Name: Bリンパ芽球様細胞株の樹立のためのシンプルな赤血球溶解法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学ぶ、少量血液でBリンパ芽球様細胞株を効率的に樹立する赤血球溶解法。EBVを用いたB細胞の不死化プロセスを簡略化し、研究時間を大幅に短縮する革新的な手法です。

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この作業は、中国科学院（KFZD-SW-205）の主要なプロジェクト、中国科学院の戦略的生物資源技術支援システム（CZBZX-1）によって支援されました。

本研究では、遺伝学と発生生物学研究所の倫理委員会によって承認され、プロトコルが人間の福祉のための機関のガイドラインに従います。 EBウイルスの調製<ol><li> 1日目に、6 mLのB95-8細胞培養を解凍完全RPMI 1640培地、10％ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、および抗生物質（100μg/ mLのストレプトマイシン、100 U / mLペニシリン）を補充しT25培養フラスコ。 37℃、5％CO 2インキュベーター内で培養フラスコを置きます。 </li><li> 2日目に、顕微鏡下で細胞形態を観察します。彼らは明るいとラウンドしているときに細胞が良好な状態です。 10 mLの完全RPMI 1640培地を追加します。 </li><li> 4日目に、10 mLの新鮮な完全RPMI 1640培地を追加し、T75培養フラスコに移します。 </li><li> 8日目に、20 mLの完全RPMI 1640培地を追加します。 </li><li>新鮮な培地、 すなわち 、飢餓を追加せずに8日間細胞を維持します。 </li><li> 16日目に、細胞を観察します顕微鏡下で観察しました。 15 mL遠心チューブ内の細胞を回収し、12ミリリットル/チューブ。 </li><li> 1時間-80℃で凍結保存し、その後急速に37℃で解凍。ウイルス粒子が細胞から放出されるまで3回繰り返します。 </li><li>室温で10分間、240×gで遠心分離します。 </li><li> -80℃で0.22μmのフィルター、分量、12ミリリットル/チューブ、およびストアを介して上清をフィルタリングします。 </li></ol>赤血球溶解バッファーで全血の2治療<ol><li> 15 mLチューブにEDTA・K 2によって抗凝固処理された0.5 mLの全血を追加します。 </li><li>全血に（使用前に0.22μmのフィルターで濾過し、室温に解凍）1 mLの赤血球溶解緩衝液を入れ、よく混ぜます。 4分間、室温で混合物を配置します。停止反応に迅速に7 mLの1×PBS - 次に5を追加します。 </li><li>室温で5分間、240×gで遠心分離します。白血球は、チューブの底に沈殿します。 </li><li>上清を捨て、そして7mLの1640塩基性媒体を追加することによって、沈殿を洗います。室温で240×gで5分間遠心します。二回繰り返します。 </li><li> （20％ウシ胎児血清および10μg/ mLのフィトヘムアグルチニン（PHA）を含有するRPMI 1640培地）300μL変換培地中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li></ol> 3. EBV感染<ol><li>細胞懸濁液に20μgの/ mLのシクロスポリンA（CSA）の60μLを追加します。 </li><li>急速に37℃でEBVのアリコートを解凍。細胞懸濁液に240μLEBVを追加します。 </li><li>よく混合し、96ウェルプレートに細胞懸濁液を置き、ウェルあたり200μL。蒸発を避けるために、96ウェルプレートの周りにあらゆるに200μLの1×PBSを追加します。 37℃で5％CO 2インキュベーターでプレートを置きます。 </li></ol> B-LCLを4.拡大と凍結保存<ol><li> EBV感染後の最初の月に週1回培地の半分を変更します。唯一の厚いレー細胞断片のrは7日目（ 図2）で、顕微鏡下で可視です。 EBV感染の1ヶ月後、リンパ芽球様細胞クラスターは、顕微鏡下で細胞断片の厚い層（ 図2）の下に表示されます。 </li><li>細胞クラスターは、顕微鏡（ 図2）の下にはっきりと見えるようになるまで、3日毎に培地の半分を変更します。典型的には、このプロセスは、10〜20日を要します。 </li><li>混合した後、細胞をピペットし、24ウェルプレートに移します。それが黄色に変わりつつ完全RPMI 1640で培養液の量を倍増。このプロセスは、細胞増殖の速度に依存します。 </li><li>続いて、T25培養フラスコに細胞を移します。 15 mLの - 媒体の体積が10に展開するまで、それが黄色に変わりとして、培地の量を2倍になります。 </li><li>凍結前媒体24時間を変更します。 240×gで5分間遠心細胞懸濁液。細胞カウンターで細胞をカウントし、5の密度で凍結- FRで10×10 6 / mLの90％のFBS、10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含むozenストック溶液。 -80℃まで毎分1℃の速度で凍結した後、液体窒素に直接転送します。 </li></ol> 5. 3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイ17 <ol><li> 10％ウシ胎児血清を含む1640培地でB-LCLを単一細胞懸濁液を調製します。シード3×10 96ウェルプレート上にウェルあたり4細胞、ウェルあたり100μL。 </li><li> 16時間- 12、37℃で5％CO 2インキュベーターでプレートを置きます。 </li><li>細胞が成長しているウェルにMTT（5 mg / mlで）を追加し、37℃で4時間光から遠ざけます。 </li><li> 168×gで10分間遠心分離セルプレート。 </li><li>上清を除去し、ウェルあたり100μLのDMSOを追加します。 注：注意してください。針状の染料結晶を触れないでください。 </li><li>完全に結晶を溶解するために、低速で10分間プレートを振ります。 </li><li>により570 nmで測定吸収マイクロプレート分光光度計を使用して。 </li></ol>

<ol><li>Mohyuddin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instability+in+EBV-transformed+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines.</a> Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).</li>
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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

我々は、赤血球を溶解することによって、全血からのヒトB細胞を不死化するための新規な方法の開発を報告し、そして確立されたB-LCLを、その細胞生存率をMTTアッセイにより評価しました。結果は、赤血球溶解法により確立B-LCLをの細胞生存率は、密度勾配分離法よりもはるかに高いことが示されました。赤血球溶解法の主な利点は、簡単であり、高い成功率と高い細胞生存率と永久細胞株を確立するための血液（0.5mLのわずかなど）少量を必要とすることです。 一つだけの単純な溶解工程は、EBV感染の前に必要とされています。リンパ球の前精製することなく、細胞の喪失および細胞の損傷が回避されます。密度勾配分離法の別の障害は、溶血です。 WH、不適切な温度での長期保存後の血液を処理し、輸送中の揺れは、溶血につながる可能性がありICH大幅リンパ球の分離に影響を与えます。他の研究は、赤血球（RBC）溶解の使用は、18およびリンパ球のサブタイプは、実質的に19の影響を受けなかった密度勾配分離法を使用するよりも、生存PBMCの高い数をもたらしたことを示しました。費用がかかり...

休息B細胞は、エプスタイン・バーウイルス(EBV)によってin vitroで活発に増殖するBリンパ芽球様細胞株(B-LCL)に形質転換される可能性があります。B-LCLは分化と発生において生殖細胞と類似しており、B-LCLの体細胞突然変異率はわずか0.3%1であり、遺伝的および表現型の変化はごくわずかでした。したがって、B-LCLは、末梢血単核細胞(PBMC)の代用として、EBV関連疾患のゲノミクス、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクス研究の進歩を大幅に加速させました2,3。さらに、B-LCLはモノクローナル抗体のスクリーニングにも重要な用途があります4,5。
EBVによるBリンパ球の不死化のために、いくつかの方法が開発されてきました。最も一般的な手順には、Bリンパ球の単離と、感染性EBVを産生するためのB95-8細胞株の使用が含まれます。分離から変換まで、これらの方法は3つの戦略に分けられます。リンパ球は、密度勾配遠心分離法と直接EBV形質転換によって新鮮血液から分離されます6-8、この研究では密度勾配分離法と呼ばれます。しかし、他の技術は新鮮な血液を輸送することの困難さを克服し、精製リンパ球を凍結し、その後の融解とEBV感染9-11のための手順を使用します。凍結保存された全血は、Bリンパ球の単離および形質転換にも使用できる12,13。Bリンパ球を分離するための密度勾配遠心分離に加えて、一部の研究者は磁気セルソーターを使用してBリンパ球を選択する12。しかし、磁気分離は高価で複雑で時間のかかるプロセスです。これらの方法は、Bリンパ球を高い成功率で不死化するのに役立ちますが、多数の臨床サンプルを治療する必要があり、血液の量が比較的少ないため、永久細胞株を確立するためのより簡単な方法が必要です。
あまり使用されていない方法は、EBV感染とB-LCLの確立のための有核細胞の供給源として全血を使用することです。これらの方法は、分離手順を省略することにより、技術を簡素化します。細胞株を得るには、新鮮14または凍結15,16のいずれかの少量の全血だけで十分である。残念ながら、ドキュメント15、16、およびいくつかの検証テストからの成功には大きなばらつきがあります。さらに、形質転換されたコロニーは、大きな汚染不純物のために顕微鏡ではほとんど認識されません。したがって、より信頼性の高い変換方法が必要です。
上記の考察に基づいて、我々はリンパ球の精製を経ずにB-LCLを確立する新しい方法、すなわち赤血球溶解法を開発しました。この方法は便利で、時間を節約し、多数のサンプルに適用できます。わずか0.5mLの全血で、乳幼児や高齢者が健康を著しく損なうことなく簡単に入手できるB-LCLを得るのに十分でした。

<table><tbody><tr><td>Centrifuge</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td>Centrifugation</td></tr><tr><td>Automated Cell Counter&nbsp;</td><td>カウンティスター</td><td>&nbsp;IC 1000&nbsp;</td><td>セルカウント用&nbsp;</td></tr><tr><td>エポック マイクロプレート 分光光度計</td><td>BioTek 機器</td><td></td><td>SN263839 吸光度を測定するため</td></tr><tr><td>96 ウェル 細胞培養クラスター</td><td>コーニング</td><td>3599</td><td>ポリスチレンプレート</td></tr><tr><td>24 ウェル細胞培養クラスター</td><td>コーニング</td><td>3524</td><td>ポリスチレンプレート</td></tr><tr><td>25 cm2 細胞培養フラスコ</td><td>ネスト</td><td>707001</td><td>ポリスチレン&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>B-LCLs中程度のコンポーネント</td></tr><tr><td>RPMI中 1640</td><td>Gibco</td><td>31800-022</td><td>B-LCLs中程度</td></tr>L<tr><td>-グルタミン用&nbsp;&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0374</td><td>B-LCLs中</td></tr><tr><td>100倍ストレプトマイシンペニシリン溶液BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>B-LCLs中速</td></tr><tr><td>Ficoll paqueプラス</td><td>GEの成分&nbsp;ヘルスケア</td><td>17-1440-03</td><td>リンパ球のin vitro単離用</td></tr><tr><td>PHA-M</td><td>Sigma</td><td>L8902</td><td>リンパ球の増殖を刺激するため</td></tr><tr><td>シクロスポリンA</td><td>ケイマン&nbsp;化学</td><td>12088</td><td>T細胞の細胞毒性効果を阻害するため</td></tr><tr><td>赤血球溶解バッファー</td><td>Tiangen</td><td>RT122-01</td><td>赤血球の溶解用</td></tr><tr><td>MTT</td><td>Amresco</td><td>0793</td><td>細胞生存率の検出用</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>細胞の凍結用</td></tr></tbody></table>

bリンパ芽球様細胞株の樹立のためのシンプルな赤血球溶解法

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

エプスタインバーウイルスによるBリンパ球をin vitroで不死化細胞株に変換するための多くの方法が存在します。私たちは、B-LCLsの確立のための強力でシンプルな戦略を持つ新しい方法、赤血球溶解法を開発しました。この方法は、赤血球の除去を伴うPBMC分離手順を簡素化し、わずか0.5 mLの全血を使用してEBV不死化細胞株を確立することで、比較的短時間で大きな細胞数に増殖し、100%の成功率を達成しました。この方法は、シンプルで信頼性が高く、時間を節約し、多数の臨床サンプルの治療に適用できます。

変換プロセスの間、細胞の形態学的変化は、光学顕微鏡（ 図2）によって可視化されます。細胞の小さなクラスターは、細胞断片のみ厚い層が、感染の7日後に密度勾配分離法ではっきり見えた赤血球溶解法から見えます。しかし、リンパ芽球様細胞クラスターは30日、感染後細胞断片の厚い層の下に表示されます。より頻繁な培地交換して、細胞破片を減少し、細胞クラスターは明確に視認され、密度勾配分離法によって確立された同じ画像を提示します。 細胞株は正常に確立されたときに、MTTアッセイは、B-LCLをの生存率を評価しました。文献17によれば、異なる方法によって確立されたB-LCLを、細胞の生存率および16を検出するために選択しました。40培地をブランク対照として使用しました。データは、赤血球の溶解法で確立B-LCLをの細胞生存率は、密度勾配分離法（ 図3）からB-LCLをの細胞生存率よりも...

B-LCLを確立するための単純な赤血球溶解方法は、少量の血液を必要とし、凍結保存し、開始からの時間を節約し、高い不死化効率で開発されました。

Bリンパ芽球様細胞株の樹立のためのシンプルな赤血球溶解法

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

この簡便な手法の全体的な目的は、少量の血液のみを用いて、導入から凍結保存までの時間を短縮し、高い不死化効率でBリンパ芽球様細胞株（B-LCL）を樹立することです。これは、赤血球を溶血させることで全血からヒトB細胞を不死化させる新しい手法です。B-LCLは、さまざまな研究を実施するための貴重なバイオ材料の供給源となります。本手法の主な利点は、わずか0.5 mLの血液で、不死化効率と高い細胞生存率を備えたB-LCLsを得られることです。Epstein-Barr virus（EBV）によるBリンパ球の形質転換を用いてB-LCLsを樹立する場合、Ficoll密度勾配遠心法によって末梢血単核細胞（PBMC）を単離する手法が広く用いられています。しかし、サンプル量が1 mL未満である場合、赤血球溶解後の回収に失敗します。密度勾配分離法を用いて、少量の全血からPBMCを単離することは困難であるという点から、本手法の着想を得ました。EBVを調製するために、1日目にB95-8細胞を融解し、10% FBS、2 mM L-glutamine、および抗生物質を添加した完全RPMI 1640培地 6 mLを用いてT25培養フラスコで培養します。培養液を37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。2日目に、顕微鏡下で細胞形態を観察します。細胞が明るく円形であれば、状態は良好です。培養液に完全RPMI 1640培地を10 milliliters添加します。4日目に、新鮮な培地を10 milliliters加え、細胞をT75培養フラスコに移します。その後、8日目に培地をさらに20 milliliters加え、新鮮な培地を追加せずに8日間細胞を維持します。16日目に、顕微鏡下で細胞を確認します。その後、12 mLの細胞を15 mL遠心チューブに回収します。次に、細胞を-80 °Cで1時間凍結保存し、37 °Cで急速解凍します。ウイルス粒子が細胞から放出されるまで、この凍結解凍サイクルをさらに3回繰り返します。培養物を室温で240 ×gで10分間遠心分離します。次に、上清を0.22 µmフィルターでろ過します。ろ液を1本あたり12 mLずつ分注し、チューブを-80 °Cで保存します。50 mLチューブに、EDTA K2で抗凝固処理した全血0.5 mLを加えます。全血に赤血球溶血バッファー1 mLを加え、十分に混合します。この混合液を室温で4分間インキュベートします。その後、速やかに1x PBSを5〜7 mL加え、溶血反応を停止させます。血液に赤血球溶解バッファーを加えた後、十分に混ぜ合わせてください。転倒混和を行うことで、反応を適時に停止させることができます。次に、チューブを室温で240 ×g、5分間遠心分離します。白血球がチューブの底に沈殿します。上清を除去し、1640 Basic Mediumを7 mL加えて沈殿物を洗浄します。その後、溶液を遠心分離し、洗浄操作を繰り返します。300 µLの形質転換培地を用いて、細胞ペレットを再懸濁します。次に、EBV感染を行うため、20 µg/mLのCyclosporin Aを60 µL、細胞懸濁液に加えます。EBVのアリコートを37 °Cで急速解凍し、ウイルス液240 µLを細胞に添加します。懸濁液を十分に混合し、96ウェルプレートの各ウェルに200 µLずつ分注します。その後、プレートを37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。EBV感染後の最初の1か月間は、1週間に1回、細胞培養液の半分を交換してください。7日目には、顕微鏡下で細胞断片の厚い層のみが観察されます。感染から1か月後になると、細胞断片の厚い層の下にリンパ芽球様細胞のクラスターが観察されます。この時点から、細胞クラスターが顕微鏡で明確に確認できるまで、3日ごとに培地の半分を交換してください。細胞を再懸濁した後、懸濁液を24ウェルプレートの各ウェルに分注します。その後、細胞の増殖速度に応じて、培地が黄色に変化した時点で、完全RPMI 1640培地の量を2倍に増やします。リンパ芽球のクラスターが肉眼で確認できたら、培養物をT25培養フラスコに移します。培地が黄色くなった時点で、培地量を10〜15 mLになるまで2倍ずつに増やします。凍結させる24時間前に培地を交換してください。その後、細胞を凍結させるため、細胞懸濁液を遠心分離し、細胞計数器を用いて細胞数をカウントします。90%FBSおよび10%DMSOを含む凍結保存液を用いて、細胞懸濁液の密度を5〜10 × 10⁶ cells/mLに調整します。その後、懸濁液を1分間に1°Cの速度で-80°Cまで凍結させ、凍結した細胞を直接液体窒素に移します。形質転換の過程において、細胞の形態変化を光学顕微鏡で観察することができます。感染から7日後、密度勾配分離法を用いた場合は細胞の小さなクラスターが明確に観察されますが、赤血球溶血法を用いた場合は細胞断片の厚い層のみが観察されます。感染から30日後には、細胞断片の厚い層の下にリンパ芽球様の細胞クラスターが観察されます。培地交換の頻度を上げると、細胞デブリが減少し、細胞クラスターが明確に観察されるようになり、密度勾配分離法で確立された培養と同様の外見を呈します。最後に、MTTアッセイを用いてB-LCLの生存率を評価しました。ここに示す結果は、赤血球溶血法を用いて培養したB-LCLが、密度勾配分離法を用いて構築した培養よりも有意に生存率が高かったことを示しています。習得すれば、EBVウイルスによる形質転換プロセスは、適切に行うことで30分で完了させることができます。このビデオを視聴することで、リンパ球の事前精製を必要としない、簡便で時間の節約になる赤血球溶血法を用いたB-LCLの樹立方法について十分に理解することができます。この手法の開発により、EBV関連疾患のゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクスの研究、およびモノクローナル抗体の作製への応用が加速しました。EBVなどのヒト病原体を扱うことは非常に危険である可能性があるため、この手順を行う際は常に十分な予防策を講じてください。

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Research

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学ぶ、少量血液でBリンパ芽球様細胞株を効率的に樹立する赤血球溶解法。EBVを用いたB細胞の不死化プロセスを簡略化し、研究時間を大幅に短縮する革新的な手法です。

Bリンパ芽球様細胞株の樹立のためのシンプルな赤血球溶解法

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