いくつかの遺伝的交配がT. gondiiについて作成されたが、ME49-FUDR r X VAND-SNF r crossの24の子孫のみが全ゲノム配列決定（WGS） 8を用いて遺伝子型決定された。これは、VAND親が薬物感受性VAND（VAND-SNF s ）株の化学的突然変異誘発によってシネフンギン耐性にされ、このVAND参照ゲノムはVAND- SNF s株は、子孫のシネフンギン耐性の一部をレンダリングした遺伝的な親VAND-SNF r突然変異を含む、子孫WGSとVAND-SNF の参照ゲノムとの間のすべての多型の同定を可能にする。 SNF r子孫における因果的一塩基多型（SNP）を同定するために、いくつかのコンピュータベースのオープンソースリソースを用いてデータを分析することができる。 ME49の遺伝地図を作成するには、FUDR r X VAND-SNF r交差REDHORSEソフトウェアスイート9は、遺伝的交叉のゲノム位置を正確に検出するために両親と子孫のWGSアライメントを使用するように開発されました。次いで、このマッピング情報を表現型データ（子孫におけるSNF r ）と組み合わせて、R統計的プログラミングソフトウェアの「qtl」パッケージ10と互換性のあるデータセットをフォーマットすることができ、QTLスキャンを実行して、表現型。 QTL遺伝子座内に位置する因果的SNPを同定するために、VarScan mpileup2snp変種発病者プログラム12を用いてSNPを呼び出すことができるBowtie 2アライメントプログラム11を用いて、子孫のWGS読み取りをSinefungin感受性VANDゲノムに個々に整列させることができる。これらのSNPを用いて、QTL遺伝子座は、SNF rに存在する多型をスキャンすることができるが、SNF の子孫である。遺伝子のコード領域で同定された因果的SNPを用いて、候補SNF r遺伝子の遺伝子改変をSNF s株で行い、薬剤耐性機能を検証することができる。 Toxoplasma 13には 、最近CRISPR / Cas9ゲノム編集システムが確立されました。このシステムは、この寄生生物の複雑な生物学の探索のために、特に実験室ではない系統の遺伝学的研究のために重要なツールを追加しました。 WT Toxoplasma細胞における高度に活性な非相同末端結合（NHEJ）活性のために、外因的に導入されたDNAが非常に高い頻度でゲノムにランダムに組み込まれるため、標的化されたゲノム改変を達成することは困難である14 。遺伝子座特異的修飾の成功率を増加させるために、相同組換えの効率を増加させるために、および/または相同組換えの効率を増加させるために、e NHEJ活動15,16 。これらのアプローチの1つは、CRISPR / Cas9システムです。他の方法と比較して、CRISPR / Cas9システムは、サイト固有の改変を導入するのに効率的であり、設計が容易である13,17,18。さらに、それは寄生虫13,19に特別な変更を加えることなく、任意のトキソプラズマ株で使用することができる。 CRISPR / Cas9系は、 ストレプトコッカス・ピオゲネス （ Streptococcus pyogenes ）の適応免疫系に由来し、それを用いてファージ20,21,22などの移動性遺伝子エレメントの侵入を防御する。このシステムは、RNA誘導DNAエンドヌクレアーゼ酵素Cas9を利用して二本鎖DNA切断（DSB）を標的に導入し、その後にrepa短い間違った突然変異を介して標的遺伝子を不活性化するためにエラーが起こりやすいNHEJによって、または設計された通り正確に標的遺伝子座を改変する相同性指向性組換えによって誘発される23,24 。標的特異性は、標的DNA22と100％相同性を有する個別に設計された20nt配列を含む単一ガイドRNA（gRNA）と名付けられた小型RNA分子によって決定される。 gRNA分子はまた、特別なProtospacer Adjacent Motif（PAM、配列は「NGG」） 25,26を含む標的部位にヌクレアーゼを誘導するCas9によって認識されるサインを含む。したがって、gRNA分子とPAM配列は共同してゲノム中のCas9切断部位を決定する。切断のために異なる部位を標的とするためにgRNA配列を容易に変更することができる。 CRISPR / Cas9システムがToxopで初めて開発されたときCasasヌクレアーゼを発現する単一のプラスミドおよびgRNA分子を用いて、標的部位13,17にDSBを導入した。 CRISPR / Cas9システムは、相同組換えだけでなく、外因性DNAの非相同性組み込みによって、部位特異的ゲノム修飾の効率を大幅に高めることが示されている13 。これは、NHEJ活性を含む野生型株においてこれを行う。したがって、このシステムは、効率的なゲノム編集のために本質的に任意のトキソプラズマ株で使用することができる。典型的な実験では、標的特異的CRISPRプラスミドおよび標的を改変するために使用されるDNA断片を寄生虫に同時トランスフェクトする。標的を改変するために使用されるDNA断片が標的座に対する相同配列を含む場合、CRISPR / Cas9によって導入されたDSBを修復するために相同組換えを用いて標的の正確な改変を可能にすることができる。一方、int生成されたDNA断片は相同配列を含まないので、依然としてCRISPR / Cas9標的部位に組み込むことができる。後者は、選択マーカーの挿入またはネガティブ選択を可能にする座位での突然変異体の補完によって遺伝子を破壊するためにしばしば用いられる13 。ここで、 SNR1遺伝子座は、CRISPR / Cas9が遺伝子破壊およびトランスジェニック寄生虫の作製にどのように使用され得るかを示す一例として役立つ。

<table><tbody><tr><td>T25フラスコ</td><td>コーニング</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>ヒト包皮線維芽細胞(HFF)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1041</td><td></td></tr><tr><td>T. gondii ME49株</td><td>ATCC</td><td>50840</td><td></td></tr><tr><td>T. gondiiVAND 株</td><td></td><td>ATCC PRA-344</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (重炭酸ナトリウムなし)</td><td>ライフサイエンス</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>牛胎児血清 (FBS) プレミアムグレード</td><td>VWR International</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp; 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン (10 mg/mL)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フラスコ用15710064セルスクレーパー</td><td>VWR International</td><td>10062-904</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ 10 mL</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>鈍い針 22 G x 1"</td><td>BRICO 製品</td><td>BN2210</td><td></td></tr><tr><td>核孔フィルター 3.0 & マイクロ;m, 25 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>110612</td><td></td></tr><tr><td>Swin-Lok フィルターホルダー 25 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>420200</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Propper MFG</td><td>90001</td><td></td></tr><tr><td>Sinefungin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>380-070-M001</td><td></td></tr><tr><td>R&nbsp;</td><td>The R Foundation</td><td>https://www.r-project.org/</td><td></td></tr> <tr><td>J/qtl</td><td>The Churchill Group</td><td>http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie2</td><td>ジョンズ・ホプキンス大学</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td></td></tr><tr><td>NCBI SRA Toolkit</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc</td><td></td></tr><tr><td>SAMtools</td><td>ウェルカムトラストサンガーインスティテュート</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr> <tr><td>VarScan</td><td>ワシントン大学、セントルイス</td><td>http://varscan.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>MUMmer</td><td>JCVI&Univ Hamburg</td><td>http://mummer.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #54467</td><td>T. gondii UPRT遺伝子を切断するCRISPRプラスミド</td></tr><tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #59855</td><td>T. gondii TG*_290860 SNR1遺伝子を切断するCRISPRプラスミド</td></tr><tr><td>pUPRT::D HFR-D</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #58528</td><td>DHFR* mini gene</td></tr><tr><td>Q5 Site-Directed Mutagenesis Kitのテンプレート&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>E0552S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprepスピンミニプレップキット</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>LBブロス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sigma</td><td>Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma</td><td>Aldrich M1028</td><td></td></tr><tr><td>アデノシントリポシュペート(ATP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタチオン(GSH)</td><td>SigmaAldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 エレクトロポレーション システム</td><td>BTX</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーション キュベット&nbsp; 4 mm</td><td>ハーバード 装置</td><td>45-0126</td><td></td></tr><tr><td>Crytal Violet</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21932-14</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル TC プレート</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェル TC プレート</td><td>Corning</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス 12 mm 丸型</td><td>VWR International</td><td>89015-724</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル TC プレート</td><td>Corning</td><td>353075</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment)</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity Polymerase&nbsp;</td><td>ニューイングランドBiolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>ピリメタミン</td><td>TCIアメリカ</td><td>P2037-1G</td><td>ピリメタミン耐性寄生虫を使用するときにキュレーションを使用してください - プロトコルを参照してください</td></tr></tbody></table>

qtlマッピングとcrispr / cas9編集による薬剤耐性遺伝子同定<em&gt; toxoplasma gondii</em

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

科学的知識は、利用可能な技術と方法に本質的に関連している。この記事では、全ゲノム配列（WGS）ベースの遺伝地図を用いた定量的形質遺伝子座（QTL）マッピング法である Apicomplexan寄生虫Toxoplasma gondiiの薬剤耐性遺伝子の同定と検証を可能にする2つの方法と、 （CRISPR）/ Cas9ベースの遺伝子編集を行うことができる。 QTLマッピングのアプローチは、ゲノム領域と表現型との間に相関があるかどうかを試験することを可能にする。 QTLスキャンを実行するには、2つのデータセットが必要です。遺伝子地図は、その交配の子孫のそれぞれで評価された組換え交配子孫と定量可能な表現型の子孫に基づいています。これらのデータセットは、表現型と相関する有意な遺伝子座を同定するためにQTLスキャンを生成するR / qtlソフトウェアと互換性があるようにフォーマットされる。これは検索の幅を大幅に狭めることができますがQTLsは、原因遺伝子が同定される必要があるいくつかの遺伝子を含む領域に及ぶ。子孫のWGSを有することは、遺伝子レベルで原因となる薬物耐性突然変異を同定するために重要であった。同定されたら、候補突然変異は、薬物感受性寄生虫の遺伝子操作によって確認することができる。 T.ゴンジを遺伝的に改変する最も簡単で効率的な方法は、CRISPR / Cas9系である。このシステムは、単一のプラスミド上にコードされたわずか2つの成分、ゲノム標的に相補的な20bp配列を含む単一のガイドRNA（gRNA）および標的で二本鎖DNA切断（DSB）を生成するCas9エンドヌクレアーゼを含み、その修復は、破壊部位周辺の配列の挿入または欠失を可能にする。この記事では、シネフンギン耐性の原因遺伝子を確認し、トランスジェニック寄生虫を構築するために、CRISPR / Cas9ベースのゲノム編集ツールを使用するための詳細なプロトコルを提供します。

この記事では、薬剤耐性の原因となる遺伝子を同定するために連続して使用できるいくつかの方法について詳しく説明します（ 図1 ）。 ME49-FUDR r X VAND-SNF r crossの24子孫を、プロトコール1に記載されているように、薬剤sinefunginに対する耐性について評価した。遺伝地図および子孫のSNF r表現型を用いて、QTLスキャンをR / qtl - プロトコル2（ 図2 ）。これにより、約1Mbpにわたる第IX染色体上に1つの有意なピークが得られた。因果的変異が存在するのはこの領域にある。 因果的突然変異を同定するために、子孫からのWGS読み取りを、Bowtie2-Protocol 3.1を用いてVAND-SNF の参照ゲノムに整列させ、VarScan mpileup2snp-Protocol 3.2を用いてSNPを呼び出し、VANDゲノムのQTL遺伝子座をMUMmer- Protoc3.3。 QTL遺伝子座内の子孫SNPを抽出し、SNF r子孫がSNPを有しSNF が存在しないパターンについてスキャンした。これは子孫SNPがVAND-SNF の参照ゲノムと比較して得られたためである（ 図3 ） 。 SNR1と名付けられた推定上のアミノ酸トランスポーター遺伝子に早期終止コドンをもたらすこのパターンと一致するSNPは1つだけであった。 SNR1がSNF r耐性遺伝子であることの確認は、CRISPR / Cas9系を用いて行った。 T. gondii遺伝子編集のために設計された新しいCRISPR / Cas9プラスミドを、子孫プロトコール4（ 図4A ）で同定されたSNF r突然変異付近のSNR1遺伝子を標的とするgRNAを含むように作製した。 SNR1標的CRISPR / Cas9プラスミドをSNF s WT寄生虫株に電気穿孔し、耐性変異体を得た0.3μMのシネフンギン中に固定した。 CRISP / Cas9プラスミドを標的とするUPRTで電気穿孔した場合、SNF r寄生虫は得られなかった。いくつかのSNF r CRISPR突然変異体をクローニングし、 SNR1 gRNA標的周辺の領域を配列決定した。各変異体は、 SNR1遺伝子のコード配列を破壊するindelを有していた（ 図4B ）。この方法は、NHEJ（ 図5）またはHR（ 図6 ） - 補足ファイル2を介してSNR1遺伝子座に標的化構築物を挿入するためにも使用することができる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig1.jpg" /> 図1：プロトコルで概説された実験のための回路図ワークフロー ME49-FUDR r X VAND-SNF rクロスを用いてSNF r遺伝子を同定し、確認するための主なステップは、tに概説された適切なプロトコールを参照して示される彼の記事<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig2.jpg" /> 図2：SNR r表現型でQTLスキャンを実行するためのR / qtlコマンドプロトコル2で概説されたコマンドは、qtlパッケージを使用してRで実行されました。代表的なコマンドとプロットが表示されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig3.jpg" /> 図3：原因SNPの位置。子孫のWGS読み取りは、Bowtie 2を用いたVAND-SNF の参照ゲノムに整列され、SNPはVarScanと共に呼び出され、対応<html> MUMmerで同定されたVAND QTL遺伝子座。 QTL遺伝子座内に位置するSNPをスプレッドシートにインポートし、原因のSNPを同定した。 SNF r子孫（黄色）、SNF s子孫（緑色）、SNF r SNP（赤色）（ データファイル3参照）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig4.jpg" /> 図4：CRISPR / Cas9を用いたSNF r遺伝子としてのSNR1の確認。 （ A ）CRISPR / Cas9は、 SNR1遺伝子座におけるindel突然変異（緑色）を誘導した。 （ B ）2つの異なるSNR1特異的CRISPRプラスミド（それぞれC5およびC6）に起因するSNR1の代表的なindels。 RHはWT株であり、C5およびC6はSNF r変異体である。 （Bは参考文献s = &quot;xref&quot;&gt; 2）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig5.jpg" /> 図5. CRISPR / Cas9を用いた挿入突然変異誘発。 （ A ）CRISPR / Cas9媒介性部位特異的組込みによって、 SNR1遺伝子座に相補的またはトランスジェニック遺伝子を挿入する。挿入されたDHFR * mini遺伝子の2つの可能な向き、および同定のために使用されるプライマー、F1 / 2およびR1 / 2は、診断PCRにおいて使用されるオリゴのプライミング部位を表す。 （ B ）1つのsnr1 :: DHFR *クローンRHの診断PCRをWT対照として使用する。 GRA1pのPCRは、鋳型としてのゲノムDNAの品質をチェックする対照として含まれる。アスタリスクは、非特異的なバンドを有するレーンを示す（図5Bは参照番号ce 2 ）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig6.jpg" /> 図6： CRISPR / Cas9を用いた遺伝子ノックアウト。 T. gondiiにおけるCRISPR / Cas9媒介相同遺伝子置換の古典的なデザイン。この場合、挿入された導入遺伝子の向きは固定されている。 F1 / R1、F2 / R2およびF3 / R3は、診断用PCRで使用されるオリゴのプライミング部位を表す。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> データファイル1：ME49-FUDR r X VAND-SNF r クロスファイルfR / qtl、 &quot;csv&quot;形式で使用してください。 format = &quot;csv&quot;オプションを指定してR / qtlにロードできる.csvファイル。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_1.csv" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。</a> データファイル2：（chrid txt、genotype txt、markerpos.txt、mname.txt、phenonames.txt、およびphenos.txt）。 ME49-FUDR r X VAND-SNF r R / qtlの &quot;gary&quot;形式で使用するクロスファイル。 6つの.txtファイルで、R / Qtlにformat = &quot;gary&quot;オプションでロードすることができます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_2.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。</a> データファイル3. SNF全体にわたる子孫SNPを含むスプレッドシート r <strong&gt; QTL遺伝子座。子孫SNPを含むワークシート1枚と、親の表現型データと十字架の子孫を含む第2のワークシートが含まれています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_3.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。</a> 補足ファイル1：追加のプロトコルの詳細。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_1_-_101916.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。</a> 補足ファイル2：プロトコール5 - 遺伝的相補またはトランスジェニック株構築のため の SNR1 遺伝子座 における負の選択の利用 。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_2_-_101916.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。</a></a>

Toxoplasma gondiiの薬剤耐性遺伝子を同定するために全ゲノム配列ベースの遺伝地図を用いたQTLマッピングをどのように使用することができるか、そしてこれがどのようにしてゲノム標的を効率的に編集するCRISPR / Cas9システム薬剤耐性遺伝子。

QTLマッピングとCRISPR / Cas9編集による薬剤耐性遺伝子同定<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

この量的形質遺伝子座（QTL）マッピングおよびCRISPR/Cas9ゲノム編集法の全体的な目的は、Toxoplasmaにおけるシネフンギン耐性に関与する遺伝子を同定し、その後に検証することです。これらの手法は、変異体の遺伝的基盤、病原性、薬剤耐性など、寄生虫学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、精密なQTL解析に全ゲノム配列データを利用すること、およびToxoplasmaにおける効率的な遺伝子操作にCRISPR/Cas9ゲノム編集を利用することにあります。本手順の実演は、私の研究室のリサーチアソシエイトであるRobin Powell博士が行います。Toxoplasma gondii寄生虫は、D10培地を用いてT25フラスコに播種した、コンフルエントなヒト包皮線維芽細胞（HFF細胞）で培養します。個々の後代クローンについてシネフンギン耐性を試験するには、寄生虫の大部分が宿主細胞を溶解し始めるまで、各クローンを高密度まで増殖させます。テキストのプロトコルに従って寄生虫溶液を調製した後、ピペッターを使用して、0.3 µMの作業濃度のsinefungin薬を含むD10培地が入った新しいT25 HFF培養フラスコに、2.5 × 10⁵個の寄生虫を移します。寄生虫を37 °C、5% CO2で7〜10日間培養します。倒立位相差顕微鏡でHFF細胞単層を観察し、sinefungin薬における増殖表現型について後代をスコアします。例えば、増殖が見られない場合は0点、単層の増殖および溶解が見られる場合は1点とスコア付けします。すべての後代のスコア付けが完了した後、このデータは定量的形質遺伝子座（QTL）マッピングのためのバイナリ表現型として使用されます。原因となる変異を特定するために、後代の全ゲノムシーケンシングリードをsinefungin感受性van系統のリファレンスゲノムにアライメントし、SNPをコールして、sinefungin耐性に関連するSNPをQTL遺伝子座から探索します。SNR1がシネフンギン耐性遺伝子であることを確認するため、CRISPR/Cas9誘導によるindel変異を用いて、野生型のシネフンギン感受性背景においてSNR1を不活性化します。SNR1特異的なCRISPRプラスミドを構築するため、UPRT標的CRISPRプラスミドを鋳型として、特異的に設計したプライマーを用いたPCRベースの部位特異的変異導入を行います。目的遺伝子特異的なCRISPRプラスミドを含む変異導入産物を、E.Coli細胞に形質転換します。その後、個々のクローンをピックアップしてLB培地で培養し、抽出したプラスミドをDNAゲル電気泳動により解析してサイズを確認します。続いて、プラスミドの配列を決定し、標的特異的なガイドRNA配列を確認します。標的特異的なCRISPRプラスミドをToxoplasma細胞に導入すると、ガイドRNAがCas9ヌクレアーゼを標的へ誘導し、標的内の特定の遺伝子座においてDNA二本鎖切断を引き起こします。その後、DNA断裂部位がエラーが起きやすい非相同末端結合活性によって修復され、標的遺伝子にインデル変異が導入されます。SNR1特異的CRISPRプラスミドを寄生虫にトランスフェクションさせる2〜3日前に、合流したHFF細胞単層を含むT25フラスコに十分な量の寄生虫を添加し、2〜3日以内にHFF細胞の70%から80%が溶解するようにします。倒立位相差顕微鏡で培養液を観察し、HFF単層の70%から80%が寄生虫によって溶解していることを確認してください。ピペットで緩やかに培地を除去し、5 mLのcytomixバッファーでフラスコ表面から細胞を洗浄します。寄生虫溶液を15 mLのコニカルチューブに移します。22ゲージの鈍針を装着した10 mLシリンジを用いて、寄生虫溶液を2〜3回パスします。HFF細胞および細胞残渣を除去するため、寄生虫溶液を孔径3 µmのメンブレンでろ過し、新しいコニカルチューブに回収します。ろ過した寄生虫を400 ×gで10分間遠心分離してペレット化します。上清を捨て、ペレット化した寄生虫を10 mLのCytomixバッファーで再懸濁します。10 µLのアリコートを分注し、血球計数器を用いて寄生虫濃度を測定します。残りの懸濁液を400 ×gで10分間、遠心分離して再度ペレット化します。上清を除去し、ミックスバッファー内でペレットを再懸濁して、密度を4 × 10⁷ parasites/mLにします。4 mLのギャップキュベットに、250〜300 µLの寄生虫溶液、7.5 µgのCRISPRプラスミド、6 µLのATP、および6 µLのグルタチオンを混ぜ合わせます。T gondiiの形質転換に関する標準的な手順に従い、寄生虫をエレクトロポレーションします。陰性対照として、CRISPRプラスミドが別の部位を標的とする別個のエレクトロポレーションも含めてください。エレクトロポレーション後の寄生虫を、HFF細胞を播種したT25フラスコ内で37 °Cで2日間培養します。誘導変異の検討手順を開始するために、まず、フラスコ内の培地を0.3 µMのsinefunginを含む5 mLのD10に交換します。耐性プールが安定するまで、少なくとも3代の継代にわたり寄生虫と選択培地を維持します。陰性コントロール群では寄生虫の増殖が見られず、実験群では旺盛な増殖が見られたことから、これが示しています。sinefungin耐性プールをサブクローニングし、コロニー形成ストランドを得ます。 newly egressした寄生虫を回収し、3 µmメンブレンフィルターで精製した後、150 µLのD10培地でHFF細胞をコンフルエントに播種した96ウェルプレートにサブクローニングします。サブクローニング培養液を、プレートを動かさずにCO2インキュベーター内にて37 degree celsiusで7〜10日間培養します。7〜10日後、倒立相差顕微鏡下で96ウェルプレートを確認します。プラークが1つだけ含まれるウェルを探し、そのようなウェルに印を付けます。各ウェルから細胞を、HFF細胞を播種した24ウェルプレートに転移させます。37 °Cでインキュベートします。寄生虫が単層を溶解し始めたら、株を維持するために寄生虫溶液を50 µL新しいウェルに移し、残りをゲノムDNA抽出用に回収します。残りの寄生虫溶液を1000 ×gで10分間遠心分離します。遠心分離した寄生虫をPBSで洗浄し、再度遠心分離します。市販のキットまたは煮沸法を用いて、遠心分離した細胞からゲノムDNAを抽出し、寄生虫を50から100 µLのPBSに再懸濁します。最後に、テキストプロトコルに従ってPCRを行い、シーケンシング用のSNR1遺伝子の断片を取得します。親株であるFUDR耐性ME49株およびシネフンギン耐性van株を用いた交配由来の子孫について、HFF単層の増殖および溶解により示される薬剤シネフンギンへの耐性を評価しました。QTLスキャンにより、第9染色体上の約1 MBPにわたる1つの有意なピークが検出されました。原因変異はこの領域に位置しています。全ゲノム解析により、この変異が特定されました。QTL遺伝子座内の後代のSNPをスプレッドシートに取り込み、黄色で示されたsinefungin耐性後代にSNPが存在し、緑色で示されたsinefungin感受性後代には存在しないというパターンを検索しました。赤色で示された1つのSNPのみがこのパターンに一致し、SNR1と名付けられた推定アミノ酸輸送体遺伝子において、早期終止コドンをもたらしていました。SNR1を標的とするCRISPR-Cas9プラスミドをシネフンギン感受性の野生型寄生虫株にエレクトロポレーションし、シネフンギン存在下で培養したところ、耐性変異株が得られました。対照的に、他の部位を標的としたCRISPRプラスミドでは、シネフンギン耐性寄生虫は得られませんでした。いくつかのシネフンギン耐性CRISPR変異体がクローニングされ、SNR1ガイドRNA標的周辺の領域が配列決定されました。RH野生株およびC5、C6シネフンギン耐性変異体の代表的な結果は、各変異体にSNR1遺伝子のコーディング領域を破壊するインデルが存在することを示しています。Toxoplasma gondiiはヒトへの感染性があるため、取り扱いには危険が伴うことに十分注意してください。本手順においては、寄生虫に接触する可能性のある鋭利な器具の適切な取り扱いなど、十分な注意を払ってください。本手順に続き、遺伝的相補性の検証やトランスジェニック寄生虫の作製といったさらなる疑問を解消するために、CRISPR/Cas9を介した部位特異的な外来遺伝子挿入などの他の手法を行うことができます。この技術の開発により、分子寄生虫学分野の研究者がToxoplasma gondiiの複雑な生物学的特性や病原性メカニズムを探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、ゲノムシーケンシングデータを用いたQTL解析の実施方法について、十分な理解を得ることができます。また、CRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたToxoplasma gondiiの遺伝学的メタボレーションについても習得いただけます。

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