Bリンパ芽球様細胞株の樹立のためのシンプルな赤血球溶解法

この簡単な方法の全体的な目標は、少量の血液のみを使用し、開始から凍結保存までの時間を節約することで、高い不死化効率を持つBリンパ芽球様細胞株、またはB-LCLを確立することです。これは、赤血球を溶解することにより、全血からヒトB細胞を不死化する新しい方法です。B-LCLsは、さまざまな研究を実施するための貴重な生体材料源を提供します。

この方法の主な利点は、不死化効率と高い細胞生存率を備えたB-LCLを得るには、わずか0.5ミリリットルの血液で十分であることです。エプスタイン・バーウイルス(EBV)によるBリンパ球の形質転換によるB-LCLの樹立には、広く使用されている方法であるフィコール密度勾配遠心分離法により、別々の末梢血単核細胞またはPBMCに作製します。ただし、サンプルが赤血球溶解液の1ミリリットル未満の場合、添加は失敗します。

この方法を思いついたのは、密度勾配分離法では小さな赤血球からPBMCを分離することが難しいと感じたときでした。EBVを調製するには、1日目にB95-8細胞を解凍し、10%FBS、2ミリモルのL-グルタミン、および抗生物質を添加した6ミリリットルの完全RPMI 1640培地でT25培養フラスコで培養することから始めます。培養物を摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。

2日目は、顕微鏡で細胞の形態を観察します。細胞は明るく丸いとき、良好な状態にあります。10ミリリットルの完全なRPMI 1640 Mediumを培養物に加えます。

4日目に、10ミリリットルの新鮮な培地を加え、細胞をT75培養フラスコに移します。次に、8日目に、さらに20ミリリットルの培地を追加し、新鮮な培地を追加せずに細胞を8日間維持します。16日目に、顕微鏡で細胞を確認します。

次に、12ミリリットルの細胞を15ミリリットルの遠心分離チューブに収集します。次に、細胞をマイナス80°Cで1時間凍結保存し、培養物を37°Cで急速に解凍します。ウイルス粒子が細胞から放出されるまで、凍結融解をさらに3回繰り返します。

培養物を室温で240 gで10分間遠心分離します。次に、0.22ミクロンフィルターで上清をろ過します。チューブあたり12ミリリットルの濾液を分量し、チューブをマイナス80°Cで保管します。

50ミリリットルのチューブに、EDTA K2によって抗凝固された0.5ミリリットルの全血を追加します。.1ミリリットルの赤血球溶解バッファーを全血に加え、よく混ぜます。混合物を室温で4分間インキュベートします。次に、5〜7ミリリットルの1x PBSをすばやく追加して、溶解反応を停止します。

血液に赤血球溶解バッファーを添加した後、よく混ぜてください。反転により、反応がタイムリーに終了することを保証します。次に、チューブを室温で240倍gで5分間遠心分離します。

白血球はチューブの底に沈殿します。上清を捨て、7ミリリットルの1640ベーシックメディウムを追加して沈殿物を洗います。次に、洗浄を繰り返す前に溶液を遠心分離します。

300マイクロリットルの形質転換培地で、細胞ペレットを再懸濁します。次に、EBV感染を行うには、シクロスポリンAの1ミリリットルあたり20マイクログラムの60マイクロリットルを細胞懸濁液に加えます。EBVのアリコートを摂氏37度で急速に解凍し、ウイルスの240マイクロリットルを細胞に加えます。

懸濁液を完全に混合し、ウェルあたり200マイクロリットルを96ウェルプレートに移します。次に、プレートを摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートします。EBV感染後の最初の1ヶ月間は、細胞培養液の半分を週に1回交換します。

7日目には、顕微鏡で見えるのは細胞断片の厚い層だけです。感染から1か月後、リンパ芽球様細胞クラスターは、細胞断片の厚い層の下に見えます。この時点から、細胞クラスターが顕微鏡ではっきりと見えるようになるまで、培地の半分を3日ごとに交換します。

細胞を再懸濁した後、懸濁液を24ウェルプレートのウェルに移します。次に、細胞増殖速度に応じて、培地が黄色に変わったら、完全なRPMI 1640培地の容量を2倍にします。リンパ芽球様細胞クラスターが肉眼で見えるようになったら、培養物をT25培養フラスコに移します。

培地が黄色に変わったら、容量が10〜15ミリリットルに拡大するまで、培地の容量を2倍にします。凍結する前に、24時間前に媒体を変更してください。次に、細胞を凍結するには、細胞懸濁液を遠心分離し、セルカウンターを使用して細胞をカウントします。

90%FBSおよび10%DMSOを含む凍結原液を使用して、懸濁液を1ミリリットルあたり10〜6セルの5〜10倍の密度に調整します。次に、懸濁液を1分あたり摂氏1度から摂氏マイナス80度まで凍結してから、凍結した細胞を直接液体窒素に移します。形質転換の過程で、細胞の形態学的変化は光学顕微鏡で見ることができます。

感染から7日後、密度勾配分離法では細胞の小さなクラスターがはっきりと見えますが、赤血球溶解法では細胞断片の厚い層のみが見えます。感染から30日後、リンパ芽球様細胞クラスターが細胞断片の厚い層の下に見えます。培地交換の頻度が高くなると、細胞の破片が減少し、細胞クラスターがはっきりと見え、密度勾配分離によって確立された培養物と似ています。

最後に、MTTアッセイを使用してB-LCLの生存率を評価しました。ここに示す結果は、赤血球溶解法を使用して培養したB-LCLs細胞が、密度勾配分離法を使用して確立した培養よりも有意に生存率が高かったことを示しています。EBVウイルスの形質転換プロセスを習得すると、適切に実行されれば30分で完了します。

このビデオを見れば、リンパ球を事前に精製することなく、シンプルで時間を節約する赤血球溶解法でB-LCLを確立する方法を十分に理解できるはずです。その開発後、この技術は、EBV関連疾患のゲノミクス、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクス研究の進歩と、単核抗体の産生におけるこの応用の進歩を加速させました。EBVなどのヒト病原体を扱うことは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。