の調製と評価 ^{99メートル} Tc標識三座キレートバイオ直交化学反応を用いて事前ターゲティングするため

この手順の全体的な目標は、トランスシクロオクテン修飾生体分子を標的ベクターとして生体直交化学を使用して、プレターゲティングイメージング用のテクネチウム-99m標識テトラジンを作製することです。この方法は、新規放射性医薬品の開発に重要な新しいプラットフォームを提供します。プレターゲティングにより、ここで説明するテクネチウム複合体は、さまざまな臓器、組織、バイオマーカーのイメージングに使用できます。

この技術は、診断医学で最も広く使用されている医療用同位体であるテクネチウム-99mで放射線標識されたテトラジンを作製するための堅牢なステップバイステップの方法を提供するため、有利です。この手法は、低分子や抗体など、さまざまなターゲティングベクターで使用できます。また、テクネチウムをベータ発光同位体のレニウムと交換することで、放射線治療にも使用できます。

動物実験の手順の一部を実演するのは、当研究室の生物学技術者であるナンシー・ジャンゼンです。ラジオ標識手順を開始するには、マイクロ波バイアルに、8ミリグラムのボラノカボン酸カリウム、15ミリグラムの炭酸ナトリウム、20ミリグラムの四ホウ酸ナトリウム十水和物、および25ミリグラムの酒石酸ナトリウム四水和物カリウムを組み合わせます。バイアルをアルゴンガスで10分間パージします。

次に、バイアルに1,110メガベクレルの活性を持つ0.9%生理食塩水中のテクネチウム-99mペルテクネートの4ミリリットルを追加します。反応混合物をマイクロ波反応器に装填し、10秒間撹拌します。次に、混合物を摂氏110度で3.5分間加熱して、トリアクアトリカルボニルテクネチウム-99mカチオンを得ます。

約400マイクロリットルの1モル塩酸を加えて、溶液のpHを3.5〜4に調整します。次に、各テトラジン配位子について、2ミリグラムの配位子を250マイクロリットルのメタノールに溶解します。250マイクロリットルのテクネチウム-99m複合体を74メガベクレルの活性で各配位子溶液に加えます。

マイクロ波反応器で摂氏60度の混合気を20分間加熱します。t-ブチル保護基を有するテトラジン配位子の場合、溶液をマイクロ波バイアルから20ミリリットルのシンチレーションバイアルに移し、溶媒を蒸発させ、各複合体をジクロロメタンとトリフルオロ酢酸の1対1の容量溶液の1ミリリットルに再溶解します。次に、溶液をマイクロ波バイアルに移し、これらの複合体をマイクロ波反応器で摂氏60〜10分間加熱して、リガンドの保護を解除します。

複合体を室温まで冷却し、溶媒を蒸発させます。HPLC精製に進む前に、アセトニトリルまたはメタノールと水の1対1の水溶液500マイクロリットルに残留物を再溶解します。C18逆相HPLCを使用して、溶離液中に0.1%トリフルオロ酢酸が存在する状態で、アセトニトリルから水への溶出勾配が30〜70〜40〜60の各放射性標識テトラジン複合体を20分間にわたって精製します。

ガンマトレースに隠れているのが明らかな場合は、精製された製品を収集します。次に、各標識複合体を、対応するラジウム-テトラジン錯体の0.125ミリグラムの溶液を水中の20%メタノールに同時注入します。UVトレースのレニウムコンプレックスピークとガンマトレースのテクネチウムコンプレックスピークの保持時間を比較して、ガンマピークの同一性を確認します。

精製した各テクネチウム-テトラジン複合体から溶媒を除去します。0.5%ウシ血清アルブミンおよび0.01%ポリソルベート80を含むリン酸緩衝生理食塩水中で、各複合体をマイクロリットルあたり7.4キロベクレルの濃度に配合します。各マウス被験者について、生理食塩水中のTCOPB誘導体の1マイクロリットルあたり5マイクログラムの溶液を注射器に100マイクロリットル引き込み、1キログラムあたり20ミリグラムの用量を調製します。

30ゲージの針を投与シリンジに接続します。マウスの被写体を身体拘束装置に置きます。尾の端から約2センチメートルの尾の側面にある静脈を特定し、アルコール綿棒でその領域を拭きます。

シリンジ針を静脈に平行な浅い角度で挿入します。TCOBP誘導体をゆっくりと注入します。針を取り外し、出血が止まるまで注射部位にわずかな圧力で清潔なガーゼスポンジを塗ります。

TCOBP誘導体を注射してから1時間後に、尾静脈注射により、約0.74メガベクレルの活性を持つ所望のテクネチウム-99mテトラジン複合体を100マイクロリットル投与します。用量キャリブレーターを使用して、注射時のテクネチウム複合体の100マイクロリットルの試験サンプルの活性を測定します。テストサンプルは、後で測定するために保存しておきましょう。

注射の6時間後に、3%イソフルランと2%酸素ガスの混合物でマウスを麻酔します。マウスを仰向けにして、鼻をノーズコーンに入れて麻酔を続け、剣状突起を見つけます。25ゲージの針をヘパリンで前処理した注射器に接続します。

剣状突起の下に20度の角度で針を正中線の少し左に挿入します。針が完全に挿入されたら、プランジャーをゆっくりと引き出して針ハブ内の血液をチェックし、心臓の穿刺が成功したことを確認します。必要に応じて針を再調整します。

心臓に穴が開いたら、1ミリリットルの血液をゆっくりと注射器に引き込みます。血液サンプルを事前に計量した計数チューブに移します。麻酔下でマウスを頸部脱臼によって安楽死させます。

安楽死させた動物をビニール袋に入れ、線量校正器で全身の活動を測定します。次に、膝と肩の骨、胆嚢、腎臓、肝臓、甲状腺と気管、尾を採取します。それらの内容物と一緒に、胃、小腸、大腸と盲腸、そして膀胱を集めます。

胆汁と膀胱を除くすべての収集組織から血液をリン酸緩衝生理食塩水で洗い流します。.組織をブロット乾燥させ、各組織を事前に計量した計数チューブに入れます。死体の残留活性を測定します。

各組織サンプルを秤量し、組織のみの質量を計算します。マルチ検出器ガンマカウンターを使用して、テクネチウム錯体試験サンプルの5マイクロリットルアリコートの活性を測定します。得られた値(1分あたりのカウント数)と注入時に測定された活性を使用して、変換係数を計算します。

ガンマ検出器で各組織と液体サンプルの活性を測定します。値をマイクロキュリーに変換し、各値を臓器の重量で正規化して、組織のグラムあたりに注入される割合を決定します。このプロセスを、ネガティブコントロールシリーズとしてTCOPB誘導体を注入せずに追加のマウスで繰り返します。

この方法を使用して、リンカーとキーリーダーの組み合わせが異なる5つのテトラジン錯体をテクネチウム-99mで標識しました。骨のカルシウム代謝回転率が高い領域に局在するTCOPB誘導体を、マウスの肩関節と膝関節のプレターゲティングに使用しました。骨と血液の組織グラムあたりの注入量の割合は、各テトラジン化合物について計算されました。

5つの化合物はすべて血液を迅速に澄まし、骨を標的とし、テトラジン化合物とTCOBP誘導体との間の選択的な生体直交結合反応がin vivoで起こったことを示しています。化合物3は、ターゲティングと血液からのクリアランスの最良の組み合わせを示しました。ネガティブコントロール実験では、放射線標識されたテトラジン複合体は、TCOBP誘導体がない場合、骨に有意に局在しないことが示されました。

例えば、TCOBP誘導体を投与しなかった場合、化合物2は胆嚢と腸で高濃度でしたが、骨ではほとんど見られませんでした。試験した5つの化合物のうち、TCOBP誘導体を投与されたマウスの組織局在には大きなばらつきが観察されました。例えば、化合物3は、他の複合体と比較して、大腸、肝臓、尿、膀胱ではほとんど見られませんでしたが、骨では化合物3がはるかに多く見られました。

ここで説明するラベリング手法を習得すると、正しく実行すれば、最初から最後まで2時間未満で実行できます。この手法を試す際には、テクネチウム溶液に添加する前に、すべての試薬が正確に秤量され、塩がアルゴンでパージされていることを確認することが重要です。また、テトラジン配位子を添加する前に、テクネチウム溶液のpHを3.5〜4に調整することも重要です。

このビデオを見れば、テクネチウム標識テトラジンの調製方法と精製方法、およびプレターゲティングと生体直交化学を使用して新しい放射性医薬品を作製するためにそれらをどのように使用できるかについて、十分に理解できるはずです。放射能を扱う際には、放出される放射線の種類や、サンプルの最適な遮蔽方法と取り扱い方法を理解するなど、適切な予防措置を講じることを忘れないでください。